劉寰宇，陳 瑤

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特010110）

·綜述·

附紅細(xì)胞體病動物模型研究進(jìn)展

劉寰宇，陳 瑤

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特010110）

附紅細(xì)胞體病動物感染模型對于附紅細(xì)胞體病發(fā)病機(jī)制的研究、藥物的篩選具有至關(guān)重要的作用．總結(jié)近年來國內(nèi)外附紅細(xì)胞體病動物感染模型的研究，在實(shí)驗(yàn)動物的選擇、動物模型的制作、模型的評價等方面對附紅細(xì)胞體病動物模型的研究情況進(jìn)行綜述，為今后附紅細(xì)胞體病的研究提供依據(jù)．

附紅細(xì)胞體病；動物模型；研究進(jìn)展

0 引言

附紅細(xì)胞體病是由附紅細(xì)胞體附著在紅細(xì)胞表面、血漿及骨髓內(nèi)引起人和動物出現(xiàn)不明原因的發(fā)熱、黃疸、脫發(fā)等癥狀的一種人蓄共患傳染?。?］．在傳播方式、生物學(xué)分類、發(fā)病機(jī)制、藥物篩選、預(yù)防感染等方面存在許多爭議．附紅細(xì)胞體病是條件性致病，具有感染率高，發(fā)病率低的特點(diǎn)［1］，不受臨床醫(yī)生和患者的重視，臨床資料遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于實(shí)驗(yàn)室研究．而關(guān)于實(shí)驗(yàn)室研究方面的報道也相對少，且具有階段性特點(diǎn)，與動物模型相關(guān)的研究尚未成熟，因此建立附紅細(xì)胞體病動物模型對推動附紅細(xì)胞體病的發(fā)病機(jī)制、感染預(yù)防等方面的研究至關(guān)重要．

1 實(shí)驗(yàn)動物的選擇

1．1 豬 豬作為附紅細(xì)胞體病的常見宿主，經(jīng)常被選作動物模型．但是把豬作為實(shí)驗(yàn)動物存在實(shí)驗(yàn)成本高、不易操作、SPF豬仔難以獲得等缺陷．馬增軍等［2］采用附紅細(xì)胞體接種豬后，豬感染附紅體并發(fā)?。?/p>

1．2 綿羊 馬增軍等［2］用豬附紅細(xì)胞體接種羊，成功復(fù)制出羊附紅細(xì)胞體病動物模型．模型動物在潛伏期有精神萎靡、食欲減退等臨床表現(xiàn)，在高峰期有結(jié)膜蒼白、黃染等臨床表現(xiàn)．

1．3 兔子 家兔對致病菌敏感，是寄生蟲病、人獸共患病常用的實(shí)驗(yàn)動物，且家兔對體溫變化十分敏感，利用家兔更容易觀察附紅細(xì)胞體病所引起的臨床癥狀［3］．1995年裴標(biāo)等［4］用一例附紅細(xì)胞體陽性的急性溶血性貧血患兒血液經(jīng)耳緣靜脈接種家兔，成功復(fù)制出感染模型．2002年楊自軍等用豬附紅細(xì)胞體通過耳源注射感染家兔，感染3 d后，家兔表現(xiàn)出精神欠佳、食欲減少、全身無力、不愿活動等亞健康狀態(tài)．戴榮四等［5］用奶牛附紅細(xì)胞體感染兔后，兔出現(xiàn)發(fā)熱、貧血、黃疸等典型臨床癥狀．

1．4 豚鼠 豚鼠對多種病原體敏感，常用于病原的分離及診斷．其中FMUN白話豚鼠有獨(dú)特的免疫學(xué)特性，紅細(xì)胞免疫功能比普通花色豚鼠低，對病原體敏感性高于普通花色豚鼠，更適于建立感染性疾病動物模型．顧為望［6］等利用人附紅細(xì)胞體分別感染普通花色豚鼠和FMUN豚鼠，發(fā)現(xiàn)FMUN豚鼠對人附紅細(xì)胞體敏感性高于普通花色豚鼠．

1．5 小鼠 小鼠具有易于管理、控制等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于多種病原體感染和疾病模型的建立［7］．李芬等［8］用反芻獸源附紅細(xì)胞體感染小鼠后，經(jīng)腹腔注射陽性奶牛血液的方式成功建立動物模型．馮會全等［9］用豬附紅體腹腔注射小鼠的方法成功建立了小鼠附紅細(xì)胞體病模型．唐蓮蓮等［3］則認(rèn)為小鼠恒溫機(jī)能差，對發(fā)熱刺激的反映低，不是首選動物．而且小鼠的血量少，進(jìn)一步提高了實(shí)驗(yàn)難度．

1．6 SD大鼠 馮會全等［10］用腹腔注射陽性血液的方式經(jīng)PCR檢測成功建立了SD大鼠模型．

1．7 Wister大鼠 孫英峰等［11］用陽性血液樣品分別經(jīng)腹腔、皮下、肌肉感染 Wister大鼠，并用套式PCR方法進(jìn)行檢測，成功建立了大鼠模型．

1．8 免疫抑制劑的使用 附紅細(xì)胞體病是條件性致病，當(dāng)機(jī)體免疫力正常時，附紅細(xì)胞體病通常表現(xiàn)為隱性感染而不發(fā)病，當(dāng)機(jī)體免疫力下降或協(xié)同其他惡性疾病時則迅速發(fā)病［1］．故多以免疫抑制劑或切脾手術(shù)輔助模型的建立［7］．但是有人認(rèn)為免疫抑制狀態(tài)下建立的模型存在缺陷，對其指標(biāo)進(jìn)行測定和評價時，不能反映自然發(fā)病狀態(tài)．

2 動物模型的制作

2．1 感染源 附紅細(xì)胞體動物模型的構(gòu)建多采用全血或者分離純化的附紅細(xì)胞體作為感染源．其中以全血作為感染源建立附紅細(xì)胞體感染的動物模型存在缺陷，因?yàn)椴捎萌鳛楦腥驹从锌赡軐准?xì)胞等其他血液組成一同注入實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)，感染源不單一，會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果．高娃等［7］采用從自然感染病例中分離純化附紅細(xì)胞體作為感染源構(gòu)建實(shí)驗(yàn)動物模型，附紅細(xì)胞體出現(xiàn)和消失的時間均早于全血組．可在感染3 d后獲得較高的感染率．表明以分離純化的附紅體人工感染更科學(xué)，模型構(gòu)建更標(biāo)準(zhǔn)，可重復(fù)性更好．余飛等［12］也證明了此觀點(diǎn)．

2．2 感染方式 現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)中采用的感染方式有尾靜脈注射、腹腔注射、耳源靜脈注射、滴鼻法、皮下注射、肌肉注射等．其中前三種多用．小鼠多采用尾靜脈接種法或腹腔接種法 ，如高娃等［7］用尾靜脈注射和腹腔接種成功建立小鼠模型．巴彩鳳等［13］采用腹腔注射成功建立小鼠模型；家兔多采用耳靜脈注射感染動物模型，孫英峰分別采用腹腔、皮下及肌肉感染大鼠，均成功建立了大鼠模型．

2．3 感染劑量 抗凝全血0．5 mL／只，分離純化的紅細(xì)胞為100 μL（濃度為：1×107個／μL）．如馮會全［10］、王小飛［14］、周曉敏等［15］分別采用 0．5 mL／只感染小鼠．巴彩鳳等［13］采用每只0．5 mL／d．馮會全等［10］5 mL感染SD大鼠．家兔每只接種10 mL血樣［3］．每只小鼠接種100 μL純化的豬附紅體懸液［10］．

3 模型的評價指標(biāo)

3．1 癥狀觀察 癥狀觀察發(fā)現(xiàn)動物有食欲減退、精神低靡等癥狀，高熱、黃疸等體征時就要懷疑是附紅細(xì)胞體感染．需要進(jìn)一步的輔助檢查明確診斷．目前臨床觀察對該病早期診斷意義不大，只能提供診斷線索．

3．2 顯微鏡檢查

3．2．1 鮮血壓片鏡檢 將采集的血液樣品，加等量生理鹽水稀釋，吸取一滴置于載玻片上，加蓋玻片，置于400倍顯微鏡下觀察．判斷標(biāo)準(zhǔn)為：鏡下觀察10個視野，發(fā)現(xiàn)血液中有卵圓形、球形、啞鈴型、逗點(diǎn)狀和桿狀小體，具有運(yùn)動性、折光性［16］等特點(diǎn)的即為附紅細(xì)胞體．被附著的紅細(xì)胞由于膜張力作用的改變，形狀也發(fā)生了變化，呈菠蘿、星芒或鋸齒等不規(guī)則形狀的紅細(xì)胞即為感染陽性．鏡下觀察紅細(xì)胞分布區(qū)20個視野，若無附紅體且紅細(xì)胞形態(tài)正常 ，即為陰性感染［17］．該法簡便、直觀，但是敏感性差，且存在不科學(xué)的地方，所以這種方法觀察的結(jié)果只能視為疑似病例，不能確診．

3．2．2 血涂片鏡檢 用載玻片制成薄而均勻的涂片．革蘭氏染色呈陰性．姬姆薩染色時附紅細(xì)胞體呈淡紫紅色、橘黃色，中央發(fā)亮，形似空泡，有折光性，其外周有白色光環(huán)，細(xì)胞變型嚴(yán)重，呈現(xiàn)血溶性星芒狀畸形．瑞士染色時游離的紅細(xì)胞體呈藍(lán)紫色，輪廓清晰，紅細(xì)胞呈紫紅色，細(xì)胞邊緣和中間有一至數(shù)個附紅細(xì)胞體，形態(tài)大小不一．當(dāng)在1 000倍油鏡下觀察時，附紅細(xì)胞體輪廓不清，只見3～8個藍(lán)紫色顆粒，顆粒之間有紫紅色基質(zhì)映襯，附紅細(xì)胞體在紅細(xì)胞上像一個個氣泡［18］．此法在一般實(shí)驗(yàn)室均可操作，是目前普遍采用的快速診斷方法．但由于附紅細(xì)胞體感染常出現(xiàn)短時間的菌血癥，在出現(xiàn)臨床癥狀之前往往看不到附紅細(xì)胞體［17］．在混合感染和感染后期，由于附紅細(xì)胞體形態(tài)的改變以及其他病原體與之在形態(tài)和染色性質(zhì)上的相似性，仍不能理想的檢測和鑒定［18］．

3．2．3 掃描電鏡觀察 用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，附紅細(xì)胞體大小不一，形態(tài)多樣，只寄生在紅細(xì)胞表面而不進(jìn)入紅細(xì)胞內(nèi)［18］，無核、無細(xì)胞器，只有單層膜包裹，其中可見顆粒狀物無規(guī)則分布在胞漿內(nèi)［19］．紅細(xì)胞呈鋸齒狀或不規(guī)則的多邊形，局部凹陷，個別膜表面形成洞．但由于附紅細(xì)胞體的形態(tài)多樣，其他病原體的混合感染以及一些血液雜質(zhì)的干擾 ，該方法的檢出率仍然很低．

3．2．4 透射電鏡 附紅細(xì)胞體在透射電鏡為大小不等的以球形小體為主的多形小體，在少數(shù)大型附紅細(xì)胞體上可見到纖毛［19］．

3．3 血清學(xué)檢測 血清學(xué)檢測有間接血凝抑制試驗(yàn)（IHA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫熒光實(shí)驗(yàn)（IFA）等幾種方法．其中間接血凝抑制試驗(yàn)（IHA）方法可檢測出隱性感染階段的動物模型．酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）可用于快速診斷，適合群體診斷．免疫熒光實(shí)驗(yàn)（IFA）檢出率高于普通鏡檢．

3．4 分子生物學(xué)檢測 用豬附紅細(xì)胞體16srRNA基因的三對特異性引物建立的PCR方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高等特點(diǎn)，常用來檢測動物模型．

4 展望

本文把與附紅細(xì)胞體病動物模型相關(guān)的模型動物的選擇、模型制作的方法、模型評價的指標(biāo)進(jìn)行了總結(jié)．發(fā)現(xiàn)關(guān)于附紅細(xì)胞體病動物模型的制作存在動物選擇不理想、制作方法不規(guī)范、檢測指標(biāo)復(fù)雜等問題．因此尋找理想的實(shí)驗(yàn)動物、規(guī)范的制作方法、簡捷的檢測方法成為日后附紅細(xì)胞體病發(fā)病機(jī)制研究、藥物篩選的關(guān)鍵．

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《心血管外科雜志（電子版）》征稿啟事

《心血管外科雜志（電子版）》（ISSN：2095-2260 CN：11-9317／R，季刊）由人民軍醫(yī)出版社主辦，解放軍總醫(yī)院心血管外科（全軍心臟外科研究所）承辦，人民軍醫(yī)電子出版社出版；被萬方數(shù)據(jù)庫、中國核心期刊（遴選）數(shù)據(jù)庫、中國知網(wǎng)資源總庫（CNKI）收錄，以光盤（DVD-ROM）附帶紙質(zhì)導(dǎo)讀的形式同步發(fā)行．

《心血管外科雜志（電子版）》是一本主要報道心血管外科專業(yè)以及相關(guān)領(lǐng)域?qū)W科科研成果的醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)期刊，以心血管外科醫(yī)師、麻醉師、體外循環(huán)師、心血管重癥、放射及超聲醫(yī)師為主要讀者對象．

征稿方向：先心病、瓣膜病、缺血性心臟病、大血管疾病、心律失常、心衰、心臟腫瘤等．內(nèi)容包括疾病的外科治療，體外循環(huán)及心室輔助，麻醉，重癥監(jiān)護(hù)、護(hù)理、實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)診斷的臨床和基礎(chǔ)研究類論文．

欄目設(shè)置：專家筆談、臨床研究、基礎(chǔ)研究、循證醫(yī)學(xué)、綜述、經(jīng)驗(yàn)交流、標(biāo)準(zhǔn)·指南·共識、臨床護(hù)理、醫(yī)學(xué)視頻等

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Research progress on animalmodelof eperythrozoonosis

LIU Huan-Yu，CHEN Yao
Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010110，China

Animal model plays an important role in study of the pathogenesis and drug selection in eperythrozoonosis．The study summarized the researches on the eperythrozoonosis animal model in recent years，and reviewed the selection and establishment of animal model，，aiming lay basis for the further study of eperyth-rozoonosis．

eperythrozoonosis；animal model；study advance-ment

R38

A

2095-6894（2015）05-148-03

2015-04-02；接受日期：2015-04-12

劉寰宇．碩士．

陳 瑤．E-mail：chenyaocy2011＠126．com