鈣離子及蛋白激酶C在低氧肺動(dòng)脈高壓平滑肌細(xì)胞中的作用

何俊毅施熠煒胡曉蕓

作者單位： 030001 山西，山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院呼吸科

【關(guān)鍵詞】鈣離子濃度，細(xì)胞內(nèi)；蛋白激酶C；低氧；肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞

低氧性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，至今尚不完全清楚。目前已有研究表明，低氧性肺動(dòng)脈高壓是多種離子通道、信號(hào)分子以及相關(guān)細(xì)胞因子等相互作用的結(jié)果。低氧肺動(dòng)脈高壓的病理生理基礎(chǔ)包括肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)增生、肺血管收縮和原位血栓形成，其中低氧性PASMCs收縮和增殖在肺血管重構(gòu)和肺動(dòng)脈高壓的形成和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[1]。PASMCs增殖和凋亡比率的失衡是肺血管重塑的主要原因，而PASMCs的過度收縮同樣也會(huì)導(dǎo)致肺血管的重塑[2]。PASMCs收縮和增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中有著共同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，協(xié)同介導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓的形成。目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子(intracellular calcium concentration，[Ca2+]i)和蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)不僅獨(dú)立參與介導(dǎo)了低氧PASMCs的收縮和增殖，而且它們之間彼此相互作用。本文對(duì)近年來[Ca2+]i和PKC的一般生物學(xué)特征及兩者在PASMCs收縮和增殖中作用的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、PASMCs內(nèi)Ca2+的特征及其調(diào)控作用

1. [Ca2+]i的的生物學(xué)特征: Ca2+是體內(nèi)重要的信號(hào)分子，PASMCs質(zhì)膜鈣通道和胞內(nèi)鈣池協(xié)同調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度水平。低氧可引起PASMCs內(nèi)的[Ca2+]i增加，其主要途徑包括細(xì)胞外鈣跨膜進(jìn)入和細(xì)胞內(nèi)鈣釋放。很多研究認(rèn)為低氧能使PASMCs膜電壓門控性鉀通道(voltage-gated potassium channel，Kv)表達(dá)減少且活性降低，細(xì)胞膜去極化，引起電壓依賴性鈣通道(voltage-gated Ca2+channels，VOCC)如L型鈣通道開放，細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，[Ca2+]i增加[3]。慢性低氧也可使PASMCs內(nèi)鈣池操縱性鈣離子通道(store-operated Ca2+channels，SOCC)開放，引起Ca2+庫操縱性Ca2+內(nèi)流，從而導(dǎo)致[Ca2+]i增加。瞬時(shí)受體電位通道蛋白(transient receptor potential channel，TRPC)作為SOCC的分子基礎(chǔ)，在低氧時(shí)表達(dá)增加，參與了PASMCs中 [Ca2+]i的調(diào)節(jié)[4]。細(xì)胞外鈣的進(jìn)入能夠觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放。另外低氧等刺激能夠通過G蛋白激活磷脂酶C(PLC)-IP3通路，使得肌漿網(wǎng)(SR)的Ryanodine受體鈣通道和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的IP3受體通道開放，細(xì)胞內(nèi)鈣釋放，[Ca2+]i增加。傳統(tǒng)的VOCC阻滯劑硝苯地平不能抑制低氧誘導(dǎo)的SOCC開放引起的Ca2+內(nèi)流，主要原因是參與肺動(dòng)脈高壓的Ca2+信號(hào)通道是多途徑的。

Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，是觸發(fā)低氧PASMCs收縮、增殖等相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的始動(dòng)因素，在低氧性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。[Ca2+]i不僅能誘發(fā)PASMCs的興奮-收縮偶聯(lián)機(jī)制調(diào)節(jié)肺血管收縮，也可以激活PASMCs的興奮-轉(zhuǎn)錄機(jī)制，通過增加細(xì)胞因子的表達(dá)來促進(jìn)肺血管重塑[5]。

2. [Ca2+]i調(diào)節(jié)PASMCs的收縮: 低氧介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流增加可以上調(diào)[Ca2+]i，引起肺動(dòng)脈血管環(huán)收縮效應(yīng)增強(qiáng)，促進(jìn)低氧肺動(dòng)脈高壓的形成。有研究表明，低氧可引起PASMCs膜去極化產(chǎn)生動(dòng)作電位，細(xì)胞膜對(duì)Ca2+的通透性增加，[Ca2+]i增加，PASMCs收縮，而細(xì)胞膜去極化和血管收縮效應(yīng)均可被Ca2+拮抗劑抑制，這提示低氧可直接作用于PASMCs膜上的鈣通道，從而引起肺血管的收縮[6]。[Ca2+]i的升高促使Ca2+/CaM(calmodulin，鈣調(diào)蛋白)復(fù)合物形成，隨后激活肌球蛋白輕鏈磷酸酯酶 (myosin light chain phosphatase，MLCP)，導(dǎo)致肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)磷酸化，最終啟動(dòng)肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白收縮裝置引起PASMCs收縮[7]。

3. [Ca2+]i調(diào)節(jié)PASMCs的增殖: [Ca2+]i升高可以觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)增殖相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)PASMCs增殖[8]。低氧同樣可以激活多種因子和信號(hào)通路參與介導(dǎo)PASMCs增殖的發(fā)生發(fā)展，如MEK/ERKl，2，骨形態(tài)形成蛋白4(bone morphogenetic protein，BMP4)，內(nèi)皮素-1 (endothelin-1, ET-1)和血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)等。缺氧能夠通過MEK/ERKl，2信號(hào)通路活化鈣敏感受體，介導(dǎo)PASMCs 內(nèi)[Ca2+]i升高，在肺動(dòng)脈增殖過程中發(fā)揮重要作用[9]。Lu等[10]研究BMP4對(duì)大鼠遠(yuǎn)端PASMCs增殖的作用機(jī)制中發(fā)現(xiàn)：BMP4可能通過上調(diào)PASMCs中TRPC1，TRPC4，TRPC6的mRNA和蛋白水平的表達(dá)，導(dǎo)致SOCC及基礎(chǔ)[Ca2+]i增加，最終促進(jìn)肺血管重塑、肺動(dòng)脈高壓形成。李積鳳等[11]認(rèn)為低氧可使人PASMCs內(nèi)的Ca2+呈時(shí)間依賴性的增高，并引起NFATc3轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，促使PASMCs增殖相關(guān)基因表達(dá)，導(dǎo)致PASMCs增殖。

Ca2+可通過多種途徑調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，在PASMCs的增殖和生長中發(fā)揮重要作用。升高的[Ca2+]i不僅可以使細(xì)胞核內(nèi)Ca2+濃度的增加，促進(jìn)處于休眠狀態(tài)的PASMCs的增殖分裂[12]；也能激活Ca2+敏感蛋白的活性，參與上調(diào)c-fos和c-jun原癌基因的表達(dá)，促使ET-1和PDGF的合成增加，蛋白質(zhì)、脂類合成功能增強(qiáng)，最終導(dǎo)致PASMCs的增殖和低氧性肺血管重塑[13]。

二、PASMCs內(nèi)PKC的特征及其調(diào)控作用

1. PKC的生物學(xué)特征: PKC是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，參與調(diào)控PASMCs的收縮、增殖等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路?，F(xiàn)已知PKC至少有10種亞型，根據(jù)它們的分子結(jié)構(gòu)和對(duì)激活劑的敏感性分為三個(gè)亞組：經(jīng)典型PKC(cPKCα, βⅠ, βⅡ和γ)，需要鈣離子和二酰甘油(Diacylglycerol，DAG)激活；新奇型PKC(nPKCδ, ε, η和θ)；非典型性PKC(aPKCλ/ι和ζ )，它們廣泛分布于細(xì)胞的胞質(zhì)中且保持無活性狀態(tài)，經(jīng)低氧等外界刺激后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)發(fā)揮作用[14]。在整體動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)研究中，我們應(yīng)用免疫印跡和免疫組化的技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中有cPKC(α, βⅠ, βⅡ)，nPKC(δ, ε, ↑)的表達(dá)[15]。PKC的多種亞型可通過調(diào)節(jié)Ca2+通道活性，改變PASMCs膜電位水平，介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)的PASMCs收縮、增殖、分化和凋亡，參與低氧肺動(dòng)脈高壓肺血管收縮和重構(gòu)。

2. PKC調(diào)節(jié)PASMCs的收縮: Tsai等[16]將低氧暴露時(shí)肺血管的收縮分為兩個(gè)時(shí)相，第一時(shí)相發(fā)生在低氧暴露的1～3 min，為肺血管阻力快速上升期；第二時(shí)相發(fā)生在低氧暴露的10～15 min，肺血管阻力緩慢進(jìn)行性增高。第一時(shí)相肺動(dòng)脈短暫性收縮主要依賴PASMCs內(nèi)[Ca2+]i的升高，而第二時(shí)相肺動(dòng)脈持續(xù)性收縮可能為PKC信號(hào)通路的激活所致。其中第二時(shí)相可被PKC抑制劑(chelerythrine)阻斷，這表明PKC參與了低氧誘導(dǎo)的肺血管收縮。有研究表明，低氧時(shí)PASMCs中PKCα、PKCε可以激活RhoA/ROCK，從而抑制MLCP，進(jìn)而促進(jìn)PASMCs的收縮[17]。也有學(xué)者認(rèn)為PKC可以通過磷酸化CPI-17來抑制MLCP，使MLCP和肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)失衡，最終使MLC磷酸化導(dǎo)致PASMCs收縮[18]。

3. PKC調(diào)節(jié)PASMCs的增殖: Dempsey EC等發(fā)現(xiàn)低氧可以激活PKCα促進(jìn)PASMCs增生[19]。近幾年也有研究發(fā)現(xiàn)，PKC表達(dá)上調(diào)和功能活化本身不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖，但PKC的活化通過其下游的一系列信號(hào)傳導(dǎo)途徑促使PASMCs的異常增殖，這可能是低氧參與肺血管重構(gòu)的重要機(jī)制之一[20]。在體外培養(yǎng)的人PASMCs試驗(yàn)中有研究表明，低氧可使PKCβ-NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道激活，活化的核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-κB ，NF-κB)從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，認(rèn)為PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道可能通過活化NF-κB參與缺氧性肺血管重建的過程，PKC活性抑制能使人PASMCs增殖相關(guān)基因表達(dá)減少，PASMCs增殖作用減弱[21]。

三、PASMCs內(nèi)PKC與Ca2+的相互作用

低氧等刺激細(xì)胞外活性物質(zhì)和G蛋白偶聯(lián)受體都可激活磷脂酶C(phosphoinositol-spscific phospholipase C, PLC)水解PIP2導(dǎo)致脂質(zhì)第二信使三磷酸肌醇(inositol-1,4,5, triphosphate, IP3)和二酰甘油(diacylglycerol, DAG)的產(chǎn)生。IP3可以與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的IP3受體結(jié)合，而DAG可直接激活內(nèi)源性PKC。目前越來越多的研究證實(shí)Ca2+和PKC信號(hào)通路之間存在相互作用。[Ca2+]i是經(jīng)典型PKC的輔因子，增加的[Ca2+]i可直接激活PKC，且PKC介導(dǎo)的磷酸化調(diào)節(jié)Ca2+通道活性。[Ca2+]i和PKC的相互作用啟動(dòng)了PASMCs收縮、增殖的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。一些學(xué)者對(duì)活性氧化物(reactive oxygen species, ROS)在低氧肺動(dòng)脈高壓的研究中發(fā)現(xiàn)：低氧暴露可以促進(jìn)PASMCs中線粒體ROS的產(chǎn)生，隨后ROS作為一種重要的信號(hào)因子參與[Ca2+]i的升高和PKC的激活，從而誘導(dǎo)低氧肺動(dòng)脈高壓的形成[22]。

1. PKC對(duì)[Ca2+]i的影響

(1)PKC能夠上調(diào)PASMCs 內(nèi)[Ca2+]i： 有研究認(rèn)為PKC信號(hào)通路可以通過增加[Ca2+]i而促進(jìn)低氧PASMCs的增殖[20]。低氧能激活PASMCs的PKC信號(hào)通路，上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1、NF-κB的合成，最終導(dǎo)致Kv通道表達(dá)減少和活性下降[23]，使PASMCs膜去極化，Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致[Ca2+]i升高從而促使PASMCs的增殖[24]。PKC信號(hào)通路除了能夠降低Kv通道的表達(dá)，也可以激活TRPC，間接升高PASMCs 內(nèi)[Ca2+]i。ET-1可以通過第二信使DAG激活PASMCs內(nèi)PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促使促使TRPC通道開放，[Ca2+]i增高，TRPC通道激活作用可被PKC抑制劑或TRPC1抗體所拮抗，表明ET-1依賴PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促使PASMCs內(nèi)[Ca2+]i升高[25]。

最近有研究表明，慢性低氧PASMCs中ET-1與其受體結(jié)合后，可以通過激活PKC，活化Rho/Rho激酶信號(hào)，使VDCC通道開放，[Ca2+]i增高。PKC 激動(dòng)劑PMA能夠模擬ET-1 的作用促進(jìn)VDCC通道開放，[Ca2+]i增高，PKC抑制劑則起相反作用[26]。同樣ROS特別是H2O2也可通過PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路刺激鈣通道的開放導(dǎo)致低氧性PASMCs的收縮。低氧可使PASMCs內(nèi)ROS升高，隨之激活PKCα、PKCε，激活的PKC可以抑制Kv通道，使細(xì)胞膜去激活化，L型鈣通道開放鈣離子內(nèi)流，也可與肌質(zhì)網(wǎng)質(zhì)膜上鈣通道蛋白蘭尼堿受體(ryanodine receptors, RyR)結(jié)合，促使肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子釋放，從而使PASMCs內(nèi)[Ca2+]i增加，繼而出現(xiàn)低氧誘導(dǎo)的PASMCs收縮[14]。另外Barman[27]在研究PKC在低氧性肺血管中的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，PKC拮抗劑和Ca2+阻滯劑均可以減弱肺血管的收縮作用，認(rèn)為低氧激活的PKC信號(hào)通路可能引起L-型鈣通道開放，細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致低氧肺血管的收縮。

(2) PKC使PASMCs 對(duì)[Ca2+]i的敏感化增加：近年來也有研究發(fā)現(xiàn)，低氧時(shí)PLC-PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可增強(qiáng)PASMCs收縮成分對(duì)Ca2+的敏感性，使得PASMCs在基礎(chǔ)或低水平[Ca2+]i情況下就可收縮，這是導(dǎo)致低氧性肺血管收縮重要原因[28]。同樣Snow等[29]在大鼠整體模型中發(fā)現(xiàn)，間斷低氧雖然不能使PKC βⅠ, PKCβⅡ的表達(dá)量增多，但可通過增加蛋白PKCβⅠ，PKCβⅡ的膜轉(zhuǎn)位水平來促使其活性增加，同時(shí)激活的PKC使PASMCs對(duì)Ca2+的敏感性增加，通過其受體活化PASMCs內(nèi)的一系列信號(hào)蛋白分子而誘導(dǎo)與收縮、增殖等相關(guān)的反應(yīng)基因表達(dá)，從而參與低氧性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展。

2. [Ca2+]i對(duì)PKC的影響: 經(jīng)典型PKC(cPKCα, βⅠ, βⅡ和γ)的激活需要Ca2+和DG參與[17]。低氧暴露可引起PASMCs內(nèi)[Ca2+]i的顯著升高，[Ca2+]i作為PKC激活的第二信能夠改變Ca2+依賴型PKC的活性。

缺氧是肺動(dòng)脈高壓形成的關(guān)鍵因素，血管內(nèi)皮細(xì)胞在其中起著重要的中介作用。一些報(bào)道認(rèn)為，缺氧可刺激內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌ET-1、PDGF、5-羥色胺和血栓素A2等因子促進(jìn)PASMCs增殖，導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓的形成[30]。ET-1誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的信號(hào)傳導(dǎo)途徑是通過膜表面的G蛋白偶聯(lián)的受體和肌醇磷脂系統(tǒng)使細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i濃度增高，而后激活PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，隨后通過Ras-Raf-MAPK途徑促進(jìn)靶細(xì)胞增殖，導(dǎo)致MAPKs核轉(zhuǎn)位進(jìn)入核內(nèi)激活一系列生長相關(guān)基因的表達(dá)，引起細(xì)胞增殖和生長反應(yīng)[31-33]。低氧等刺激作用于PASMCs時(shí)，經(jīng)G蛋白的偶聯(lián)作用激活膜內(nèi)的PLC，可使第二信使IP3，DG產(chǎn)生。IP3進(jìn)入胞漿促使細(xì)胞內(nèi)Ca2+大量釋放入胞漿，從而使[Ca2+]i增高；而DG與PKC結(jié)合，可降低PKC活化所需的Ca2+濃度，并與Ca2+協(xié)同促使PKC從胞漿轉(zhuǎn)移至胞膜而被激活，促進(jìn)蛋白多糖的合成，從而引起血管平滑肌細(xì)胞增殖。Eon等學(xué)者在低氧小鼠PASMCs中發(fā)現(xiàn)PKC可以激活Na+-H+交換，使細(xì)胞內(nèi)pH增加，升高的pH同樣可以使PASMCs的Kv通道活性下降，使胞漿內(nèi)Ca2+濃度增加，從而產(chǎn)生低氧性PASMCs收縮和增殖[34-38]。

低氧性肺動(dòng)脈高壓是一組由不同發(fā)病機(jī)制引起的以肺血管阻力持續(xù)增加為特征的生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中[Ca2+]i和PKC信號(hào)通路及兩者在低氧PASMCs收縮及增殖中的相互作用仍是近年來研究的熱點(diǎn)。[Ca2+]i和PKC信號(hào)通路在低氧PASMCs的收縮和增殖參與了低氧性肺血管重構(gòu)和肺動(dòng)脈高壓的形成和發(fā)展過程。鑒于Ca2+進(jìn)出細(xì)胞的通道復(fù)雜，PKC多種亞型在生理及病理狀態(tài)的作用不同，且在諸多細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中它們存在復(fù)雜的相互作用，因此僅依賴一種藥物干預(yù)或延緩肺動(dòng)脈高壓的形成效果仍較差。在細(xì)胞水平繼續(xù)探究PASMCs收縮和增殖信號(hào)通路中的Ca2+通道及確切PKC亞型的共同轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以便靶向干預(yù)特異的PKC亞型，為肺動(dòng)脈高壓的臨床治療提供新的方法。

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(本文編輯：王亞南)

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·綜述·

收稿日期：(2015-03-20)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：中圖法分類號(hào)： R563 A

通訊作者：胡曉蕓，Email: huxiaoyunly@sina.com

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.04.025