■鄒林源 張鐵鷹 齊志國 杜家菊 王德山

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.北京市畜牧總站，北京 100029）

羽毛粗蛋白含量可達(dá)85%，其中胱氨酸含量最高達(dá)4.65%，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的含量次之，維生素B12以及微量元素的含量也很高[1-2]，且成本低廉，是較為廉價的一種蛋白質(zhì)資源。但羽毛蛋白主要以角蛋白為主，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，難于被動物消化利用。羽毛等天然角蛋白除肽鍵外，在分子內(nèi)和分子間存在二硫鍵、氫鍵、離子鍵(即鹽式鍵)、配位鍵和范德華力等多種鍵能，三維構(gòu)象高度交聯(lián)、穩(wěn)定。通常疏水基團(tuán)暴露在外，親水集團(tuán)隱藏在角蛋白內(nèi)部，疏水作用使角蛋白難溶于水。動物胃蛋白酶和胰蛋白酶很難將其水解、消化[3]。一些觀點(diǎn)認(rèn)為角蛋白酶可獨(dú)自完成角蛋白的水解，也有一些觀點(diǎn)認(rèn)為角蛋白降解過程是由二硫鍵還原酶或還原劑啟動，協(xié)助角蛋白酶來完成。有關(guān)角蛋白酶可單獨(dú)完成角蛋白徹底水解的研究報(bào)道較少[4-5]，大多角蛋白酶不能單獨(dú)完成角蛋白的徹底水解過程[6-8]。一些研究表明，加快二硫鍵的還原可影響角蛋白的降解效率[9-12]。生長在羽毛介質(zhì)中的弧菌kr2可產(chǎn)生巰基說明了存在二硫鍵被還原[13]。羽毛上Streptomyces pactum和Bacillus megaterium的生長過程中也均發(fā)現(xiàn)存在二硫鍵還原反應(yīng)[14-15]。這說明二硫鍵還原可能是微生物降解角蛋白的關(guān)鍵步驟。研究表明，角蛋白降解菌胞外具有還原二硫鍵的酶活性低于胞內(nèi)。谷胱甘肽還原酶屬于二硫鍵還原酶類，具有二硫鍵還原酶活性。Serrano等（1984）[16]對藍(lán)藻菌中的谷胱甘肽還原酶進(jìn)行了分離純化，發(fā)現(xiàn)純化后的酶蛋白對氧化型谷胱甘肽的還原活力為249.2 U/mg，二硫鍵還原活性較高。本研究擬以具有較高二硫鍵還原活性的角蛋白降解菌Stenotrophomonas maltophilia為出發(fā)菌株，通過對其谷胱甘肽還原酶基因克隆和表達(dá)，獲得重組谷胱甘肽還原酶，并對其二硫鍵還原酶活性、酶學(xué)性質(zhì)和促進(jìn)角蛋白酶水解羽毛角蛋白的效果等進(jìn)行研究，探討Stenotrophomonas maltophilia胞內(nèi)液可明顯促進(jìn)胞外液水解角蛋白的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Stenotrophomonas maltophilia 10號菌為本實(shí)驗(yàn)室前期篩選保存野生菌株，大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)保存感受態(tài)。角蛋白酶K由本實(shí)驗(yàn)室從地衣芽孢桿菌CP-16中克隆表達(dá)純化得到[17]。

pMD19-T購自寶生物工程（大連）有限公司，pET-22b為本實(shí)驗(yàn)室保存。

DNA聚合酶（PrimeSTAR HS和LA Taq）、T4 DNA連接酶和DNA Marker均購自寶生物工程（大連）有限公司；不同酶切位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶均購自NEB公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司；鎳柱純化蛋白試劑盒以及Bradford蛋白濃度測定試劑盒均購自北京康為世紀(jì)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LB液體培養(yǎng)基及固體培養(yǎng)基參考王德山（2014）[17]的配制方法。

1.2.2 目的基因克隆

使用購自北京博邁德公司的細(xì)菌基因組提取試劑盒提取Stenotrophomonas maltophilia的基因組。

在 Uniprot（http：//www.uniprot.org/）中搜集 Stenotrophomonas maltophilia中谷胱甘肽還原酶蛋白質(zhì)序列，根據(jù)所得序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增全長基因，正反向引物分別引入NcoI、XhoI酶切位點(diǎn)，引物如下：

正向引物：CATGCCATGGCAAGCACTGCACC

反向引物：CCGCTCGAGGCGCATCAGCAC

PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性98℃ 1 min，變性94℃10 s，退火55 ℃ 15 s，延伸72℃ 2 min，共30個循環(huán)；總延伸72℃5 min。其中退火溫度可根據(jù)不同引物的特點(diǎn)進(jìn)行調(diào)整。擴(kuò)增完成后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

DNA酶切、連接和轉(zhuǎn)化等分子操作技術(shù)參照王德山（2014）及購買試劑盒說明書。

將電泳驗(yàn)證后的PCR產(chǎn)物與載體pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選和菌落PCR驗(yàn)證后將陽性克隆測序。重組基因序列測定由北京博邁德公司完成。將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對分析并與目的基因MEGA比對檢測是否有突變基因。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

分別用NcoI、XhoI雙酶切pMD19-T-Glr及表達(dá)載體pET-22b，純化后于16℃連接過夜。將連接的重組質(zhì)粒pET-22b-Glr轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。將篩選的陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG（0.2 M，30℃，4 h）誘導(dǎo)后，收集菌體，超聲破碎（0.4 V電壓）過Ni2+柱純化。

1.2.4 重組蛋白SDS-PAGE分析

SDS-PAGE參照北京康為世紀(jì)公司試劑盒說明書，分離膠濃度10%，濃縮膠濃度5%。

1.2.5 二硫鍵還原酶活性和角蛋白酶活性測定

參照王德山（2014）的方法進(jìn)行檢測。蛋白濃度測定采用Bradford法。

1.2.6 重組谷胱甘肽還原酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.6.1 最適酶促反應(yīng)pH值的測定

分別以不同pH值緩沖液作為二硫鍵還原酶活性測定中的緩沖體系，檢測酶的二硫鍵還原酶活性，將其中的最高酶活定義為100%，其他條件下的酶活以相對酶活表示，得到重組酶的最適反應(yīng)pH值。不同pH值緩沖液采用：檸檬酸-Na2HPO4緩沖液（pH值3.0～8.0），甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（0.2 M，pH值9～11.0）。

1.2.6.2 最適酶促反應(yīng)溫度測定

在不同溫度條件下（30～70℃，溫度間隔為5℃）檢測酶的二硫鍵還原酶活性，將其中的最高酶活定義為100%，其他條件下酶活以相對酶活表示，得到重組酶的最適反應(yīng)溫度。

1.2.7 重組酶對角蛋白酶K降解羽毛角蛋白的研究

將重組酶稀釋為pH值8.0二硫鍵還原酶酶活為0.04 U/ml，測定在pH值8.0，55℃條件下不同組合時的角蛋白酶活性。各酶間組合見表1。

表1 酶組合中不同酶添加體積比例

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因克隆

以Stenotrophomonas maltophilia基因組DNA為模板，擴(kuò)增獲得全長為1 359 bp的基因序列。將測序結(jié)果與GenBanK已知序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明所得序列為目的基因全長序列，該酶為。序列如下：

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將目的基因與質(zhì)粒分別經(jīng)NcoI、XhoI限制性內(nèi)切酶雙酶切后，連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)，PCR鑒定得到連接正確的轉(zhuǎn)化子。

2.3 目的基因在大腸桿菌中表達(dá)與鑒定

將鑒定正確的BL21（DE3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，收集菌體，超聲破碎過Ni2+柱純化，檢測二硫鍵還原酶活性為1.85 U/mg。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，該重組酶分子量為48.8 kDa。

圖1 重組酶SDS-PAGE分析

2.4 重組酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 重組酶最適酶促反應(yīng)pH值

分別以不同pH緩沖液為測定酶活性中的緩沖體系，檢測二硫鍵還原酶活性，獲得酶促反應(yīng)最適pH值（見圖2）。由圖2可見，該重組酶最適反應(yīng)pH值為6.0。該酶除了pH值5～8間，其他pH值下均保留不足20%的活性，該酶適宜pH值范圍較窄，屬于偏中性的還原酶。

圖2 酶促反應(yīng)最適pH值

2.4.2 重組酶最適酶促反應(yīng)溫度

重組酶最適反應(yīng)溫度測定結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，該重組酶最適反應(yīng)溫度為40℃，在30～60℃之間該酶活性均能保持在50%以上，說明該酶的溫度適應(yīng)范圍較寬，具有一定的耐溫性。

圖3 最適酶促反應(yīng)溫度

2.5 重組酶對角蛋白酶K降解羽毛角蛋白的研究

表2 羽毛角蛋白降解結(jié)果

由表2可知，單獨(dú)添加角蛋白酶K的羽毛角蛋白酶水解活性為65.6 U/ml，而單獨(dú)添加重組谷胱甘肽還原酶的羽毛角蛋白酶水解活性為36.5 U/ml。同時添加2種酶后羽毛角蛋白酶活性升至117.8 U/ml。這表明該酶可以明顯提高角蛋白酶降解羽毛角蛋白的活性，羽毛角蛋白活性比單獨(dú)添加2種酶提高了15%。由此可見，角蛋白降解菌Stenotrophomonas maltophilia胞內(nèi)液具有促進(jìn)胞外液水解角蛋白活性可能是其胞內(nèi)存在具有二硫鍵還原活性的酶蛋白。

3 討論

羽毛主要由角蛋白（91%）組成，其表面角質(zhì)層主要由高級脂肪酸和高級脂肪醇等脂類物質(zhì)形成的動物蠟組成（1%）[18-19]。這些脂質(zhì)與底層蛋白分子共價結(jié)合，疏水基外露，呈現(xiàn)出極強(qiáng)的疏水性。而與其他蛋白纖維相比，角蛋白半胱氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和絲氨酸含量高，其中約22%為疏水性，8.85%的半胱氨酸。角蛋白中半胱氨酸之間形成二硫鍵，從而使角蛋白的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定[20]，常見蛋白酶并不能將其徹底水解，如胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等。然而，二硫鍵還原可顯著影響角蛋白的降解，打開二硫鍵可能是水解角蛋白的關(guān)鍵步驟之一。

Yamamura等（2002）[21]從鹿皮毛中分離出角蛋白降解菌Stenotrophomonas sp.strain D-1可以分泌兩種胞外蛋白：水解蛋白和二硫鍵還原蛋白。其生化特性顯示這個蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶，二硫鍵還原蛋白可能屬于二硫鍵還原酶。這些酶的單體無角蛋白降解活性。然而，這兩種酶的混合物對角蛋白的降解力比單個蛋白酶提高了50多倍，比蛋白酶K組合提高了2倍。此外，二硫鍵還原酶可提高Bacillus subtilis蛋白酶水解角蛋白的活性17倍，促進(jìn)胰蛋白酶和蛋白酶K的水解活性也分別達(dá)6倍和2倍。Yamamura等（2002）角蛋白酶的活性也能被添加的β-ME、DTT和GSH等還原劑所激活，其可分別被提高約2.5倍、45倍和1.5倍，這表明還原性物質(zhì)在角蛋白降解中也具有重要的作用。Rahayu等（2012）分離出的芽孢桿菌（Bacillus sp.MTS）可以有效分解雞的羽毛。從該菌中純化了胞外角蛋白降解酶和二硫鍵還原酶并檢測了這些酶的酶學(xué)性質(zhì)以及他們的協(xié)同作用。研究發(fā)現(xiàn)，無論與單體酶活性、蛋白酶K以及其他純化后角蛋白酶活性相比，純化角蛋白酶與純化二硫鍵還原酶組合水解角蛋白底物（羽毛和羊毛）的酶活性均有較大提高。利用掃描電子顯微鏡觀察了這2種酶在羽毛上具有相互協(xié)同作用。

本實(shí)驗(yàn)成功克隆并表達(dá)了Stenotrophomonas malto-philia中谷胱甘肽還原酶基因，雖然該酶二硫鍵還原酶的比活力僅為1.85 U/mg，但其角蛋白酶水解羽毛的效率提高15%。這也進(jìn)一步證實(shí)了齊志國（2012）和Yamamura等（2002）報(bào)道的細(xì)菌胞內(nèi)液具有促進(jìn)胞外液角蛋白水解活性，且可能主要是一些具有二硫鍵還原活性的酶參與其中。本研究發(fā)現(xiàn)，該重組酶在30～60℃之間該酶的活性均能保持在50%以上，說明該酶的溫度適應(yīng)范圍較寬，具備較好的工業(yè)應(yīng)用前景。但適宜pH值范圍較窄，需要后期通過基因改良等技術(shù)進(jìn)一步改善這一不足。

4 結(jié)論

以上研究進(jìn)一步說明，微生物高效降解角蛋白的過程并非由角蛋白酶獨(dú)自完成，而是一個角蛋白酶和具有二硫鍵還原活性的多種酶共同參與的生物反應(yīng)過程。本研究結(jié)果一方面揭示了Stenotrophomonas maltophilia胞內(nèi)液具有促進(jìn)胞外液角蛋白水解活性的內(nèi)在機(jī)制，同時也為今后實(shí)現(xiàn)角蛋白生物酶解奠定了理論基礎(chǔ)。