沈納　白廣平　高天樂　黃新生　李俊

(1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院耳鼻咽喉科，上?！?00032；

2. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院耳鼻咽喉科，上?！?01700)

·論著·

上調(diào)miR-519d對喉鱗癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響

沈納1白廣平2高天樂2黃新生1李俊2

(1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院耳鼻咽喉科，上海200032；

2. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院耳鼻咽喉科，上海201700)

摘要目的：研究miR-519d對喉鱗癌細(xì)胞增殖及凋亡的調(diào)控作用。方法： 采用RT-PCR、Western印跡等技術(shù)檢測人喉癌上皮細(xì)胞株Hep-2及人支氣管上皮細(xì)胞(human bronchial epithelium cell，HBE)中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)以及miR-519d的表達(dá)情況；通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)Hep-2細(xì)胞株中miR-519d的表達(dá)后，采用細(xì)胞增殖及凋亡檢測技術(shù)觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞與對照細(xì)胞的增殖及凋亡情況。結(jié)果： STAT3 mRNA在Hep-2中的表達(dá)明顯高于其在HBE細(xì)胞中的表達(dá)(P<0.05)，而miR-519d在Hep-2中的表達(dá)明顯低于其在HBE中的表達(dá)(P<0.05)。STAT3在轉(zhuǎn)染miR-519d后的Hep-2細(xì)胞中的表達(dá)明顯下降(P<0.05)。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)0～7 d，轉(zhuǎn)染后Hep-2細(xì)胞的增殖率明顯低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(P<0.05)。 轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)染miR-519d的細(xì)胞凋亡率為(2.80±0.15)%，對照細(xì)胞的凋亡率為(0.92±0.09)% (P=0.000 4)。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)72 h, 轉(zhuǎn)染miR-519d的細(xì)胞凋亡率為(23.06±3.52)%，對照細(xì)胞的凋亡率為 (23.26±2.56)%(P=0.965 5)。結(jié)論： STAT3在Hep-2細(xì)胞中高表達(dá)，而相關(guān)的miR-519d呈低表達(dá)，通過上調(diào)miR-519d可以抑制STAT3的表達(dá)從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

關(guān)鍵詞喉鱗癌；miRNA-519d；STAT3； 增殖；凋亡

中圖分類號R739.65

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

Effect of Up-Regulating miR-519d on Proliferation and Apoptosis of Laryngeal Squamous Cell CarcinomaSHENNa1BAIGuangping2GAOTianle2HUANGXinsheng1LIJun2

1.DepartmentofOtolaryngology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China; 2.DepartmentofOtolaryngology,QingpuBranchofZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai201700,China

AbstractObjective： To investigate the effect of up-regulating miR-519d on proliferation and apoptosis of laryngeal squamous cell carcinoma. Methods： The expression of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) and miR-519d in human laryngeal carcinoma epithelium cell line Hep-2 and human bronchial epithelium cell(HBE) were detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting. After up-regulating miR-519d expression in Hep-2 cell line by plasmid transfection technique, the proliferation and apoptosis of transfected cells and control cells was detected by proliferation and apoptosis assays. Results： STAT3 mRNA expression in Hep-2 cells was significantly higher than that in HBE cells (P<0.05). However, miR-519d expression in Hep-2 cells was significantly lower than that in HBE cells (P<0.05). The STAT3 mRNA expression in the transfected Hep-2 cells decreased significantly. During 0 and 7 day of post-transfection culture, proliferation rate of transfected Hep-2 cells was significantly lower than that of untransfected cells (P<0.05). After 24 h culture, the apoptosis rate of miR-519d transfected cells was (2.8±0.15)%, while that of control cells was (0.92±0.09)% (P=0.000 4). After 72 h culture, the apoptosis rate of miR-519d transfected cells was (23.06±3.52)%, while that of control cells was (23.26±2.56)% (P=0.965 5). Conclusions： STAT3 shows high expression in Hep-2 cell, while the related miR-519d shows low expression. By up-regulating miR-519d, STAT3 expression could be suppressed, so as to suppress the proliferation of tumor cells and promote the apoptosis of tumor cells.

Key WordsLaryngeal squamous cell carcinoma;miRNA-519d;Signal transducer and activator of transcription 3;Proliferation;Apoptosis

喉癌是耳鼻咽喉科最常見的惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的5.7%～7.6%，近年來其發(fā)病率明顯增長。喉癌中93%～99%為喉鱗狀細(xì)胞癌。目前對喉癌特別是晚期喉癌尚無滿意的治療方法[1]。微小RNA(microRNAs, miRNAs)是基因表達(dá)的重要調(diào)控因子。研究[2]顯示，許多miRNAs的功能與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等有關(guān)；miRNAs直接或間接導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生，是腫瘤治療研究的潛在靶點(diǎn)。我們在以往研究的基礎(chǔ)上，采用生物信息學(xué)軟件(TargetScan)對特異性miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測篩選，發(fā)現(xiàn)喉癌的多個特異性miRNAs有一個共同的靶基因—信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)。通過調(diào)控STAT3，特異性的miRNAs可能在喉癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究喉癌中特異性的miRNAs對STAT3的作用及其調(diào)控機(jī)制意義重大。

1資料與方法

1.1細(xì)胞株和試劑喉癌細(xì)胞株Hep-2、人支氣管上皮細(xì)胞株(human bronchial epithelium cell, HBE)購自中國質(zhì)粒載體細(xì)胞基因保藏中心。轉(zhuǎn)染試劑LipofectaminTM2000購自美國Invitrogen公司。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司。PCR試劑盒購自美國LifeScience公司，Western印跡試劑盒購自中國碧云天生物技術(shù)研究所。引物設(shè)計由上海杏園生物科技有限公司完成。

1.2方法

1.2.1引物序列設(shè)計采用在線設(shè)計軟件設(shè)計STAT3的RT-PCR引物序列，上游引物：5′-GGCCCAATGGAATCAGCTACAG-3′，下游引物：5′-GAAGAAACTGCTTGATTCTTCG-3′。hsa-miR-519d成熟體序列：CAAAGUGCCUCCCUUUAGAGUG；寡聚單鏈DNA序列設(shè)計：5′-TGCTGCAAAGT-GCCTCCCTTTAGAGTGGTTTTGGCCACTGA-CTGACCACTCTAAGGAGGCACTTT-3′、5′-CC-TGAAAGTGCCTCCTTAGAGTGGTCAGTCAG-TGGCCAAAACCACTCTAAAGGGAGGCACTT-TGC-3′。

1.2.2Hep-2、HBE細(xì)胞培養(yǎng)及STAT3和miR-519d表達(dá)檢測使用含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM(含1.5 mmol/LL-谷胺酸、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素)于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。采用RT-PCR法和Western印跡法檢測Hep-2、HBE細(xì)胞中STAT3的表達(dá)情況，以RT-PCR法檢測miR-519d的表達(dá)情況。

1.2.3Hep-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及表達(dá)檢測在1.5 mL EP管中加入75 μL(25 μL/孔×3孔)Opti-MEM I，再加入不同劑量的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-negative，混勻；取另一1.5 mL EP管，加入75 μL(25 μL/孔×3孔)Opti-MEM I，加入相應(yīng)劑量的LipofectaminTM2000，混勻；室溫放置5 min后將兩管混合，室溫放置20～30 min。將轉(zhuǎn)染混合物加入含50 μL無血清DMEM的事先鋪上細(xì)胞的96孔板中，混勻后，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中溫育4～6 h。吸去轉(zhuǎn)染液，用D-Hank’s solution漂洗后，加入DMEM完全培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。采用RT-PCR和Western印跡檢測miR-519d及STAT3的表達(dá)。

1.2.4Hep-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖實驗細(xì)胞培養(yǎng)過夜后，傾去培養(yǎng)液，用3 mL D-Hank’s solution洗滌細(xì)胞兩次。加1 mL Trypsin-EDTA solution, 混勻后，小心吸去胰酶溶液，37℃放置3～5 min。加入 6 mL 含10% FBS的培養(yǎng)液，吹打使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液。用血球計數(shù)板計數(shù)后將細(xì)胞稀釋至3×105細(xì)胞/mL。按2.5×103細(xì)胞/孔的密度接種96孔板，同時設(shè)置對照組，即直接在孔中加入100 μL DMEM培養(yǎng)基；每組設(shè)7重復(fù)，于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后0～7 d，將相應(yīng)孔吸去培養(yǎng)液，加入新鮮的培養(yǎng)基100 μL，每孔避光加入CCK8 10 μL，避光培養(yǎng)1～4 h后，用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測光密度(D)值。

1.2.5細(xì)胞凋亡實驗用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞。后用400 μL 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，密度大約為1×106細(xì)胞/mL。在細(xì)胞懸浮液中加入5×Annexin V-FITC，輕輕混勻后于2～8℃ 避光條件下孵育15 min。加入10×PI 后輕輕混勻于2～8℃，避光條件下孵育5 min。在 1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

2結(jié)果

2.1STAT3和miR-519d在HBE及Hep-2細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.1.1RT-PCR結(jié)果STAT3在Hep-2中的mRNA表達(dá)水平明顯高于其在HBE中的表達(dá)(P<0.05，表1、圖1A)，而miR-519d在Hep-2中的表達(dá)水平明顯低于其在HBE中的表達(dá)(P<0.05，表2、圖1B)。

A： STAT3在Hep-2中mRNA的表達(dá)明顯高于在HBE中的表達(dá)(*P<0.05); B: miR-519d在Hep-2中的表達(dá)明顯低于HBE中的表達(dá)(*P<0.05); C: STAT3在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中的表達(dá)明顯下降(*P<0.05); D: 轉(zhuǎn)染后 miR-519d在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于對照細(xì)胞(*P<0.05); E: Western印跡的灰度值證實了STAT3在Hep-2細(xì)胞中的高表達(dá); F: Western印跡的灰度值證實了上調(diào)miR-519d可以抑制STAT3的表達(dá)

圖1　HBE、Hep-2細(xì)胞中STAT3及miR-519d的表達(dá)

2.1.2Western印跡檢測實驗STAT3在Hep-2中的蛋白表達(dá)水平明顯高于其在HBE中的表達(dá)(P<0.05，表3、圖1E)。

2.2miR-519d 轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率及其對STAT3的調(diào)控作用miR-519d在轉(zhuǎn)染細(xì)胞及對照細(xì)胞中的表達(dá)通過qRT-PCR檢測，而STAT3在轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對照細(xì)胞的表達(dá)通過qRT-PCR 和 Western印跡檢測。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后 miR-519d在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于對照組(圖1D，P<0.05)，STAT3在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中的表達(dá)明顯下降(表4，圖1C、1F，P<0.05)。

2.3上調(diào)miR-519d可以抑制Hep-2細(xì)胞的增殖在轉(zhuǎn)染后我們對miR-519d轉(zhuǎn)染的Hep-2細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖實驗。我們觀察到，在轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)0～7 d，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖率明顯低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(圖2,P<0.05)。

2.4上調(diào)miR-519d可促進(jìn)Hep-2細(xì)胞的早期凋亡在轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)染miR-519d的細(xì)胞凋亡率為 (2.8±0.15)%，對照細(xì)胞的凋亡率為(0.92±0.09)% (P=0.000 4)。繼續(xù)培養(yǎng)72 h, 轉(zhuǎn)染miR-519d的細(xì)胞凋亡率為(23.06±3.52)%，對照細(xì)胞的凋亡率為(23.26±2.56)% (P=0.965 5)。見圖3。

A、B: 培養(yǎng)24 h后流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對照細(xì)胞凋亡率所得的結(jié)果； C、D: 培養(yǎng)72 h后流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對照細(xì)胞凋亡率所得的結(jié)果； E: 24 h時轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡率高于對照組(*P<0.05)，而72 h時兩者的凋亡率無明顯差別(P>0.05)

圖3上調(diào)miR-519d對Hep-2細(xì)胞凋亡的影響

3討論

STAT3目前已被定義為癌基因，它是腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究熱點(diǎn)，許多癌組織和源于腫瘤的癌細(xì)胞株均有STAT3的表達(dá)[3]。王俊閣等[4]用免疫組織化學(xué)法檢測50例喉癌標(biāo)本和10例癌旁正常組織標(biāo)本時，發(fā)現(xiàn)STAT3及磷酸化STAT3在癌組織中高表達(dá)，而癌旁組織為陰性。鐘剛等[5]和張寒冰等[6]通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)：與對照組正常癌旁組織相比，STAT3在喉癌中表達(dá)增高(P<0.05)，STAT3的過量表達(dá)可能在喉癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。文獻(xiàn)[5]發(fā)現(xiàn)STAT3活性增高是喉癌的早期事件，阻斷STAT3表達(dá)有可能抑制喉癌的發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)STAT3 在Hep-2細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常氣管黏膜上皮細(xì)胞(P<0.05)。

同時我們在以往研究的基礎(chǔ)上，通過生物信息學(xué)軟件(TargetScan)在對特異性miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測篩選時，發(fā)現(xiàn)喉癌的多個特異性miRNAs有一個共同的靶基因——STAT3。通過調(diào)控STAT3，特異性的miRNAs可能在喉癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮十分重要的作用。因此，本研究選取miR-519d這個特異性miRNA進(jìn)行研究，以探討其對STAT3的調(diào)控作用，觀察其對腫瘤增殖及凋亡的作用。本研究表明，在Hep-2細(xì)胞中miR-519d的表達(dá)明顯低于正常氣管黏膜上皮細(xì)胞(P<0.05)，因此，miR-519d可能通過負(fù)向調(diào)控STAT3來影響腫瘤的增殖及調(diào)亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，在上調(diào)miR-519d的表達(dá)后，Hep-2細(xì)胞中的STAT3表達(dá)明顯下降(P<0.05)，進(jìn)一步證實了miR-519d對其的負(fù)性調(diào)控作用。同時，我們觀察了上調(diào)miR-519d的Hep-2細(xì)胞在0～7 d的增殖情況，其增殖幅度明顯低于對照組(P<0.05)，所以我們推斷，miR-519d通過負(fù)性調(diào)控STAT3而影響腫瘤細(xì)胞的增殖。

此外，研究[7-8]表明，上調(diào)STAT3的表達(dá)可以促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡；通過抑制STAT3信號通路可以誘導(dǎo)凋亡。我們的研究發(fā)現(xiàn)，通過上調(diào)miR-519d可以抑制STAT3的表達(dá)，從而使轉(zhuǎn)染后24 h時的腫瘤細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染后72 h時兩組的細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，因此，抑制STAT3通路可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生。

綜上所述，在Hep-2細(xì)胞中，STAT3高表達(dá)，而miR-519d呈低表達(dá)，通過上調(diào)miR-519d可以抑制STAT3的表達(dá)從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

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通訊作者李俊，E-mail：lijun_ent@163.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(編號：81001201)；上海市科學(xué)技術(shù)委員會基金項目(編號：14DZ1940703)；上海市青浦區(qū)科學(xué)技術(shù)發(fā)展基金項目(編號：2011-19)