楊海玉 吳曉牧 劉勇 曾玉娥

骨髓間充質(zhì)干細胞對酒精誘導海馬神經(jīng)元損傷的作用研究

楊海玉 吳曉牧 劉勇 曾玉娥

目的 通過體外觀察骨髓間充質(zhì)干細胞(BMMSC)對酒精誘導海馬神經(jīng)元損傷的作用，初步探討B(tài)MMSC治療酒精性癡呆(AAD)的可行性。方法 取胎鼠海馬進行原代神經(jīng)元培養(yǎng)并進行神經(jīng)元純度鑒定。酒精組給予100 mol/L酒精37℃培養(yǎng)24 h，建立酒精誘導海馬神經(jīng)元損傷模型；BMMSC+酒精組在其培養(yǎng)液中同時加入BMMSC條件培養(yǎng)液(終濃度為50%)及100 mol/L酒精，37℃培養(yǎng)24 h；另設相同濃度的BMMSC條件培養(yǎng)液對照組(BMMSC組)及空白對照組(對照組)。采用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測各組細胞存活率，以碘化丙啶(PI)/Hoechst33342染色觀察細胞形態(tài)及凋亡情況。結(jié)果 原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元高表達神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)，低表達神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)，提示成功培養(yǎng)了純度較高的原代海馬神經(jīng)元。酒精組細胞存活率(0.80±0.09)低于對照組(1.00±0.11；t=4.128，P<0.01)及BMMSC組(1.04±0.07；t=-6.052，P<0.01)； BMMSC+酒精組細胞存活率(0.92±0.11)高于酒精組(t=2.555，P<0.05)。BMMSC組及BMMSC+酒精組細胞存活率與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。酒精組可見較多的細胞核呈致密濃染及核碎裂的凋亡細胞，BMMSC+酒精組的凋亡細胞數(shù)量明顯減少。結(jié)論 BMMSC可抑制酒精誘導的海馬神經(jīng)元凋亡發(fā)生，提示BMMSC移植治療AAD可能具有一定可行性。

骨髓間充質(zhì)干細胞；海馬神經(jīng)元；原代培養(yǎng)；凋亡；酒精性癡呆

大腦是酒精誘導損傷的最常見靶器官之一，長期大量飲酒可引起腦器質(zhì)性損害，并逐漸發(fā)展至癡呆狀態(tài)，稱之為酒精性癡呆(alcohol-associated dementia，AAD)，臨床以學習記憶功能受損為其主要特征表現(xiàn)，嚴重者日常生活不能自理[1-2]。目前研究認為，AAD的主要發(fā)病機制是由于酒精毒性造成海馬組織結(jié)構(gòu)破壞及其相關(guān)信號通路失調(diào)，特別是導致海馬神經(jīng)元大量凋亡，通常藥物治療很難達到理想的療效[3-4]。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell， BMMSC)是一類能自我更新并具多向分化潛能的干細胞。目前的研究顯示BMMSC移植對于神經(jīng)系統(tǒng)損傷及其導致的神經(jīng)功能障礙具有較好的治療作用，其機制包括減少神經(jīng)元凋亡、促進神經(jīng)細胞存活以及促進神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌等[5-7]。本研究以SD大鼠原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元為實驗對象建立酒精誘導損傷模型，通過制備大鼠BMMSC條件培養(yǎng)液并與酒精誘導損傷的海馬神經(jīng)元共培養(yǎng)，進一步觀察BMMSC對酒精誘導海馬神經(jīng)元損傷的作用，初步探討B(tài)MMSC移植治療AAD的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料 SD孕鼠和新生乳鼠購于江西中醫(yī)學院實驗動物部。培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元所需的Neurobasal培養(yǎng)基和B27培養(yǎng)基添加劑購于美國Gibco公司；培養(yǎng)大鼠BMMSC所需的DMEM/F12培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Hyclone公司；兔抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)單克隆抗體和兔抗神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)單克隆抗體購于武漢博士德生物公司；多聚-L-賴氨酸、FITC標記和TRITC標記二抗購自北京中杉金橋生物公司；碘化丙啶(propidium iodide，PI)、Hoechst33342染色劑、四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)及其他化學試劑購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)和鑒定[8]：取胎齡為15～18 d的胎鼠于體視顯微鏡下分離海馬組織，采用0.25%(體積分數(shù))胰蛋白酶消化，加入Neurobasal培養(yǎng)基〔含2%(體積分數(shù))B27〕吹打細胞懸液，調(diào)整細胞密度為2×105接種于6孔板，孔內(nèi)預先放置包被多聚-L-賴氨酸的蓋玻片。每3 d換液1次。細胞培養(yǎng)7 d后在倒置相差顯微鏡下觀察形態(tài)并拍照取圖。

同時，采用免疫熒光染色法對上述細胞進行神經(jīng)元鑒定。細胞培養(yǎng)第7天取蓋玻片，PBS輕洗3次，用4%(體積分數(shù))多聚甲醛室溫固定30 min。之后用0.1%(體積分數(shù))Triton X-100處理 15 min，分別滴加一抗兔抗鼠NSE(1∶100)和GFAP(1∶100)4℃過夜。PBS洗3次后，分別滴加FITC標記和TRITC標記羊抗兔二抗(1∶300)，室溫避光孵育1 h。之后以甘油緩沖液封片，熒光顯微鏡(型號DM3000，德國徠卡公司)觀察取圖。 NSE為神經(jīng)元特異性標記物，陽性染色呈綠色熒光；GFAP為神經(jīng)膠質(zhì)細胞特異性標記物，陽性染色呈紅色熒光。在高倍鏡(400倍)下隨機取3個視野，分別計算NSE、GFAP陽性細胞百分比。NSE表達高(>90%)，GFAP表達低(<5%)，提示神經(jīng)元細胞純度高并可用于下一步實驗。

1.2.2 BMMSC培養(yǎng)和條件培養(yǎng)液制備：取2～3周齡SD乳鼠，游離雙側(cè)后肢股骨和脛骨，用含10%(體積分數(shù))胎牛血清的DMEM/F12 1∶1培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，然后直接接種BMMSC于培養(yǎng)瓶。其具體培養(yǎng)及純化方法參照文獻[6]。取第3代BMMSC，于倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長至約90%融合，棄去原有培養(yǎng)液，加入10 mL無血清DMEM新鮮培養(yǎng)基(25 cm2培養(yǎng)皿)，于37℃培養(yǎng)24 h后收集培養(yǎng)液，300g離心5 min去除細胞碎片，-80℃凍存?zhèn)溆肹9]。

1.2.3 實驗分組和細胞處理[9]：實驗分組包括空白對照組(對照組)、酒精組、BMMSC+酒精組及BMMSC組。對照組僅用DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，酒精組用含100 mol/L酒精的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，BMMSC+酒精組用BMMSC條件培養(yǎng)基+100 mol/L酒精進行培養(yǎng)，BMMSC組用BMMSC條件培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。將各組密度為2×105的海馬神經(jīng)元細胞懸液接種于預先包被多聚-L-賴氨酸的96孔板，置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 d，每3 d換液1次。第7天所有細胞均更換僅含1%(體積分數(shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。BMMSC+酒精組和BMMSC組細胞在含BMMSC條件培養(yǎng)液(50%)的條件下預先孵育2 h(對照組和酒精組不含BMMSC條件培養(yǎng)液)，之后酒精組和BMMSC+酒精組加入酒精(終濃度為100 mol/L)，對照組及BMMSC組加入等量不含酒精的DMEM培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)24 h，用于原代海馬神經(jīng)元MTT法檢測細胞存活率和細胞凋亡情況。

1.2.4 原代海馬神經(jīng)元MTT檢測細胞存活率：各組細胞經(jīng)1.2.3所述處理后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃培養(yǎng)4 h。棄去所有溶液后加入200 μL DMSO溶液，振蕩10 min，采用酶標儀570 nm波長檢測吸光度〔D(λ)〕值，各組細胞處理相同。根據(jù)各組D(λ)值計算細胞存活率。D(λ)值越大，提示細胞存活率越高。

1.2.5 原代海馬神經(jīng)元凋亡檢測：各組細胞經(jīng)1.2.3所述處理后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗3次，然后每孔滴加適量PI染色液覆蓋細胞，避光染色5 min，PBS洗3次；每孔滴加適量Hoechst33342染色液覆蓋細胞，避光染色5 min，PBS洗3次。采用熒光顯微鏡觀察并拍照，PI染色顯示紅色熒光，Hoechst33342染色顯示藍色熒光，熒光定位均在細胞核，提示染色成功。凋亡細胞的特征表現(xiàn)為細胞核呈明顯固縮、濃染及核碎裂。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較選擇LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 原代海馬神經(jīng)元的形態(tài)與鑒定 從胎鼠海馬組織分離培養(yǎng)的細胞具有典型神經(jīng)元的形態(tài)特征，胞體較大、飽滿，胞質(zhì)豐富，核大、核仁隱約可見，突起明顯增長(圖1A)。熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示呈綠色熒光的NSE陽性細胞數(shù)量多，其陽性百分比為(96.7±1.53)%(圖1B)；呈紅色熒光的GFAP陽性細胞數(shù)量很少，陽性百分比為(3.30±0.57)%。該結(jié)果提示所分離培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元純度較高，可用于下一步實驗。

A：培養(yǎng)7 d的原代海馬神經(jīng)元(倒置顯微鏡)；B：NSE 表達(免疫熒光染色)

圖1 原代海馬神經(jīng)元形態(tài)及鑒定結(jié)果

2.2 原代海馬神經(jīng)元存活率檢測 酒精組細胞存活率(0.80±0.09)低于對照組(1.00±0.11；t=4.128，P<0.01)及BMMSC組(1.04±0.07；t=-6.052，P<0.01)； BMMSC+酒精組細胞存活率(0.92±0.11)高于酒精組(t=2.555，P<0.05)。BMMSC組及BMMSC+酒精組細胞存活率與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(t=-1.018，P>0.05；t=1.469，P>0.05)。

2.3 原代海馬神經(jīng)元凋亡檢測 酒精組可見較多的細胞核呈致密濃染及核碎裂的凋亡細胞(紅色熒光標記，圖2B)；BMMSC+酒精組的凋亡細胞數(shù)量明顯減少(圖2C)；對照組(圖2A)及BMMSC組(圖2D)中所見的神經(jīng)元胞核形態(tài)正常(藍色熒光標記)。

3 討論

目前研究認為，酒精對學習記憶的影響并不是作用于整個大腦，而是針對某些特定腦區(qū)尤其是海馬結(jié)構(gòu)，酒精毒性導致海馬神經(jīng)元大量凋亡則是其主要病理機制[3-4]。海馬是神經(jīng)元高度集中的部位，在學習、記憶、情緒反應及自主神經(jīng)功能等方面具有重要作用，并且海馬與周圍腦組織界限明確、易于分離，因此常作為神經(jīng)科學領(lǐng)域的體外研究對象。本研究成功培養(yǎng)了純度較高的原代海馬神經(jīng)元，實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，酒精(100 mol/L)作用24 h后海馬神經(jīng)元存活率降低，并發(fā)生明顯凋亡，提示酒精對海馬神經(jīng)元存活具有明顯的抑制作用，并且可誘導其發(fā)生凋亡。因此，可以認為酒精誘導的原代海馬神經(jīng)元損傷模型能反映AAD主要發(fā)病機制，是一種較為理想的AAD體外研究模型。

A：對照組；B：酒精組；C：BMMSC+酒精組；D：BMMSC組

圖2 原代海馬神經(jīng)元凋亡情況：圖中紅色熒光標記為PI染色，藍色熒光標記為Hoechst33342染色(免疫熒光)

近年來廣泛開展的干細胞研究取得了顯著進展，為各種損傷性疾病尤其是不可逆性損傷的治療提供了新的思路和方法。研究認為干細胞治療的有效性與其旁分泌機制密切相關(guān)：干細胞自身可分泌各種營養(yǎng)因子和細胞因子，從而發(fā)揮不同的生理學作用[10]。BMMSC具備來源廣泛、取材方便、在合適的體外培養(yǎng)條件下能迅速增殖且不產(chǎn)生免疫排斥等優(yōu)勢條件，具有廣闊的臨床應用前景?，F(xiàn)有研究證實體外培養(yǎng)的BMMSC具有自分泌能力，能分泌一些神經(jīng)營養(yǎng)因子包括神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)等[11-12]。上述神經(jīng)營養(yǎng)因子在體內(nèi)外均能促進神經(jīng)細胞的增殖分化，同時也能抑制各種因素誘導的神經(jīng)細胞凋亡，對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復具有重要保護作用。Liu等[9]的研究顯示，BMMSC條件培養(yǎng)液中含有較高水平的NGF、bFGF及BDNF等因子，并且采用BMMSC條件培養(yǎng)液對大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株(PC-12細胞)進行預處理，能夠明顯抑制酒精誘導的細胞凋亡。同樣，本實驗結(jié)果顯示BMMSC+酒精組細胞存活率明顯高于酒精組，凋亡細胞數(shù)量也明顯少于酒精組，提示BMMSC條件培養(yǎng)液可促進受損原代海馬神經(jīng)元存活并抑制酒精誘導的凋亡。以上研究提示BMMSC可能通過旁分泌機制對酒精誘導神經(jīng)元損傷產(chǎn)生保護作用。

綜上可見，BMMSC條件培養(yǎng)液可促進受損原代海馬神經(jīng)元存活并抑制酒精誘導的凋亡，利用BMMSC移植治療AAD可能具有一定的可行性。然而，在臨床實踐中要達到所期望的治療效果仍面臨許多的困難和挑戰(zhàn)，需要進行更多的基礎和臨床研究來明確BMMSC的作用機制，并進一步優(yōu)化BMMSC的移植條件，以期為BMMSC的臨床應用提供充分的實驗參考依據(jù)。

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(本文編輯：鄒晨雙)

The effect of bone marrow mesenchymal stem cell on alcohol-induced hippocampal neuron injury

YANGHaiyu*,WUXiaomu,LIUYong,ZENGYu’e.

*InstituteofClinicalMedicalSciences,JiangxiProvincePeople’sHospital,NanchangJiangxi330006,China

YANG Haiyu, Email：yanghaiyu@yahoo.com

Objective To observe in vitro effects of bone marrow mesenchymal stem cell (BMMSC) on alcohol-induced hippocampal neuron injury and discuss the feasibility of alcohol-associated dementia (AAD) treatment with BMMSC transplantation. Methods Hippocampal neurons got from fetal rats were primary-cultured for 6 days and identified with immunofluorescence staining. Then they were divided into four groups. Some cells were treated with ethanol (100 mol/L) for 24 h in 37℃ (the ethanol group). BMMSC-conditioned medium (the concentration was 50%) was prepared and co-cultured with ethanol-treated cells for 24 h (the BMMSC+ethanol group). The BMMSC group was treated with BMMSC-conditioned medium (the concentration was 50%). For the control group, cells were treated only with DMEM medium. The cell viability was analyzed with MTT assay. The staining with propidium iodide (PI)/Hoechst33342 was used to observe cell apoptosis. Results Primary-cultured hippocampal neurons were NSE-positive and GFAP-negative, suggesting that primary hippocampal neurons with high purity were successfully cultivated. As compared with the control group (1.00±0.11) and the BMMSC group (1.04±0.07), the cell viability of the ethanol group significantly decreased (0.80±0.09,P<0.01). As compared with the ethanol group, the cell viability of the BMMSC+ethanol group significantly increased (0.92±0.11,P<0.05). Cell apoptosis was apparently induced by treatment of ethanol (100 mol/L) for 24 h. However, co-cultured with BMMSC-conditioned medium (50%, 24 h), these effects of ethanol on hippocampal neurons were prevented. Conclusions BMMSC plays a role to inhibit alcohol-induced hippocampal neuron apoptosis and it suggests that BMMSC transplantation is promising for AAD treatment.

bone marrow mesenchymal stem cell; hippocampal neuron; primary culture; apoptosis; alcohol-associated dementia

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.04.010

國家自然科學基金資助項目(81060111)；江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研基金重大課題(2013Z005)

330006 江西省人民醫(yī)院，臨床醫(yī)學研究所(楊海玉、吳曉牧、曾玉娥)，病理科(劉勇)

楊海玉，Email：yanghaiyu@yahoo.com

R741.02

A

1006-2963 (2015)04-0269-04

2013-12-20)