高家治 施 展 王建東 田 亮

·綜 述·

Src/VE-cadherin信號通路在創(chuàng)面愈合中的研究進展

高家治 施 展 王建東 田 亮

Src；VE-cadherin；信號通路；創(chuàng)面愈合；研究進展

創(chuàng)面愈合包括連續(xù)而又相互重疊的3個階段，即炎癥期、肉芽組織形成期和瘢痕形成期。早期炎癥期主要由單核、巨噬細胞和中性粒細胞等向傷處遷移并釋放多種細胞因子。中期由成纖維細胞和新生毛細血管等形成肉芽組織，填補組織缺損，并由表皮細胞增殖、遷移重建上皮屏障。后期則主要由成纖維細胞分泌并沉積基質。目前研究認為[1]，生長因子參與調控創(chuàng)面愈合的全過程。生長因子通過與細胞膜上特定的高親和性受體結合而啟動其活性，然后通過信號通路而發(fā)揮作用。信號通路是創(chuàng)傷愈合修復研究中探索外界因素與內(nèi)在因素聯(lián)系的關鍵[2]。

1 Src蛋白

1.1 Src蛋白家族結構 Src蛋白家族是具有酪氨酸蛋白激酶（protein tyrosine kinase，PTK）活性的蛋白質，目前發(fā)現(xiàn)由13個成員組成，在人的基因中有11種，分別是：Blk、Brk、Fgr、Frk、Fyn、Hck、Lck、Lyn、Src、Srm和Yes，其中Src蛋白是目前研究最多的成員，Src廣泛存在于組織細胞中，通過信號通路中重要分子的相互作用，作為連接許多細胞外和細胞內(nèi)重要信號途徑的結合分子，Src在受體介導的信號途徑中具有中心調節(jié)作用。所有的Src家族成員都由幾個特殊結構域組成，其結構從N—端開始依次是SH4結構域、Unique結構域、SH3結構域、SH2結構域及SH2激酶連接子蛋白-酪氨酸激酶結構域（SH1結構域），最后為具一保守酪氨酸磷酸化位點的C—端調節(jié)域[3]。

1.2 Src蛋白激酶活性調節(jié) Src蛋白由不同功能的結構域組成，位于N-端的SH4區(qū)包含了豆蔻酰化和蛋白質棕櫚化的位點，這些位點的改變可使Src蛋白錨定于細胞膜的內(nèi)表面，Unique結構域包含蛋白激酶C綁定位點-Ser12和Ser48-在細胞中PKC激活的過程中被磷酸化[4]。隨后的SH3區(qū)具有與富含脯氨酸序列的基質蛋白結合的特性，位于SH3之后的SH2的結構域通過C-端磷酸化Tyr527的結合參與調控激酶本身活性的抑制，作為Src蛋白催化區(qū)域的SH1是一個雙裂結構，ATP通過與鉸鏈區(qū)結合發(fā)生自身磷酸化，觸發(fā)激酶的活性，位于SH1結構域之后的C-端區(qū)域包含Tyr527調控殘基，此殘基的磷酸化和去磷酸化可調節(jié)Src激酶的活性。Src中兩個最重要的調節(jié)磷酸化位點中的一個是Tyr527，C末端的六個殘基。在體內(nèi)的基本條件下，90～95%的Src是在Tyr527上磷酸化的[5]。磷酸酪氨酸527分子內(nèi)連接SrcSH2結構域。這種分子內(nèi)連接形式固定酶的限制形式[6]。在限制酶中，既不是SH2也不是SH3接近外來配體。Tyr527Phe突變物比野生型酶更活躍并且能誘導體外的錨定—依賴生長和體內(nèi)腫瘤[7-8]。Tyr527磷酸化產(chǎn)生是由于其他蛋白—酪氨酸激酶的活動包括Csk和Chk[9]。Sre經(jīng)歷在酪氨酸416上的細胞內(nèi)自動磷酸化，這個殘基存在于激活環(huán)中，它的磷酸化促進激酶活動[10]。

SH2區(qū)及SH3區(qū)在Src家族激酶的催化活性調節(jié)中起關鍵作用，X射線衍射分析顯示，細胞內(nèi)SH2和SH3區(qū)間相互作用是怎樣穩(wěn)定Src激酶非活性結構的。兩個區(qū)都靠近激酶區(qū)，從一邊朝向對面的催化區(qū)裂口。SH3區(qū)與催化區(qū)作用并連接著SH2區(qū)與催化區(qū)間的序列[11]，Tyr527去磷酸化將導致Src催化活性的激活[12]。Src激酶通過復雜的分子內(nèi)相互作用而處于抑制狀態(tài)，使其活性可受多種膜結合受體及剪切蛋白調節(jié)，如Src激酶的PTK活性可被含磷酸化酪氨酸的蛋白激活，再如Src激酶也可被蛋白酪氨酸磷酸酶活化。Src激酶一旦解除了抑制狀態(tài)，PTK功能域內(nèi)一個關鍵酪氨酸殘基就被磷酸化，其PTK活性從而被激活。Src的這種“關閉”與“開放”結構通過膜脂修飾與細胞膜相連，使其能穩(wěn)定地被細胞膜上啟動的各種信號激活并發(fā)生相互作用，如Src激酶可被許多細胞膜受體激活。

2 VE-cadherin蛋白

2.1 VE-cadherin蛋白結構 血管內(nèi)皮鈣黏附素（vascular endothelial Catherin，VE-cadherin）是血管內(nèi)皮細胞表面特異的跨膜黏附蛋白。鈣黏蛋白是黏附分子家族一種，具有Ca2+介導的親同源性連接功能。主要分為兩型，Ⅰ型鈣黏蛋白僅在上皮細胞的黏附連接中發(fā)現(xiàn)，包括E-cadherin、N-cadherin、P-cadherin、C-cadherin，Ⅱ型鈣黏蛋白胞外區(qū)EC1區(qū)缺乏HAV基序［組-丙-纈（His-Ala-Val）即HAV三肽序列結構］。VE-cadherin在血管內(nèi)皮細胞的黏附連接處發(fā)現(xiàn)[13]，屬于Ⅱ型鈣黏蛋白。VE-cadherin分子量約為130～140kda，是由780個氨基酸組成的單鏈糖蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)三部分組成。胞外區(qū)含110個氨基酸，由5個同源重復結構域和Ca2+結合序列組成，可介導鈣依賴的細胞與細胞黏附；胞漿區(qū)通過胞內(nèi)介導蛋白與細胞骨架相連。

2.2 VE-cadherin蛋白分類及功能 VE-Cadherin（又Ncadherin-5、784或CD-1441）是特異表達于內(nèi)皮細胞的鈣黏附素[14]。它介導相鄰內(nèi)皮細胞之間的黏附連接，在保持血管的完整性，調節(jié)內(nèi)皮細胞之間的通透性，白細胞外滲以及細胞內(nèi)的信號傳導中發(fā)揮重要作用；VE-cadherin除了黏附特性之外，還參與調節(jié)各種細胞內(nèi)進程，比如細胞增殖、細胞凋亡和調節(jié)血管內(nèi)皮生長因子受體的功能，因此，VE-cadherin對于創(chuàng)面修復過程中血管形成和血管新生是必需的。VE-cadherin有VE-cadherin-1和VE-cadherin-2兩種亞型，其中VE-cadherin-1與幾種骨架蛋白（如p120、β-連環(huán)蛋白和盤狀球蛋白）相連控制著內(nèi)皮細胞與內(nèi)皮細胞之間連接的穩(wěn)定性，細胞間隙的通透性、細胞分散、血管形成和細胞內(nèi)的信號傳導[15]。VE-cadherin-2是最近在血管內(nèi)皮細胞（vascularendothelial cell，VEC）表面新發(fā)現(xiàn)的一種鈣黏蛋白，它表達黏附特性，但不與細胞骨架蛋白連環(huán)蛋白（catenin）連接，也不參與調節(jié)細胞間隙的通透性以及細胞的遷移和生長。

3 Src/VE-cadherin信號通路在創(chuàng)面愈合的作用

創(chuàng)面的愈合過程包括凝血、炎癥反應、基質合成與沉積、血管生成、纖維組織形成、上皮化、創(chuàng)面收縮及重塑。炎癥反應是創(chuàng)面愈合的首要步驟，并且傷口愈合過程中，炎癥伴隨始終。適度炎癥促進愈合，過度炎癥破壞愈合[16-17]。炎癥不僅影響愈合，也是傷口不適癥狀的主要原因。近期國外學者的工作提示[18-21]，血管通透性在調節(jié)炎癥滲出和促進愈合兩方面都起到重要作用，血管通透性和毛細血管內(nèi)皮細胞之間的緊密連接、內(nèi)皮細胞層的連續(xù)性、毛細血管基底層完整性等因素有關，其中最重要的是內(nèi)皮細胞之間的緊密連接。而VE-cadherin是血管內(nèi)皮細胞黏附連接的主要成分，受Src的調控。因此由Src調控的Src/VE-cadherin信號通路可通過調節(jié)血管通透性促進創(chuàng)面愈合。

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth fator，VEGF）可誘導引起β-catenin與VE-cadherin結合位點的半胱氨酸619（Cys619）S-亞硝基化而增加血管的通透性。阻止內(nèi)皮型一氧化氮合酶eNOS相關的NO引起β-catenin的Cys619的S-亞硝基化能阻止β-catenin與VE的分離和黏附復合物的分解，阻止VEGF刺激的血管通透性的增加[22]。白細胞可經(jīng)跨細胞通道轉運途徑，穿過內(nèi)皮細胞層，但主要是內(nèi)皮細胞間連接開放讓白細胞通過。通過視頻顯微鏡、VE-cadherin-GFP（綠色熒光蛋白）轉染內(nèi)皮細胞或抗體標記VE-cadherin和血小板內(nèi)皮細胞黏附分子1（PECAM-1）方法證實，在單核細胞通過內(nèi)皮細胞的局部，VE-cadherin-catenin復合物染色顯示丟失。因此，推測VE-cadherin如窗簾一樣移到一邊或者是通過內(nèi)吞作用減少局部VE的濃度減弱內(nèi)皮細胞的連接讓白細胞通過。VE-cadherin對酶的溶解十分敏感。金屬蛋白酶、彈性蛋白酶、組織蛋白酶G或最小濃度的胰蛋白酶能誘導VE-cadherin胞外區(qū)域的消化分解，而中性粒細胞和腫瘤細胞能釋放大量的這些酶，因而能促進VE-cadherin的分解，增加細胞的溢出和脈管系統(tǒng)的滲漏[23-24]，增加對白蛋白的通透性。通過調節(jié)血管滲透性，控制炎癥反應，促進創(chuàng)面愈合。

Dejana等[25]實驗表明，VEGF可激活鳥內(nèi)皮細胞Src；VEGF介導的血管發(fā)生可被編碼Src-251的反義核酸所抑制；在鳥血管中過表達Src-251可使其凋亡。揭示VEGF激活Src對于內(nèi)皮細胞存活和血管發(fā)生是必需的。在以小鼠為模型的研究中[26]，用含CSK（一種磷酸化Src抑制位點Tyr527而抑制Src活性的PTK）的逆轉錄病毒載體處理動物也得到了相似的結果。盡管Src小鼠在VEGF刺激下也有血管發(fā)生，但同時缺失Src和Yes卻不出現(xiàn)VEGF引起的血管滲透性增加。單獨缺失Src并不影響VEGF引起的血管發(fā)生，但同時缺失Src、Yes引發(fā)胚胎9.5日致死，缺失VEGFR亦引起相同發(fā)階段胚胎致死。酪氨酸激酶Src可能與黏附連接蛋白的磷酸化有關，因為它直接與VE-Cadherin/catenin復合物相關聯(lián)并且Src基因失活或者抑制劑阻礙血管內(nèi)皮生長因子引起VE-Cadherin磷酸化調節(jié)血管通透性，除此之外還包括CSK，它與磷酸化的VE-Cadherin綁定并且抑制Src的活性[12]，PYK2也可能在VE-Cadherin/ catenin復合物的磷酸化起重要作用，盡管PYK2是否是直接把VE-Cadherin作為酶底物還不清楚，但是它能夠直接磷酸化β-catenin[13]，VE-Cadherin也能被磷酸化通過抑制與黏附連接關聯(lián)的磷酸酶，磷酸酶VE-PTP，因為它是內(nèi)皮細胞特異性和與VECadherin關聯(lián)而尤其受到關注。VE-PTP基因的滅活導致VE-Cadherin零表達的胚胎表型，這些研究表明如果VE-Cadherin不斷的磷酸化，就不能準確地構建新生血管[14]，創(chuàng)面難以愈合。

細胞增殖、血管形成也是創(chuàng)面愈合的關鍵一步。VE-cadherin在調節(jié)血管形成中同樣發(fā)揮重要作用。新生血管形成過程中內(nèi)皮細胞從血管單層內(nèi)皮脫落，侵入基底組織，形成管道樣結構并分枝形成更廣泛的血管網(wǎng)。這一復雜過程除了內(nèi)皮細胞增殖遷移，基質蛋白水解重塑等步驟外，細胞之間及細胞與基質間的黏附也有著至關重要的作用。在血管生成的最早期階段，細胞連接變得松弛，細胞得以遷移侵入基底組織。VE-cadherin具有限制內(nèi)皮細胞遷移，調節(jié)生長等功能，所以需要以VE-cadherin分子失活為前提，細胞黏附力降低，內(nèi)皮細胞才能從鄰近細胞脫離出來。

4 展望

Src/VE-cadherin信號通路是具有多生物學效性的細胞信號轉導途徑，在調節(jié)血管通透性、控制炎癥反應、促進新生血管形成等方面起著重要作用。VE-cadherin通過黏附特性和信號特點，精確地維持內(nèi)皮細胞間連接的可塑性和完整性的平衡。正是這一條件，使得內(nèi)皮細胞可以對炎癥因子和細胞生長因子的刺激做出動態(tài)反應從而保持血管屏障功能。

通過對Src/VE-cadherin信號通路在創(chuàng)面愈合中的作用研究的回顧，控制生長因子效應的最佳途徑之一就是阻斷它們的細胞內(nèi)信號轉導，所以Src介導的作用越來越得到認可。盡管有關Src蛋白的研究獲得了突破性的進展，但仍有許多問題懸而未決。有關不同Src的分子結構和功能、Src的表達與代謝、Src/VE-cadherin信號通路與其他細胞內(nèi)通路的關系等，尚有大量工作有待進一步探討。不同信號轉導通路都不過是細胞整個信號轉導網(wǎng)絡的一部分，隨著Src蛋白通路研究的深入，人們對VE-cadherin對多種細胞的多功能作用、VE-cadherin與其它多種細胞因子的相互作用等必將有新的認識。有目的地調控和干預Src/VE-cadherin信號通路，將有助于加深對創(chuàng)傷愈合理解和認識，為減輕瘢痕形成，預防纖維化疾病和腫瘤的發(fā)生等提供新的治療方法。

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（收稿：2015-01-20 修回：2015-03-25）

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