■王夢(mèng)霞 朱曉玲 王君如 劉嘉佩 劉雪珠

（浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022）

大黃魚（Larimichthys crocea）隸屬硬骨魚綱、鱸形目、石首魚科、黃魚屬，主要分布在我國(guó)黃海南部、東海、臺(tái)灣海峽以及南海。自1995年起，人工養(yǎng)殖大黃魚逐漸產(chǎn)業(yè)化[1]，作為我國(guó)近海的主要經(jīng)濟(jì)魚類，大黃魚也是浙江省海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖主要品種之一。但隨著養(yǎng)殖業(yè)的大規(guī)模發(fā)展，各種病原性魚病日漸泛濫，大黃魚疾病的致病因素繁多，微生物引起的大黃魚魚病可概括為三類：病毒性魚病、寄生性魚病及細(xì)菌性魚病[2]。弧菌是危害經(jīng)濟(jì)魚、蝦、蟹、貝類的主要病原菌，病原性弧菌的感染已成為引起大黃魚疾病的重要原因?？股氐氖褂贸蔀榻鉀Q這一養(yǎng)殖問題的一大較為經(jīng)濟(jì)普遍的方式，但因之而起的抗生素濫用所帶來的威脅卻不容小覷[3]，其往往會(huì)破壞水體中的微生態(tài)平衡,導(dǎo)致耐藥微生物的增加，并使魚體產(chǎn)生藥源性器官損傷[4]。近年來從免疫學(xué)角度進(jìn)行的魚病防治工作主要是將一些病原通過滅活制成疫苗，再通過注射等途徑使魚體對(duì)特定的疾病有一定的抵抗能力[5]。從環(huán)保及科學(xué)養(yǎng)殖的角度出發(fā)，通過微生物技術(shù)制備益生菌制劑不僅可以解決抗生素濫用帶來的問題，防治消化道疾病、幫助消化吸收和刺激免疫系統(tǒng)，還可以改善水體質(zhì)量[6-7]。目前，應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的水產(chǎn)益生菌包括乳酸菌屬、雙歧桿菌屬、弧菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌、硝化菌、光合菌等[8]為數(shù)不多的幾種。近年，Surajit Das等在研究中還發(fā)現(xiàn)一種海洋放線菌屬的鏈霉菌可作為益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用[9]。不過，目前的研究仍未找到針對(duì)大黃魚疾病防治的特異性益生菌。本文用點(diǎn)種法定性初篩、酶標(biāo)法及牛津杯法定量復(fù)篩，從實(shí)驗(yàn)室保存的在海洋生物體中分離得到的未知海洋微生物中篩選對(duì)大黃魚病原性哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）具有較強(qiáng)拮抗作用的拮抗菌，并從抗菌譜、生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)、藥敏檢測(cè)、碳源利用等方面進(jìn)一步分析目的拮抗菌作為益生菌的特征，以期為大黃魚弧菌病防治及益生菌的開發(fā)提供可參考的菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)菌：從舟山海域潮間帶海洋生物體中分離的細(xì)菌、放線菌等。

病原菌：哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）。

指示菌：溶藻弧菌（V.alginolyticus）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus)、創(chuàng)傷弧菌（V.vulnificus）、費(fèi)氏弧菌(V.fischeri)、鰻弧菌(V.anguillarum)。以上各弧菌指示菌由浙江海洋研究所提供。大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，以上指示菌為實(shí)驗(yàn)室用菌，保存于4℃冰箱。

培養(yǎng)基：TCBS培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司。2%NaCl營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、LB固體培養(yǎng)基、高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基、LB營(yíng)養(yǎng)肉湯、明膠培養(yǎng)基、硫化氫培養(yǎng)基、淀粉瓊脂平板均由實(shí)驗(yàn)室配制。

1.2 方法

1.2.1 病原哈維氏弧菌拮抗菌的篩選

參照莫照蘭等[10]的方法進(jìn)行點(diǎn)種法初篩。參照Gram等[11]的方法，根據(jù)酶標(biāo)儀測(cè)得的OD630值定量復(fù)篩拮抗菌。參考劉冬梅等[12]的方法，用牛津杯法定量再篩，確定目的拮抗菌。

1.2.2 生長(zhǎng)曲線繪制

參照Niall等[13]的方法，有改動(dòng)。根據(jù)酶標(biāo)儀所測(cè)OD630值繪制生長(zhǎng)曲線，選取生長(zhǎng)曲線上最陡的7個(gè)點(diǎn)做生長(zhǎng)曲線擬合度直線，直線斜率即為最大生長(zhǎng)率(μ)，直線在X 軸上的截距為延滯生長(zhǎng)期(λ)，生長(zhǎng)曲線穩(wěn)定期切線在Y軸上的截距為最大生物量(A)。根據(jù)公式Td=ln2/μ求得倍增時(shí)間(Td)，根據(jù)公式RI/100=I/(λ×Td)，求得各菌株生長(zhǎng)參數(shù)(RI)。

1.2.3 抗菌譜測(cè)定

測(cè)定兩株目的拮抗菌對(duì)8株指示菌的抗菌情況，采用的牛津杯法類似前文所述。取0.3 ml病原指示菌懸液于培養(yǎng)皿，傾注2%NaCl營(yíng)養(yǎng)瓊脂制成混菌平板。待平板稍凝固后，用鑷子夾取無(wú)菌牛津杯均勻放在平板上。吸取200 μl目的拮抗菌的上清液和菌液于各牛津杯內(nèi)，30℃培養(yǎng)24 h后測(cè)定抑菌圈直徑。

1.2.4 藥敏試驗(yàn)檢測(cè)

參照抗菌藥物藥敏紙片判斷標(biāo)準(zhǔn)（2000年版）介紹，用MH培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基溶化后，制成厚度為4 mm的平板。挑選待測(cè)目的拮抗菌純菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)12 h。用滅菌的棉簽蘸取菌液少許，均勻涂于平板上，待干后，用滅菌鑷子分別取藥敏紙片均勻貼于培養(yǎng)基表面，并用鑷子輕按紙片中心，使其附著嚴(yán)密。30℃倒置培養(yǎng)18 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)直徑，根據(jù)美國(guó)CLSI手冊(cè)中藥敏試驗(yàn)藥敏性判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷目的拮抗菌對(duì)被測(cè)藥物的敏感性。

1.2.5 菌株的形態(tài)觀察及生理生化鑒定

采用插片法進(jìn)行目的拮抗菌株的形態(tài)觀察。將兩株目的拮抗菌X14及X15在高氏1號(hào)培養(yǎng)基中密集劃線接種，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、5、7 d，觀察生長(zhǎng)情況，基內(nèi)菌絲及氣生菌絲等形態(tài)特征。

采用明膠液化，淀粉水解，硫化氫產(chǎn)生及牛奶凝固與胨化及Biomerieux的API試條測(cè)定X14、X15目的拮抗菌的一些生理生化特性。在30℃恒溫培養(yǎng)數(shù)天后觀察試驗(yàn)現(xiàn)象并作記錄。

1.2.6 16S rDNA測(cè)序分析和進(jìn)化樹的構(gòu)建

提取X14、X15菌株的DNA，采用細(xì)菌16S rDNA引物：341F（5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和907R（5'-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3'），一定條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。制備感受態(tài)細(xì)胞、轉(zhuǎn)化、克隆，對(duì)克隆后菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，確保成功獲得轉(zhuǎn)化子。以載體上的引物作為測(cè)序引物序列，委托蘇州金唯智生物測(cè)序公司測(cè)序。菌株16S rDNA測(cè)序結(jié)果同GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中選取的與菌株親緣關(guān)系較近菌株，用MEGA 5.0軟件采取Neighbor-Joining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，1 000次重復(fù)計(jì)算Bootstrap值，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果

2.1 拮抗菌的篩選

用點(diǎn)種法在實(shí)驗(yàn)室保存的65株未知的海洋微生物菌株中，獲得18株出現(xiàn)抑菌圈的初篩拮抗菌。酶標(biāo)法復(fù)篩，從生長(zhǎng)曲線對(duì)比圖1(a,b,c,d)可看出各試驗(yàn)菌的拮抗效果。在試驗(yàn)菌發(fā)酵上清液拮抗下的指示菌生長(zhǎng)曲線居于空白指示菌生長(zhǎng)曲線之下的均可能存在拮抗效果。因此，初步確定X15、Y13、Y26、Y36、Z10、X14、Z5、Z9、Y9、Z11、Y27、Z4、Y25、Y24、Z6、Z1具有對(duì)指示菌哈維氏弧菌的拮抗作用。

圖1 指示菌在試驗(yàn)菌發(fā)酵上清液拮抗下的生長(zhǎng)曲線對(duì)比圖(a,b,c,d)

通過用牛津杯法直接測(cè)量抑菌圈直徑大小，并經(jīng)過計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)分析，計(jì)算均值及標(biāo)準(zhǔn)誤差如表1所示，可間接得出酶標(biāo)法測(cè)得的16株試驗(yàn)拮抗菌對(duì)指示菌哈維氏弧菌的拮抗效果，從而確定最佳目的拮抗菌為X14菌株和X15菌株。

表1 牛津杯法測(cè)得抑菌圈直徑（cm）

2.2 益生菌特征的分析

2.2.1 生長(zhǎng)曲線

如表2所示，列出了從兩株拮抗菌和兩株病原弧菌生長(zhǎng)曲線中推導(dǎo)得到的生長(zhǎng)參數(shù)，從中可看出兩拮抗菌最大生長(zhǎng)率較兩株病原菌大，但最大生物量較兩株病原菌小，延滯期也都較病原菌小，倍增時(shí)間都小于兩株病原菌。RI值較大的菌株具有短的延滯期和短的倍增時(shí)間，具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。兩株拮抗菌在相同的條件下可能較兩株病原菌更具生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，且X14生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)強(qiáng)于X15。

表2 兩株拮抗菌和兩株病原弧菌生長(zhǎng)曲線參數(shù)

2.2.2 拮抗菌抗菌譜

根據(jù)試驗(yàn)測(cè)得的抑菌圈直徑，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差，X14及X15菌株的抗菌譜如表3所示?？咕V研究表明，對(duì)病原哈維氏弧菌具有拮抗作用的X14、X15菌株，對(duì)其余8株試驗(yàn)病原指示菌也表現(xiàn)出大小不一的拮抗作用。目的拮抗菌的菌液及無(wú)菌發(fā)酵上清液均具有抗所列病原指示菌的作用，但X14菌株在拮抗副溶血弧菌時(shí)，發(fā)酵上清液的拮抗效果明顯好于菌液；而X15菌株在拮抗枯草芽孢桿菌時(shí)上清液好于菌液，作用大腸桿菌時(shí)，菌液拮抗效果明顯優(yōu)于發(fā)酵上清液。X14對(duì)費(fèi)氏弧菌的抗性相對(duì)最優(yōu)，X15對(duì)枯草芽孢桿菌的抗性最優(yōu)?？傮w而言，兩株目的拮抗菌體現(xiàn)出一定的抗菌廣譜性。

表3 X14、X15菌株發(fā)酵上清液及菌液抗菌譜

2.2.3 藥敏性

參考美國(guó)CLSI手冊(cè)中藥敏試驗(yàn)藥敏性判斷標(biāo)準(zhǔn)，兩株分離得到的菌株X14及X15對(duì)四環(huán)素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、氨芐西林、頭孢噻肟、復(fù)方新諾明、頭孢噻吩、利福平、萘啶酸、阿莫西林10種抗菌藥物敏感，具體抑菌環(huán)直徑及敏感性等級(jí)見表4。

表4 X14、X15菌株對(duì)10種抗菌類藥物的敏感性

2.3 目的拮抗菌鑒定結(jié)果

2.3.1 拮抗菌株形態(tài)和生理生化特征

將篩選到的目的拮抗菌X14、X15菌株在高氏1號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，均生長(zhǎng)良好，形成發(fā)達(dá)的氣生菌絲和基內(nèi)菌絲，氣生菌絲呈灰白色，基內(nèi)菌絲呈黃灰色。菌株X14孢子絲呈簇狀，孢子卵形；菌株X15孢子絲為微螺旋形，孢子圓形。兩菌株在高氏1號(hào)培養(yǎng)基上均產(chǎn)生明顯的可溶性色素。

用Biomerieux的API試條測(cè)定X14、X15生理生化特性中，發(fā)現(xiàn)兩菌株都能利用多種糖類，碳源譜利用比較廣。在10種糖類中，X14可以利用7種，X15可以利用8種，其結(jié)果及其余各項(xiàng)生理生化指標(biāo)測(cè)定由表5所示。

表5 X14、X15菌株生理生化測(cè)定結(jié)果

2.3.2 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)克隆和測(cè)序得到兩株拮抗菌X14和X15的部分16S rDNA基因序列，序列長(zhǎng)度分別為568 bp和584 bp。將上述16S rRNA基因序列與Genebank中所有已登錄的基因序列進(jìn)行同源性比較結(jié)果顯示與16S rDNA基因同源性達(dá)99%以上的菌株均來自鏈霉菌屬（Streptomyces），菌株16S rDNA測(cè)序結(jié)果同Gen-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中選取的與菌株親緣關(guān)系較近菌株，用MEGA 5.0軟件采取Neighbor-Joining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)一步建立系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖5、6所示。結(jié)果顯示菌株X15與灰平鏈霉菌（Streptomyces griseoplanus）相似性最高，但結(jié)合形態(tài)特征及理化性質(zhì)未能確定兩菌株到種。

圖2 X14菌株16S rDNA及最大同源性序列系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

目前的研究還未找到專門針對(duì)大黃魚的益生菌，我們選擇海洋動(dòng)物體上獲得的一些海洋微生物作為試驗(yàn)菌，篩選大黃魚病原哈維氏弧菌的拮抗菌株。

圖3 X15菌株16S rDNA及最大同源性序列系統(tǒng)發(fā)育樹

①用點(diǎn)種法定性初篩，從65株海洋菌株中篩選出18株病原哈維氏弧菌的拮抗菌，再用酶標(biāo)法和牛津杯法進(jìn)一步定量復(fù)篩后，得到2株保持較好拮抗效果的菌株X14及X15。一些菌株在篩選過程中抗菌效果減弱的原因可能是在培養(yǎng)基上經(jīng)多次傳代或多次低溫保種，出現(xiàn)適應(yīng)或遺傳變異等現(xiàn)象使得這些菌株的拮抗作用不穩(wěn)定。作為益生菌，能長(zhǎng)期保持對(duì)特定菌株拮抗作用是其必備條件之一，因此在復(fù)篩中只表現(xiàn)出暫時(shí)抗性的菌株不適合作為益生菌。

②抗菌譜結(jié)果顯示，兩株菌對(duì)海洋環(huán)境中廣泛存在的溶藻弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌、費(fèi)氏弧菌等5種致病弧菌及普通致病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均具有拮抗作用，符合作為益生菌具有廣譜抑菌活性的要求。還可看出，無(wú)菌上清液和菌液在不同菌株上的拮抗效果不盡相同，若在實(shí)際應(yīng)用中還需針對(duì)不同菌株使用不同益生菌及其制劑。

③從生長(zhǎng)參數(shù)結(jié)果可知，兩株拮抗菌在相同的條件下較兩株病原菌更具生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，且X14的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)強(qiáng)于X15。益生菌往往與餌料一起投喂，而魚類在與環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換時(shí)速度相對(duì)較快，與食物一起進(jìn)入腸道的益生菌如果不能較快地生長(zhǎng)及粘附很容易被排出體外而流失。魚類腸道益生菌必須具有較大的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，利用較短的時(shí)間快速大量繁殖，一定數(shù)量的菌體才能更好地在腸道內(nèi)與腸黏液粘附，產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)拮抗病原菌[14]。

④水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的益生菌含有抗生素抗性基因易導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖中出現(xiàn)多重耐藥病菌，而篩選得到的兩目的菌株藥敏試驗(yàn)均顯示為敏感型，不具抗藥性。有研究證明水產(chǎn)動(dòng)物出現(xiàn)抗藥性是因?yàn)楹铣煽股貫E用，直接使用鏈霉菌作為益生菌可降低抗性基因橫向轉(zhuǎn)移率[14]。

⑤兩菌株在生理生化測(cè)定中顯示均能利用多種糖類，且X15菌株具有有效分解淀粉的能力，而大多數(shù)海洋魚類對(duì)高糖餌料中糖類的處理能力很弱，消化道中淀粉酶的活性很低，餌料中的淀粉在營(yíng)養(yǎng)上基本是無(wú)用成分[15]，若能將所篩選的菌株作為益生菌用于大黃魚腸道，其較廣的糖類利用及較強(qiáng)的淀粉酶活性可以幫助大黃魚利用餌料中的糖類淀粉，有助于減輕大黃魚肝臟糖類積蓄的負(fù)擔(dān)，利于大黃魚的正常代謝功能。

⑥經(jīng)16S rDNA基因同源性分析并結(jié)合形態(tài)及生理生化結(jié)果，兩株海洋微生物均屬放線菌中的鏈霉菌屬（Streptomyces），雖然目前實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用較為普遍的水產(chǎn)益生菌有乳酸菌、芽孢桿菌、假單胞菌、弧菌等細(xì)菌性微生物，但近年來，海洋放線菌也逐漸被應(yīng)用于預(yù)防及治療水產(chǎn)養(yǎng)殖致病菌引起的病害。Das等研究報(bào)道，海洋鏈霉菌可作為益生菌用來促進(jìn)斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)的生長(zhǎng)[9]。游建嵐等的研究表明，利用海洋放線菌治療和預(yù)防病原性弧菌引起的蝦病害，其能抑制弧菌菌膜的形成，在養(yǎng)殖池水中能產(chǎn)生抗菌類物質(zhì)并高效分解淀粉、蛋白等大分子，還可以產(chǎn)生耐熱耐干燥的孢子等優(yōu)點(diǎn)，海洋放線菌具有成為水產(chǎn)益生菌的潛力[16-17]。

4 結(jié)論

用點(diǎn)種法定性初篩、酶標(biāo)法和牛津杯法定量復(fù)篩，從海洋生物體上獲得的65株菌中篩選出2株具有較高抗病原哈維氏弧菌的菌株X14、X15為目的拮抗菌。在對(duì)兩株益生菌特征分析的研究中，抗菌譜及生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示菌株X14、X15具有較廣的抗菌性，且兩株拮抗菌在相同的條件下可能較兩株病原菌更具生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌株對(duì)四環(huán)素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、氨芐西林、頭孢噻肟、復(fù)方新諾明、頭孢噻吩、利福平、萘啶酸、阿莫西林等10種藥物敏感。16S rDNA基因同源性分析的結(jié)果顯示與X14、X15同源性達(dá)99%以上的菌株均來自鏈霉菌屬（Streptomyces），進(jìn)一步建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示菌株X15與灰平鏈霉菌（Streptomyces griseoplanus）相似性最高，但結(jié)合形態(tài)特征及理化性質(zhì)不能將兩菌株確定到種。篩選得到的菌株X14、X15在拮抗病原哈維氏弧菌、抗菌譜、生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)及藥敏性等方面均初步滿足益生菌的篩選條件。