鄭林華 韓英

·綜述·

骨髓干細(xì)胞對(duì)終末期肝病治療的臨床研究進(jìn)展

鄭林華 韓英

目前利用骨髓干細(xì)胞（BMSC）治療終末期肝病越來(lái)越受到關(guān)注，且大多數(shù)研究表明BMSC能有效改善患者的肝功能，然而其具體機(jī)制尚不清楚。目前采集BMSC的方法有多種，比如可以采用粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）動(dòng)員BMSC至外周血，然后通過(guò)外周血采集干細(xì)胞，或者直接從骨髓中采集干細(xì)胞。BMSC主要含骨髓造血干細(xì)胞（HSC）和間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC），哪種干細(xì)胞是促進(jìn)肝功能恢復(fù)的主要細(xì)胞目前仍有爭(zhēng)論。因此，本文將從臨床研究總結(jié)BMSC在終末期肝病治療中的研究進(jìn)展。

肝?。?間質(zhì)干細(xì)胞； 骨髓； 粒細(xì)胞集落刺激因子

終末期肝病是由各種慢性肝臟損害所導(dǎo)致的肝臟疾病晚期階段。對(duì)于終末期肝病，內(nèi)科常規(guī)的保肝和對(duì)癥治療并不能延長(zhǎng)患者生存期，原位肝移植是唯一有效的治療手段，但受供肝缺乏、費(fèi)用高昂等因素的嚴(yán)重限制，目前急需尋找其他的治療方法來(lái)治療終末期肝病。近年來(lái)，陸續(xù)有一些研究報(bào)道利用干細(xì)胞可有效改善終末期肝病患者的肝功能［1-2］。而骨髓是成體干細(xì)胞的重要來(lái)源，即骨髓源干細(xì)胞（bone marrow-derived stem cell， BMSC），主要包含造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell， HSC）和間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell， MSC）。本文將回顧相關(guān)研究探討B(tài)MSC在治療終末期肝病中的臨床研究進(jìn)展。

一、臨床研究

1.粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor， G-CSF）動(dòng)員BMSC：研究已經(jīng)證實(shí)，對(duì)于慢性肝病患者，采用G-CSF動(dòng)員BMSC至外周血是安全和可行的。Gaia等［3］研究報(bào)道，8例肝硬化患者接受G-CSF（10 μg/（kg·d），連續(xù)3 d）動(dòng)員BMSC至外周血，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外周血中的CD34+細(xì)胞數(shù)目越多，肝功能恢復(fù)越明顯，且研究并未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)。另外一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照研究報(bào)道，隨機(jī)入組24例酒精性脂肪肝患者，患者接受G-CSF（10 μg/（kg·d），連續(xù)5 d）或安慰劑動(dòng)員BMSC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，G-CSF能增加患者血漿中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，且在7 d內(nèi)能有效誘導(dǎo)肝祖細(xì)胞的增殖，然而患者肝功能卻無(wú)明顯恢復(fù)趨勢(shì)［4］。一項(xiàng)對(duì)照雙盲非隨機(jī)研究中，47例慢加急性肝功能衰竭患者分別接受G-CSF（5 μg/kg，連續(xù)12療程，皮下注射）或安慰劑，與安慰劑組相比，G-CSF明顯提高患者2個(gè)月生存率，降低CTP評(píng)分和MELD評(píng)分，并降低并發(fā)膿毒血癥、肝腎綜合征和肝性腦病的發(fā)生率［5］。

雖然以上研究結(jié)果證明，采用G-CSF治療終末期肝病是有效的，然而這些研究并未觀察長(zhǎng)期療效。且大多數(shù)的研究設(shè)計(jì)為非對(duì)照研究，或者非雙盲及非隨機(jī)研究，病例數(shù)相對(duì)較少，故結(jié)果存在一定的局限性。這些研究中涉及的肝損害病因較多，而哪種病因的終末期肝病患者適合這種方法治療目前尚不清楚。并且其治療終末期肝病的機(jī)制也不完全清楚，肝功能的恢復(fù)是G-CSF對(duì)肝細(xì)胞的直接影響，亦或與外周血BMSC數(shù)量的增加相關(guān)尚需要進(jìn)一步探討。

2.G-CSF動(dòng)員后采集外周血BMSC：Gordon等［6］研究者將5例病毒或酒精相關(guān)肝硬化患者接受G-CSF后，從外周血搜集CD34+干細(xì)胞，將這些干細(xì)胞在體外培養(yǎng)后，通過(guò)患者肝動(dòng)脈進(jìn)行自體干細(xì)胞移植。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外周血干細(xì)胞移植后能明顯降低患者血漿膽紅素、升高白蛋白水平。但他們的研究病例數(shù)較少，且缺乏對(duì)照，隨訪時(shí)間較短（僅2個(gè)月），因此研究結(jié)果存在一定的局限性。另一項(xiàng)研究同樣采用G-CSF動(dòng)員酒精性肝硬化患者BMSC至外周血后采集CD34+干細(xì)胞，將干細(xì)胞在體外培養(yǎng)7 d后通過(guò)患者肝動(dòng)脈進(jìn)行移植。隨訪90 d后，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞移植后能有效提升白蛋白水平，降低CTP評(píng)分，降低腹水的發(fā)生［7］，同樣此研究也沒(méi)有對(duì)照組。Salama等［8］研究選取48例終末期肝病患者（其中36例丙肝相關(guān)肝病，12例自身免疫性肝?。?，給予G-CSF后采集外周血CD34+干細(xì)胞，然后將CD34+干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增、培養(yǎng)，誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞，最后通過(guò)肝動(dòng)脈或門靜脈進(jìn)行回輸。他們將采用傳統(tǒng)方案治療的患者作為對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，干細(xì)胞治療組顯著提高患者的一年生存率。前期本課題組設(shè)計(jì)了隨機(jī)對(duì)照臨床研究，對(duì)僅接受G-CSF動(dòng)員與G-CSF動(dòng)員后采集外周血干細(xì)胞進(jìn)行自體干細(xì)胞移植兩種方法之間的安全性和有效性進(jìn)行了比較。本研究選取40例乙肝相關(guān)失代償期肝硬化隨機(jī)分為2組，一組用G-CSF動(dòng)員患者BMSC至外周血，再分離、采集干細(xì)胞（未進(jìn)行體外培養(yǎng)），經(jīng)肝動(dòng)脈回輸至患者肝臟，另一組僅接受G-CSF。隨訪結(jié)果表明，與G-CSF組相比，自體外周血干細(xì)胞治療組患者肝功能顯著恢復(fù)，主要表現(xiàn)為患者外周血白蛋白、膽堿酯酶、膽固醇和凝血酶原活動(dòng)度等肝臟合成指標(biāo)的明顯改善［9］。到目前為止，已對(duì)近400例乙肝相關(guān)失代償期肝硬化患者進(jìn)行了自體外周血干細(xì)胞移植治療，隨訪時(shí)間為1 ～ 5.5年，回顧性的病例對(duì)照分析顯示，自體外周血干細(xì)胞移植可顯著提高患者的3年生存率和5年生存率。然而最近一項(xiàng)隨機(jī)、對(duì)照、開(kāi)放研究，對(duì)58例酒精性肝硬化失代償期患者進(jìn)行G-CSF動(dòng)員后搜集外周血干細(xì)胞通過(guò)肝動(dòng)脈進(jìn)行移植，與僅接受傳統(tǒng)治療方案的患者相比，兩組患者肝功能均有輕微的改善，并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［10］。

3.骨髓HSC：Terai等［11］研究了9例接受自體骨髓HSC治療的肝硬化患者，在6個(gè)月的隨訪中所有患者未發(fā)生肝細(xì)胞癌，且干細(xì)胞移植后有效的改善了患者白蛋白和總蛋白水平，以及CTP評(píng)分。同樣，Kim等［12］對(duì)10例乙肝相關(guān)失代償期肝硬化患者進(jìn)行自體骨髓HSC移植后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞移植后改善了患者白蛋白水平、CTP評(píng)分、肝臟體積和腹水發(fā)生。通過(guò)肝臟組織切片發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞移植后肝內(nèi)祖細(xì)胞開(kāi)始逐漸活化，在第3個(gè)月時(shí)達(dá)到高峰，提示肝祖細(xì)胞的活化是促進(jìn)肝功能恢復(fù)的主要機(jī)制。然而他們發(fā)現(xiàn)HSC并不能改善肝纖維化，也未發(fā)現(xiàn)肝星形細(xì)胞的活化。以上研究均為非對(duì)照、非雙盲的小樣本研究。Lyra等［13］設(shè)計(jì)了一項(xiàng)對(duì)照非雙盲非隨機(jī)臨床研究，他們將等待接受原位肝移植的30例患者，分為2組：15例接受自體骨髓HSC移植，15例未接受干細(xì)胞移植，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在隨訪第90天，接受HSC移植的患者血漿白蛋白水平和CTP評(píng)分得到明顯的改善。最近一項(xiàng)研究中，選取11例肝癌患者，在其接受門靜脈栓塞術(shù)和右肝葉切除術(shù)之前接受CD133+骨髓細(xì)胞移植術(shù)，評(píng)估干細(xì)胞移植的安全性和有效性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，接受HSC移植后患者在術(shù)后其肝臟再生明顯較快［14-15］。但由于本研究為回顧性、非雙盲、非隨機(jī)研究，因此其結(jié)論需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

4.BMSC：Mohamadnejad等［16］最早報(bào)道應(yīng)用自體BMSC移植治療終末期肝病，直接從骨髓中獲取骨髓單個(gè)核細(xì)胞后，體外誘導(dǎo)成MSC，經(jīng)外周靜脈回輸至患者體內(nèi)，經(jīng)過(guò)12個(gè)月的隨訪，該方法安全且無(wú)不良反應(yīng)發(fā)生，隨訪中發(fā)現(xiàn)患者癥狀明顯改善，血漿白蛋白升高，腹水減少，肝體積增大，MELD評(píng)分降低。近年來(lái)，有研究采用BMSC體外誘導(dǎo)成肝細(xì)胞樣細(xì)胞后進(jìn)行自體回輸治療丙肝相關(guān)的終末期肝病，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者腹水減少，白蛋白水平明顯升高，CTP和MELD評(píng)分降低［17］。國(guó)內(nèi)學(xué)者應(yīng)用自體骨髓MSC治療乙肝相關(guān)肝衰竭患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4周內(nèi)患者白蛋白、凝血酶時(shí)間原活動(dòng)度、總膽紅素及MELD評(píng)分明顯改善，但長(zhǎng)期隨訪療效并不明顯［18］。一項(xiàng)研究對(duì)15例丙肝相關(guān)的肝硬化患者通過(guò)靜脈注射進(jìn)行BMSC移植，結(jié)果表明與對(duì)照組相比MSC移植后能部分促進(jìn)患者肝功能恢復(fù)［19］。另一項(xiàng)研究中，5例乙肝相關(guān)肝硬化患者接受了CD34-CD44+和CD44+CD45-的骨髓源MSC細(xì)胞移植，105例年齡、性別和肝功能生化指標(biāo)相匹配的患者作為對(duì)照，研究結(jié)果表明與對(duì)照組相比，接受干細(xì)胞移植后2 ～ 3周內(nèi)患者的肝功能和MELD評(píng)分明顯改善，而4年生存率和原發(fā)性肝癌的發(fā)生率無(wú)明顯差異［18］。

二、BMSC治療終末期肝病的可能機(jī)制

目前，雖然越來(lái)越多的研究表明自體BMSC能有效地改善終末期肝病患者的肝功能，然而有關(guān)BMSC促進(jìn)肝功能恢復(fù)的機(jī)理尚不清楚。總結(jié)相關(guān)研究，主要分為以下幾種觀點(diǎn)：

1.融合和轉(zhuǎn)分化作用：早期的研究證明，干細(xì)胞可能通過(guò)細(xì)胞融合和轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞發(fā)揮治療肝硬化的作用［20］。以Fah基因作為供體細(xì)胞的追蹤標(biāo)志，將Fah+/+ BMSC移植給肝損傷的Fah-/-小鼠，受體小鼠新生成的肝細(xì)胞同時(shí)表達(dá)供體鼠和受體鼠的基因，提示BMSC可與內(nèi)源性肝細(xì)胞融合并促進(jìn)肝細(xì)胞功能［21］。Malcolm等［22］報(bào)道顯示，成人骨髓源或外周血中的干細(xì)胞可以轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞來(lái)代替損傷的肝細(xì)胞發(fā)揮功能。也有研究表明，BMSC是肝內(nèi)肝細(xì)胞（卵圓細(xì)胞）的來(lái)源細(xì)胞，在大鼠肝損傷模型中，移植的BMSC具有卵圓細(xì)胞的表面標(biāo)志分子（OV-6、甲胎蛋白等），同時(shí)也表達(dá)BMSC的標(biāo)志分子（Thy-1、CD34、c-kit），提示干細(xì)胞可以轉(zhuǎn)分化為肝臟干細(xì)胞，進(jìn)而向肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞等分化［23］。本課題組前期同樣證實(shí)：來(lái)自失代償期肝硬化患者的外周血干細(xì)胞在體外可被誘導(dǎo)而轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞［24］；示蹤移植入裸鼠體內(nèi)的人外周血干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可定植于裸鼠肝臟［25］；CD14+的單個(gè)核細(xì)胞移植可減輕肝硬化大鼠的肝臟纖維化程度、改善其肝功能［26］。

2.旁分泌和免疫調(diào)節(jié)作用：目前越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)BMSC通過(guò)旁分泌的作用支持肝細(xì)胞的功能和肝臟再生。一些研究表明，肝臟損傷后通過(guò)分泌肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、G-CSF等動(dòng)員BMSC向損傷的肝臟轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解及抗炎反應(yīng)，從而維持肝內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定，支持肝細(xì)胞的功能和肝臟再生［27-29］。另外，研究發(fā)現(xiàn)，BMSC通過(guò)分泌細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子激活肝祖細(xì)胞，促進(jìn)成熟肝細(xì)胞的增殖［30-31］。已經(jīng)證實(shí)MSC可以分泌多種細(xì)胞因子，抑制炎細(xì)胞增殖及炎性細(xì)胞因子分泌，調(diào)節(jié)肝臟及全身免疫炎癥反應(yīng)，從而減輕肝臟的急性損傷，提高生存率［32-33］。BMSC移植后通過(guò)調(diào)節(jié)枯否氏細(xì)胞促進(jìn)肝功能恢復(fù)，主要表現(xiàn)為促進(jìn)肝內(nèi)巨噬細(xì)胞（即枯否氏細(xì)胞）由M1型向M2型轉(zhuǎn)移［34］。前期本課題組對(duì)42例接受干細(xì)胞移植治療的患者進(jìn)行了免疫相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在干細(xì)胞治療后患者外周血IL-17水平呈持續(xù)下降趨勢(shì)，并與患者肝功能指標(biāo)的變化呈正相關(guān)，進(jìn)而通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證BMSC通過(guò)下調(diào)IL-17水平促進(jìn)肝功能恢復(fù)［35］。

三、存在的問(wèn)題

近年來(lái)，BMSC在治療終末期肝病中的臨床和基礎(chǔ)研究越來(lái)越多，雖然大多數(shù)的研究結(jié)果表明BMSC能有效改善患者肝功能，然而這些研究仍處于早期階段，且研究設(shè)計(jì)或多或少存在一定的缺陷。一期臨床研究表明短期隨訪提示骨髓HSC和MSC是安全的，初步的數(shù)據(jù)證實(shí)對(duì)急性肝病患者更能取得臨床療效，但其療效是短期的［36］。目前關(guān)于BMSC治療終末期肝病的臨床研究在病例的選取、采用G-CSF、干細(xì)胞的采集和處理、移植途徑、療效的評(píng)估等方面并沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，哪種干細(xì)胞（骨髓源或外周血源、HSC或MSC）最好尚不清楚。臨床研究中選取的肝損害病因多種多樣，包括乙肝、丙肝、自身免疫性肝病、酒精性、隱源性等引起的終末期肝病，這樣會(huì)影響研究者對(duì)臨床療效的評(píng)估。因此在未來(lái)的臨床研究中集中在一種或少量幾種肝損害病因是非常必要的。

臨床研究中關(guān)于BMSC的采集方法是另一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。有些研究將干細(xì)胞采集后在體外培養(yǎng)，并將干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，由于體外培養(yǎng)干細(xì)胞使用的動(dòng)物血清能誘發(fā)受體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，同樣能影響臨床結(jié)果。另外關(guān)于移植BMSC的數(shù)目在不同研究中并不統(tǒng)一，從一百萬(wàn)到及幾十億不等，其勢(shì)必影響研究結(jié)果。但是目前尚無(wú)關(guān)于干細(xì)胞數(shù)目與療效相關(guān)性的臨床研究報(bào)道。

在不同的臨床研究中，BMSC回輸?shù)耐緩揭膊唤y(tǒng)一。大多數(shù)研究選擇經(jīng)門靜脈途徑回輸，然而這種方法可能會(huì)引起一過(guò)性的門靜脈高壓，從而限制干細(xì)胞在肝內(nèi)的定植。也有研究采用肝動(dòng)脈或外周靜脈回輸，目前尚無(wú)關(guān)于不同途徑回輸之間的安全性和有效性比較。一項(xiàng)動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)急性爆發(fā)性肝炎動(dòng)物模型，只有通過(guò)門靜脈回輸才能增加動(dòng)物的存活率［37］。因此，關(guān)于哪種途徑回輸BMSC療效較好、風(fēng)險(xiǎn)較低仍需要進(jìn)一步研究探討。

目前，關(guān)于BMSC回輸后臨床療效的評(píng)估尚無(wú)明確指標(biāo)。大多數(shù)研究采用肝功能生化指標(biāo)，如膽紅素、白蛋白、凝血酶原時(shí)間，也有采用腹水、CTP和MELD評(píng)分，少見(jiàn)的也有肝臟組織、肝臟體積指標(biāo)等。然而采用生存率作為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)的研究較少，而上述這些指標(biāo)并不能有效的代表生存率?？赡苡捎谀壳按蠖鄶?shù)臨床研究樣本數(shù)較少，且隨訪時(shí)間較短，評(píng)估生存率存在一定的限制。

五、前景及挑戰(zhàn)

基于BMSC具有自我更新及多向分化潛能的特性，將其應(yīng)用于治療終末期肝病的臨床研究已經(jīng)取得了令人鼓舞的進(jìn)展。分子基因?qū)W和新型動(dòng)物模型的研究表明BMSC與肝臟之間存在復(fù)雜的關(guān)系，然而在進(jìn)行大型臨床研究之前仍有許多問(wèn)題需要解決。比如，盡管體外研究表明BMSC能向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，然而臨床研究中，BMSC是否轉(zhuǎn)分化為有功能的肝細(xì)胞并不清楚。因此，目前關(guān)于BMSC促進(jìn)肝功能恢復(fù)的具體機(jī)制仍需要深入研究和探討。

BMSC治療終末期肝病的目標(biāo)是提高肝臟的再生能力以及促進(jìn)纖維化基質(zhì)的降解。然而如果肝臟內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)受到破壞，BMSC移植的成功率可能大大降低，因?yàn)楦杉?xì)胞在肝內(nèi)的定植可能受到限制。BMSC是否具有長(zhǎng)期的復(fù)制潛能尚不清楚，在臨床研究中還應(yīng)考慮干細(xì)胞瘤變的可能性。如果臨床研究中采用體外培養(yǎng)、且向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化的BMSC，那么應(yīng)該建立一個(gè)統(tǒng)一的、有效的培養(yǎng)體系以降低培養(yǎng)體系對(duì)受體的影響。

在基礎(chǔ)研究中必須全面了解BMSC的生物學(xué)特征，才能在臨床中更好的應(yīng)用BMSC治療終末期肝病?？傊?，BMSC有可能成為治療終末期肝病的有效治療手段，從而給終末期肝病的患者帶來(lái)新的希望。

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Clinical use of bone-marrow stem cell therapy for end-stage liver disease

Zheng Linhua,Han Ying. Xijing Hospital of Digestive Diseases, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China

Han Ying, Email:hanying@fmmu.edu.cn

At present， the use of bone marrow-derived stem cell （BMSC） in the treatment of end-stage liver disease has received more and more attention. And most of the researches suggest that BMSC could improve liver function of the patients with end-stage liver disease. However， the underlining mechanisms are still unknown. There are several methods to collect BMSC， for example， BMSC could be mobilized by granulocyte-colony stimulating factor（G-CSF） into the peripheral blood and subsequent collected through the peripheral blood. Or we can collect BMSC direct through bone marrow. BMSC include mainly hematopoietic stem cells（HSC） and mesenchymal stem cells （MSC）. But there is much debate concerning which kind of stem cells contributes more to hepatic improvement. Thus， this review will summarize the clinical research progress of BMSC in the treatment of end-stage liver diseases.

Liver diseases； mesenchymal stem cell； bone marrow； endstage liver diseases； granulocyte-colony stimulating factor

2014-09-16）

（本文編輯：蔡曉珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2015.02.011

710032 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院

韓英，Email：hanying@fmmu.edu.cn