■曹山川 楊躍奎 劉靜波

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽 621010；2.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都 610000）

仔豬斷奶后腸道消化酶活力降低導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收不良，從而產(chǎn)生腹瀉并影響動物的生長性能。較高的腸道pH值抑制了有益菌的生長，促進(jìn)了有害菌的繁殖，從而導(dǎo)致細(xì)菌性疾病的爆發(fā)。飼料添加抗生素雖然可以減少疾病的發(fā)生和改善動物的生長性能，但產(chǎn)生了抗藥性和藥物殘留等問題。因此，斷奶仔豬飼糧添加有機(jī)酸已成為替代抗生素的一項(xiàng)重要措施[1-3]。

酸化劑具有提高動物腸道消化酶活力、降低腸道pH值、改善動物腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)、提高免疫力和促進(jìn)生長的作用[3]。雖然前期已有許多研究飼糧有機(jī)酸對斷奶仔豬生長性能和腸道健康影響的試驗(yàn)，但不同試驗(yàn)的作用效果之間存在較大差異。原因可能是有機(jī)酸的種類和組合對動物的作用途徑有所不同[4]。因此，有必要研究飼糧有機(jī)酸的種類和組合對斷奶仔豬生長性能和腸道健康的影響。本試驗(yàn)旨在探討飼糧添加苯甲酸、檸檬酸以及復(fù)合酸（苯甲酸與檸檬酸的混合比例為1∶1）對21日齡斷奶仔豬生長性能、養(yǎng)分消化率、消化酶活力、腸道形態(tài)和微生物菌群的影響，為其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所使用苯甲酸和檸檬酸為飼料級商品，產(chǎn)品純度為99.5%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將96頭平均體重為（5.87±0.25）kg的（21±1）日齡斷奶杜×長×大三元雜交仔豬隨機(jī)分為4個(gè)處理組，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4頭豬（公、母各半）。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，苯甲酸組在基礎(chǔ)飼糧中添加0.5%苯甲酸，檸檬酸組在基礎(chǔ)飼糧中添加0.5%檸檬酸，復(fù)合酸組在基礎(chǔ)飼糧中添加0.25%苯甲酸和0.25%檸檬酸?；A(chǔ)飼糧組成和營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)全期28 d，試驗(yàn)期間動物飼養(yǎng)于保育床內(nèi)，自由采食和飲水，并按照豬場常規(guī)程序進(jìn)行管理和消毒。

1.3 樣品收集

于試驗(yàn)25～27 d早上收集動物排出的新鮮糞便樣本，添加10%鹽酸和甲苯混合后-20℃冰箱保存待測。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)在各處理組的每個(gè)重復(fù)分別選取1頭接近平均體重的閹公豬，麻醉屠宰后迅速分離腸段，取空腸和盲腸食糜于-80℃冰箱保存后分別用于測定消化酶活力和腸道微生物菌群。切取5 cm左右的十二指腸樣本浸泡于福爾馬林溶液中用于組織形態(tài)學(xué)分析。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長性能

試驗(yàn)期間以圈為單位記錄動物的采食量，用于計(jì)算平均日采食量。在試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)對豬進(jìn)行稱重，用于計(jì)算平均日增重。飼料轉(zhuǎn)化效率由平均日采食量/平均日增重計(jì)算得出。

1.4.2 養(yǎng)分消化率

收集的糞樣于65℃條件下烘干，粉碎混合均勻后待測。以鹽酸不溶性灰分作為內(nèi)源指示劑，計(jì)算粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、干物質(zhì)、粗灰分、鈣和磷的消化率。飼料和糞便中鹽酸不溶性灰分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、干物質(zhì)、粗灰分、鈣和磷的測定方法參考張麗英所述[5]。養(yǎng)分消化率由以下公式計(jì)算得出：

養(yǎng)分消化率（%）=100-A1F2/A2F1×100。

式中：A1——飼料中鹽酸不溶性灰分含量；

A2——糞中鹽酸不溶性灰分含量；

F1——飼料中養(yǎng)分含量；

F2——糞中養(yǎng)分含量。

1.4.3 腸道消化酶活力

稱取少量空腸食糜（約0.5 g）后按質(zhì)量體積比1∶9（g/ml）加入勻漿介質(zhì)后進(jìn)行超聲波勻漿粉碎，低溫2 000 r/min離心10 min后取上清液。選用南京建成生物工程研究所的試劑盒，根據(jù)紫外光分光光度計(jì)測定的吸光值計(jì)算食糜中胰蛋白酶、淀粉酶、乳糖酶和蔗糖酶的酶活力。

1.4.4 腸道形態(tài)學(xué)分析

將腸道修剪成1 cm×1 cm×1 cm大小的樣本后用蒸餾水進(jìn)行沖洗，脫水后用石蠟包埋。石蠟冷卻后將樣本切成5 μm厚的薄片，使用蘇木精-伊紅進(jìn)行染色。在低倍鏡下，使用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)觀察分析15根具有代表性的腸絨毛和隱窩，測定絨毛高度和隱窩深度。

1.4.5 腸道微生物菌群

使用Omega BioTek公司提供的E.Z.N.A.TM stool DNA extracted kit試劑盒提取盲腸食糜中微生物的DNA。擴(kuò)增總細(xì)菌、大腸桿菌、乳酸菌、雙歧桿菌和芽孢桿菌的引物和探針序列參照Fierer等[6]和Qi等[7]設(shè)計(jì)，引物和探針的序列見表2。使用IQ5 real-time PCR detection System（Bio-Rad,CA,USA）進(jìn)行定量RT-PCR擴(kuò)增。具體的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序如前期研究所描述[7]。

表2 PCR擴(kuò)增引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件的GLM模型對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，處理間的差異顯著性使用Duncan's法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均數(shù)±平均標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 有機(jī)酸種類及其組合對仔豬生長性能的影響(見表3)

表3 有機(jī)酸種類及其組合對仔豬生長性能的影響

由表3可知，飼糧添加苯甲酸、檸檬酸和復(fù)合酸對21日齡仔豬斷奶后1～28 d的平均日采食量、平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率無顯著影響（P＞0.05）。

2.2 有機(jī)酸種類及其組合對養(yǎng)分消化率的影響(見表4)

表4 有機(jī)酸種類及其組合對養(yǎng)分消化率的影響(%)

由表4可知，各處理組之間的粗蛋白質(zhì)、干物質(zhì)和粗脂肪消化率無顯著差異（P＞0.05）。與對照組相比，飼糧添加苯甲酸、檸檬酸和復(fù)合酸可顯著提高斷奶仔豬對鈣、磷和粗灰分的消化率（P＜0.05）。

2.3 有機(jī)酸種類及其組合對仔豬腸道消化酶活力的影響(見表5)

表5 有機(jī)酸種類及其組合對仔豬腸道消化酶活力的影響(U/mg)

由表5可知，仔豬腸道胰蛋白酶、淀粉酶、乳糖酶和蔗糖酶的活力不受飼糧添加苯甲酸、檸檬酸和復(fù)合酸的影響（P＞0.05）。

2.4 有機(jī)酸種類及其組合對仔豬腸道形態(tài)的影響（見表6）

由表6可知，苯甲酸組、檸檬酸組和復(fù)合酸組小腸絨毛高度顯著高于對照組（P＜0.05）。與對照組相比，飼糧添加苯甲酸顯著提高小腸絨毛高度/隱窩深度的比例（P＜0.05）。小腸隱窩深度不受飼糧添加有機(jī)酸的影響（P＞0.05）。

表6 有機(jī)酸種類及其組合對仔豬腸道形態(tài)的影響

2.5 有機(jī)酸種類及其組合對仔豬腸道微生物菌群的影響（見表7）

由表7可知，苯甲酸組和復(fù)合酸組盲腸乳酸桿菌數(shù)顯著高于對照組（P＜0.05）。與對照組相比，飼糧添加苯甲酸、檸檬酸和復(fù)合酸顯著降低盲腸大腸桿菌數(shù)（P＜0.05）。飼糧添加有機(jī)酸對仔豬盲腸雙歧桿菌數(shù)、芽孢桿菌數(shù)和細(xì)菌總數(shù)無顯著影響（P＞0.05）。

表7 有機(jī)酸種類及其組合對仔豬腸道微生物菌群的影響（copies/g）

3 討論

早期斷奶是提高母豬繁殖成績的重要手段，但尚未發(fā)育成熟的仔豬消化生理功能導(dǎo)致消化不良、腹瀉以及生長發(fā)育遲緩等問題。胃酸分泌不足，從而無法激活消化酶的活力是早期斷奶仔豬的主要消化功能缺陷。因此，在早期斷奶仔豬飼糧中添加有機(jī)酸等酸化劑已成為改善仔豬消化生理功能、提高免疫力、維持腸道微生物菌群平衡以及促進(jìn)動物生長的重要營養(yǎng)調(diào)控手段。

前期關(guān)于飼糧添加有機(jī)酸對斷奶仔豬生長性能影響的結(jié)果存在一定差異。Kirchgessner等[8]報(bào)道，飼糧添加1%～2%富馬酸可提高斷奶仔豬的養(yǎng)分消化率、采食量、日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率。Giesting等[9]研究指出，飼糧添加2%富馬酸、丙酸或檸檬酸能提高仔豬的飼料轉(zhuǎn)化效率。冷向軍等[10]和刁慧等[11]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加1.5%檸檬酸或0.5%苯甲酸可提高斷奶仔豬平均日增重或飼料轉(zhuǎn)化效率。在本試驗(yàn)條件下，飼糧添加苯甲酸、檸檬酸及復(fù)合酸對仔豬日增重、采食量和飼料轉(zhuǎn)化效率無顯著影響，這與Omogbenigun等[12]的研究結(jié)果一致。導(dǎo)致上述差異的主要原因可能是本試驗(yàn)0.5%的有機(jī)酸添加量低于前期研究。

腸道內(nèi)環(huán)境是影響動物消化酶活力和養(yǎng)分消化率的主要因素，而較低的腸道pH值有利于激活消化酶活力和鈣磷等礦物元素的吸收。刁慧等[11]和Halas等[13]研究表明，飼糧添加0.5%苯甲酸可提高仔豬的粗蛋白質(zhì)、能量、粗脂肪和粗灰分的消化率。Risley等[14]、刁慧等[11]和冷向軍等[10]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧添加檸檬酸、延胡索酸或苯甲酸可提高斷奶仔豬腸道胰蛋白酶、淀粉酶、乳糖酶和蔗糖酶的活力。在本試驗(yàn)中，飼糧添加有機(jī)酸對斷奶仔豬腸道消化酶活力以及粗蛋白質(zhì)、干物質(zhì)和粗脂肪的表觀消化率無顯著影響，但可提高鈣、磷和粗灰分的消化率。本試驗(yàn)研究結(jié)果與前期報(bào)道飼糧添加有機(jī)酸可提高仔豬腸道消化酶活力和養(yǎng)分消化率的結(jié)論存在一定差異，但與Kluge等[15]和Graber等[16]報(bào)道的飼糧添加苯甲酸對仔豬粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和無氮浸出物消化率無顯著影響的結(jié)果一致。添加苯甲酸、檸檬酸及其復(fù)合酸可通過降低腸道pH值提高動物對鈣和磷的消化吸收率，這與Sauer等[17]和刁慧等[11]的研究結(jié)果一致。

動物對腸道養(yǎng)分的吸收受腸道形態(tài)的影響。與Halas等[13]研究結(jié)果一致，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)飼糧添加有機(jī)酸可提高斷奶仔豬的小腸絨毛高度，而苯甲酸組顯著提高絨毛高度和隱窩深度比值。飼糧添加苯甲酸或檸檬酸對小腸絨毛高度和隱窩深度比值的不同影響表明，仔豬腸道形態(tài)可能受飼糧有機(jī)酸種類的影響。前期大量研究指出，飼糧添加不同種類的有機(jī)酸可通過調(diào)控腸道pH值環(huán)境維持微生物菌群的平衡，從而達(dá)到抑制有害菌生長，促進(jìn)有益菌繁殖的目的。Graber等[16]和Kluge等[15]研究表明，飼糧添加0.5%苯甲酸可促進(jìn)斷奶仔豬腸道乳酸桿菌的生長，抑制大腸桿菌的繁殖。Li等[18]和冷向軍等[10]研究報(bào)道，飼糧添加復(fù)合酸或檸檬酸導(dǎo)致仔豬腸道有益菌乳酸桿菌數(shù)量增加，而致病性大腸桿菌數(shù)顯著下降。在本試驗(yàn)中，飼糧添加苯甲酸、檸檬酸和復(fù)合酸均可顯著抑制大腸桿菌的生長，并促進(jìn)乳酸桿菌的增殖，這與前期研究結(jié)果一致。

綜合本試驗(yàn)和前期研究結(jié)果可以看出，飼糧添加不同種類有機(jī)酸對斷奶仔豬鈣磷消化率、腸道形態(tài)和微生物菌群結(jié)構(gòu)的正面影響效果比較一致，但對消化酶活力、粗蛋白質(zhì)消化率以及生長性能的影響效果在不同研究之間存在一定差異。此外，本試驗(yàn)未觀察到有機(jī)酸復(fù)合添加的效果優(yōu)于單獨(dú)添加，這與前期研究結(jié)果之間存在一定差異[19]，導(dǎo)致上述差異的主要原因是不同試驗(yàn)選用有機(jī)酸的種類和添加劑量不同。因此，后期研究應(yīng)進(jìn)一步探索不同有機(jī)酸復(fù)合添加的協(xié)同效應(yīng)以及合理的添加劑量和比例。