侯志濤 韓玉生 熊圣彪 劉翼天 韓曉霞 孫紅芳 李東東 尹祖賢

D半乳糖誘導(dǎo)結(jié)合雙血管結(jié)扎建立腦缺血大鼠模型及其評價(jià)

侯志濤 韓玉生 熊圣彪 劉翼天 韓曉霞 孫紅芳 李東東 尹祖賢

目的 通過D半乳糖(D-gal)誘導(dǎo)結(jié)合雙血管結(jié)扎的方法建立一種能較好地模擬人類腦缺血的動物模型，并對該模型進(jìn)行評價(jià)。方法 以3月齡青年SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，采用D-gal連續(xù)皮下注射6周結(jié)合雙血管結(jié)扎的方法制備腦缺血動物模型。以Garcia量表評價(jià)大鼠的神經(jīng)功能損傷的嚴(yán)重程度；血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)水平評價(jià)機(jī)體氧自由基代謝情況；TTC染色評價(jià)大鼠腦梗死體積；HE染色評價(jià)缺血區(qū)腦組織損傷的嚴(yán)重程度。結(jié)果 模型組(10.375±1.188)和半乳糖模型組Garcia評分(7.167±4.714)均低于空白組(20±0；均P<0.01)，半乳糖模型組Garcia評分低于模型組(P<0.05)。與模型組比較，半乳糖模型組大鼠SOD〔(393.60±19.02)U/mLvs. (469.37±22.63)U/mL〕和GSH-Px(1116.38±76.88vs. 1413.22±102.74)活性降低(均P<0.05)，MDA〔(17.58±0.84)mmol/mLvs. (10.89±1.08)mmol/mL〕水平升高(P<0.05)。與模型組比較，半乳糖模型組梗死體積分?jǐn)?shù)(35.75±2.38vs. 24.23±1.92)明顯增大(P<0.01)。模型組大鼠缺血區(qū)表現(xiàn)為神經(jīng)元細(xì)胞腫脹變性溶解，白質(zhì)疏松等異常病理變化，半乳糖模型組較模型組更為嚴(yán)重。結(jié)論 該模型能夠較好地模擬人類腦缺血。

腦缺血模型；D半乳糖；雙血管結(jié)扎

腦缺血(cerebral ischemia)是一種常見的腦血管疾病，是由于腦組織對缺血缺氧反應(yīng)敏感所致。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大鼠每100 g體質(zhì)量腦血流量降至15 mL/min以下持續(xù)2 h即可導(dǎo)致不可逆的腦細(xì)胞損傷[1]。機(jī)體老化是導(dǎo)致腦血流量降低和氧自由基代謝異常的主要因素[2-3]，當(dāng)按體質(zhì)量2 mL/(kg·d)給予 3月齡青年SD大鼠7.5 %(質(zhì)量濃度)D半乳糖(D-gal)皮下注射后6周即可使其機(jī)體表現(xiàn)為24月齡衰老大鼠的表現(xiàn)[4]。中樞神經(jīng)元損傷導(dǎo)致相應(yīng)神經(jīng)功能受損是主要的臨床表現(xiàn)，也是評價(jià)腦缺血后疾病嚴(yán)重程度及治療后恢復(fù)程度的重要標(biāo)準(zhǔn)[5]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)腦缺血的疾病特點(diǎn)，采用D-gal誘導(dǎo)大鼠機(jī)體衰老結(jié)合雙血管結(jié)扎的方法建立一種能較好的模擬人類腦缺血的動物模型并對這一模型進(jìn)行評價(jià)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物：健康清潔級3月齡雄性SD大鼠〔購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物安全評價(jià)中心；實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(黑)2013-004，使用許可證號：SYXK(黑)2013-012〕70只，體質(zhì)量(125±5)g。采用隨機(jī)數(shù)字法將大鼠隨機(jī)分組，標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)，飲食飲水自由，動物房內(nèi)溫度18～25℃，相對濕度40%～50%，自然光照，保證動物房安靜，整潔，通風(fēng)。

1.1.2 主要儀器及試劑：D-gal(美國 Sigma公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；722型可見分光光度計(jì)(上海光譜科技有限公司)；Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)(美國Media Cybernetics公司)；Nikon eclipse 50i 光學(xué)顯微鏡(日本株式會社)，其余產(chǎn)品均為市售分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組：將70只3月齡SD大鼠隨機(jī)分為空白組(15只)、半乳糖組(15只)、模型組(20只)及半乳糖模型組(20只)。模型組正常飼養(yǎng)6周后，參照Ni等[6]的造模方法制備腦缺血大鼠模型。大鼠在手術(shù)開始前24 h禁食，前12 h禁水。用10 %(質(zhì)量濃度)水合氯醛以體質(zhì)量3 mL/kg給大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，待麻醉深度達(dá)到手術(shù)指征后將大鼠放于手術(shù)臺進(jìn)行消毒，在大鼠頸部正中做一縱向切口，分離出雙側(cè)頸總動脈，分別結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈的遠(yuǎn)心端和近心端。并從中間剪開，保證完全阻斷頸總動脈血流，逐層縫合。半乳糖組用7.5 %(質(zhì)量濃度)D-gal以體質(zhì)量2 mL/(kg·d)皮下注射6周，制備大鼠衰老模型[5]。半乳糖模型組先以半乳糖組相同方法制備大鼠衰老模型[5]然后參照Ni等[6]的造模方法制備腦缺血大鼠模型?？瞻捉M正常飼養(yǎng)，不作任何處理。造模結(jié)束24 h后盲法進(jìn)行Bederson評分[7]作為腦缺血模型成功入組的評定標(biāo)準(zhǔn)，評分低于2分的大鼠剔除。Bederson評分的4個等級包括：0分：沒有任何神經(jīng)損傷的癥狀；1分：懸尾試驗(yàn)時(shí)不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：前肢抵抗對側(cè)的推力能力下降；3分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈。最終模型組入組大鼠為8只(成功率為40%)；半乳糖模型組入組大鼠為12只(成功率為60%)。

1.2.2 大鼠神經(jīng)功能評價(jià)： 造模結(jié)束24 h后對各組大鼠盲法進(jìn)行Garcia評分[8]，從大鼠自主的運(yùn)動情況、體態(tài)的對稱性、前肢伸展的功能、網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)、身體雙側(cè)的觸覺以及雙側(cè)胡須的反射6個方面評定大鼠神經(jīng)功能損傷的嚴(yán)重程度，功能正常時(shí)得分最高18分，功能損傷最嚴(yán)重者得分最低3分。

1.2.3 SOD、GSH-Px活性及MDA水平的測定：各組大鼠神經(jīng)功能評價(jià)結(jié)束后，立即將大鼠麻醉，心臟取血，將血液導(dǎo)入真空采血管中。室溫靜置0.5 h后，以3300 r/min(離心半徑=18 cm)離心10～15 min后分離血清，SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法，MDA采用TBA縮合比色法，GSH-Px測定采用DTNB顯色法，三者均用722型可見分光光度計(jì)測量。

1.2.4 腦梗死體積測定[9]：各組動物完成神經(jīng)功能評價(jià)后，用10 %(質(zhì)量濃度)水合氯醛以體質(zhì)量3 mL/kg腹腔注射麻醉，心臟取血后，立刻開顱取腦，自視交叉前4 mm起其后做連續(xù)冠狀切片(厚度為2 mm)，共取6片，將切片置于1%(質(zhì)量濃度)TTC染液中，37℃避光孵育30 min，正常腦組織呈深紅色，梗死的腦組織不能著色呈現(xiàn)蒼白色。用數(shù)碼相機(jī)按固定比例進(jìn)行正反兩面拍照，經(jīng)Photoshop軟件測定各切片正反兩面的梗死灶面積，正反兩面面積平均值乘以厚度，得出梗死灶體積，并按照公式“腦梗死體積分?jǐn)?shù)=V梗死體積/V腦體積×100%”計(jì)算梗死體積分?jǐn)?shù)。

1.2.5 缺血區(qū)腦組織損傷觀察：將各組大鼠腦組織置于4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))甲醛溶液中固定48 h ，取缺血區(qū)腦組織經(jīng)浸蠟包埋制作石蠟切片，切片厚度為6 μm，切片脫蠟、水洗，蘇木素染色5 min，1%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸酒精分化，水洗，伊紅(HE)染色3 min，脫水、透明、封片。每只大鼠缺血區(qū)間切片隔10張取1張，每張切片觀察2個400倍視野，主要觀察雙側(cè)頸內(nèi)動脈供血區(qū)神經(jīng)元、白質(zhì)纖維、炎性細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞等的變化情況。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評價(jià) 結(jié)果見表1。模型組和半乳糖模型組Garcia評分均低于空白組(P<0.01)，且半乳糖模型組Garcia評分低于模型組(P<0.05)。

2.2 腦梗死體積的測定 空白組及半乳糖組未見梗死灶；與模型組梗死體積分?jǐn)?shù)〔(24.23±1.92)%〕比較，半乳糖模型組〔(35.75±2.38)%〕明顯增大(P<0.01)(圖1)。

2.3 各組大鼠缺血區(qū)腦組織損傷觀察 空白組和半乳糖組神經(jīng)元及腦白質(zhì)等結(jié)構(gòu)未見明顯的病理變化。模型組與半乳糖模型組大鼠缺血區(qū)均出現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞腫脹變性溶解，白質(zhì)疏松，胞質(zhì)嗜酸性減弱，炎細(xì)胞浸潤明顯增多，邊緣區(qū)大量神經(jīng)細(xì)胞壞死，炎細(xì)胞浸潤明顯，少量膠質(zhì)細(xì)胞增生，半乳糖模型組較模型組損傷更為顯著(圖2)。

注：與空白組比較，*P<0.01；與半乳糖組比較，#P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；

A：空白組；B：半乳糖組；C：模型組；D：半乳糖模型組

圖1 各組大鼠缺血區(qū)表現(xiàn)：圖中箭頭所示為腦梗死區(qū)域(TTC)

A：空白組；B：半乳糖組；C：模型組；D：半乳糖模型組

圖2 各組大鼠基底節(jié)區(qū)缺血區(qū)表現(xiàn)：圖中紅色箭頭所指為白質(zhì)纖維，黑色箭頭所指為神經(jīng)元(HE)

2.4 各組大鼠血清SOD、GSH-Px活性和MDA水平比較 結(jié)果見表1。與空白組比較，其他三組血清SOD活性明顯降低(P<0.01)，MDA水平升高(P<0.01)，模型組及半乳糖模型組GSH-Px活性明顯降低(P<0.01)；與半乳糖組比較，模型組、半乳糖模型組SOD、GSH-Px活性降低(P<0.05)、MDA水平升高(P<0.05)；與模型組比較，半乳糖模型組大鼠SOD、GSH-Px活性降低、MDA水平升高(P<0.05)。

3 討論

動物模型制作應(yīng)能夠較好地模擬人類疾病，將主要的發(fā)病因素考慮在內(nèi)，并且具備制作簡便、可重復(fù)性強(qiáng)、模型評價(jià)相對明確等特點(diǎn)。本研究基于公認(rèn)的慢性腦缺血模型結(jié)合國內(nèi)外研究建立了D-gal誘導(dǎo)后制作大鼠腦缺血模型方法，即先將3月齡青年SD大鼠給予D-gal誘導(dǎo)，使動物發(fā)生一系列的類似于人類老年期機(jī)體衰老的表現(xiàn)，再制作腦缺血模型。研究顯示，伴隨著機(jī)體老化體內(nèi)各種新陳代謝速度減慢，血流動力學(xué)和血液流變學(xué)發(fā)生一定程度的改變。老年期血管內(nèi)皮變薄、膠原蛋白以及彈性蛋白增加，微血管相關(guān)蛋白水平下降，腦內(nèi)β淀粉樣蛋白、脂褐素大量沉積、免疫力低下等均可以導(dǎo)致腦組織缺血缺氧的風(fēng)險(xiǎn)增加[10]。同時(shí)腦老化可以導(dǎo)致腦內(nèi)cDNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性降低，染色質(zhì)活性下降，影響正?；虻谋磉_(dá)。近年來，大多數(shù)研究者對腦缺血的研究，傾向于選擇梗死體積較大、神經(jīng)功能缺損較重和神經(jīng)細(xì)胞腫脹壞死程度較高的模型。造模的可操作性以及成活率也是通常被考慮的重要因素[11]。而老年大鼠生理上存在血管迂曲、嚴(yán)重的動脈硬化以及易感其他未知疾病等因素均使得造模死亡率高、穩(wěn)定性和重復(fù)性差，最終導(dǎo)致不能使用自然衰老的大鼠制作腦缺血動物模型[12]。因此，將機(jī)體老化這一重要因素融入當(dāng)下腦缺血動物模型的研究，再結(jié)合雙血管結(jié)扎導(dǎo)致腦內(nèi)出現(xiàn)廣泛的供血供氧不足以及自由基過度堆積等病理變化，進(jìn)而使該模型更接近于人類腦缺血的發(fā)生發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，半乳糖模型組大鼠神經(jīng)功能Garcia評分(7.167±4.714vs. 10.375±1.188，P<0.05)、腦內(nèi)梗死體積分?jǐn)?shù)(35.75±2.38vs. 24.23±1.92，P<0.01)、炎性細(xì)胞浸潤以及神經(jīng)細(xì)胞腫脹程度等方面均呈現(xiàn)出損傷較重的表現(xiàn)，并且該模型體現(xiàn)了穩(wěn)定性高、造模成功率較高的優(yōu)點(diǎn)，也提示D-gal誘導(dǎo)青年大鼠衰老是較好的制作腦缺血模型途徑。

腦缺血時(shí)機(jī)體可以產(chǎn)生大量的自由基，自由基不斷地侵襲不飽和脂肪酸側(cè)鏈，產(chǎn)生一系列的連鎖反應(yīng)，最終導(dǎo)致了腦組織神經(jīng)細(xì)胞受到過氧化損害、凋亡壞死[13]。有研究顯示用SOD預(yù)處理實(shí)驗(yàn)動物，可以有效的阻止動物腦組織缺血性細(xì)胞凋亡的發(fā)生[14]。大量臨床研究表明，缺血性腦卒中患者血清SOD、GSH-Px活性降低，MDA水平升高[15]，并且認(rèn)為這一普遍表現(xiàn)可作為對腦缺血嚴(yán)重程度評價(jià)的重要參考標(biāo)準(zhǔn)。本研究發(fā)現(xiàn)，與其他三組比較，半乳糖模型組MDA水平明顯升高，SOD、GSH-Px活性明顯降低，這一特點(diǎn)與缺血性腦卒中患者臨床血液學(xué)表現(xiàn)[15]完全一致，也提示該模型與人類腦缺血的病理變化較為接近，并且與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有密切的關(guān)系，自由基連鎖反應(yīng)可能是參與該疾病模型病理過程的重要因素。

綜上可見，本研究發(fā)現(xiàn)，D-gal誘導(dǎo)結(jié)合雙血管結(jié)扎制作的腦缺血大鼠模型能夠較好地模擬人類腦缺血的發(fā)病特點(diǎn)，并且基本滿足穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、造模成功率高的特點(diǎn)，同時(shí)該模型存在明顯神經(jīng)功能缺損癥狀，是較為理想的腦缺血大鼠模型，適用于腦缺血機(jī)制及藥物療效評價(jià)的研究。

[1]Zhang RL, Chopp M, Chen H, et al. Postischemic (1 hour) hypothermia significantly reduces ischemic cell damage in rats subjected to 2 hours of middle cerebral artery occlusion[J]. Stroke,1993，24(8):1235-1240.

[2]Slemmer JE, Shacka JJ, Sweeney MI, et al. Antioxidants and free radical scavengers for the treatment of stroke, traumatic brain injury and aging[J].Curr Med Chem,2008,15(4):404-414.

[3]Xu K, Puchowicz MA, Sun X, et al. Mitochondrial dysfunction in aging rat brain following transient global ischemia[J].Adv Exp Med Biol, 2008, 61(4): 379-386.

[4]Zhong Y,Hu YJ,Chen B，et al. Mitochondrial transcription factor： A overexpression and base excision repair deficiency in the inner ear of rats with d-galactose-induced aging[J]. FEBS J, 2011, 278(14):2500-2510.

[5]Toda N, Ayajiki K, Okamura T. Cerebral blood flow regulation by nitric oxide: recent advances[J]. Pharmacol Rev, 2009, 61(1): 62-97.

[6]Ni JW, Marsumoto K, Li HB, et al. Neuronal damage and decrease of central acetylcholine level following permanent occlusion of bilateral common carotid arteries in rat[J].Brain Res,1995,673(2):290-296.

[7]Bederson JB, Pitts LH, Tsuji M, et al. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination[J]. Stroke,1986,17(3):472-476.

[8]Garcia JH, Wagner S, Liu KF, et al. Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats. Statistical validation[J]. Stroke,1995,26(4):627-634.

[9]Derugin N,Wendland M,Muramatsu K, et al.evolution of brain injury after transient middle cerebral artery occlusion in neonatal rats[J].Stroke,2000,31(7):1752-1761.

[10]Davis M, Mendelow D, Perry RH, et al. Experimental stroke and neuroprotection in aging rat brain[J]. Stroke, 1995, 26: 1072.

[11]Tureyen K, Brooks N, Bowen K, et al.transcription factor early growth response-1 induction mediates inflammatory gene expression and brain damage following transient focal ischemia[J].J Neurochem,2008,105(4):1313-1324.

[12]Popa-Wagner A, Schroder E, Schmoll H, et al. Upregulation of MAP1B and MAP2 in the rat brain after middle cerebral artery occlution: Effect of age[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 1999, 19:425-434.

[13]曲忠森,任曉燕,葛寶林,等. 地塞米松對鼠腦缺血-再灌注損傷時(shí)海馬谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的影響[J].中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志,1999,6(3):161-164.

[14]Csiszar A, Smith K, Labinskyy N, et al. Resveratrol attenuates TNF-alpha-induced activation of coronary arterial endothelial cells: role of NF-kappab inhibition[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2006, 291(4): H1694-1699.

[15]Demirkaya S, Topcuoglu MA, Aydin A, et al. Malondialdehyde, glutathione peroxidase and superoxide dismutase in peripheral blood erythrocytes of patients with acute cerebral ischemia[J]. Eur J Neurol,2001, 8(1):43-45.

(本文編輯：鄒晨雙)

Establish and evaluation of rat cerebral ischemia model induced by D-galactose combined with ligation of bilateral common carotid arteries

HOUZhitao,HANYusheng*,XIONGShengbiao,LIUYitian,HANXiaoxia,SUNHongfang,LIDongdong,YINZuxian.Heilongjiang

UniversityofChineseMedicine,HarbinHeilongjiang150040,China

HAN Yusheng, Email：hysh1973@126.com

Objective To established animal model by D-galactose(gal)-inducing and double vascular ligation, and simulate the human brain ischemia and evaluate the model. Methods Cerebral ischemia models were established by the method of D-gal injected subcutaneously for 6 weeks and then the operation of bilateral carotid artery ligation was taken in 3 month young Sprague-Dawley (SD) rats. The criteria of a successful model was evaluated by Bederson scale and the neurological dysfunction severity caused by cerebral ischemia was evaluated by Garcia scale. The serum superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase(GSH-Px) activity and Malondialdehyde(MDA) content were detected by chemical colorimetric method. The infarct size was evaluated by TTC staining. The injury severity of brain ischemic tissue was evaluated by HE staining. Results Compared to the blank group(20±0), Garcia score of the model group(10.375±1.188)and the D-gal model group(7.167±4.714)showed significant differences (P<0.01). Compared to the model group, Garcia score of the D-gal model group(7.167±4.714vs. 10.375±1.188)decreased (P<0.05). Compared with the model group, serum SOD[(393.60±19.02)U/mLvs. (469.37±22.63)U/mL], GSH-Px(1116.38±76.88vs. 1413.22±102.74)activity of the D-gal model group were decreased (P<0.05 respectively), MDA[(17.58±0.84) mmol/mLvs. (10.89±1.08)mmol/mL] content increased (P<0.05). Compared with the model group, infarct volume percentage(35.75±2.38vs. 24.23±1.92)of the D-gal model group significantly increased(P<0.01). Abnormal pathological changes of swelling, degeneration, dissolution and leukoaraiosis were observed in ischemic area neurons of the model group. The pathological changes of the D-gal model group was more serious than the model group. Conclusions The model can simulate the human brain ischemia and it was an ideal animal model for the pathogenesis of brain ischemia.

cerebral ischemia model; D-galactose; bilateral carotid artery ligatio

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.04.007

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(038002)

150040 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)

韓玉生，Email：hysh1973@126.com

R734

A

1006-2963 (2015)04-0255-05

2014-11-09)