劉鍇　李春波　陳增淦　曾蒙蘇　傅彩霞　陳財忠

(1. 復旦大學附屬中山醫(yī)院a放射科，b骨科，上?！?00032；

2. 西門子(深圳)磁共振有限公司， 深圳　518057)

MRI示蹤超順磁性氧化鐵標記兔脂肪干細胞治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的研究

劉鍇1a△李春波1b△陳增淦1b曾蒙蘇1a傅彩霞2陳財忠1a

(1. 復旦大學附屬中山醫(yī)院a放射科，b骨科，上海200032；

2. 西門子(深圳)磁共振有限公司， 深圳518057)

摘要目的：利用磁共振成像技術(shù)動態(tài)監(jiān)測超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide, SPIO)標記的兔脂肪干細胞(adipose-derived stemcells, ADSCs)在兔體內(nèi)的變化及其對兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損修復的進程。方法： 用不同濃度(0、12.5、25、50、100 μg/mL)的超順SPIO標記ADSCs。采用普魯士藍染色法測定細胞的標記情況，并計算細胞標記率。用細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)測定不同濃度的SPIO對細胞活性的影響。將不同濃度SPIO標記的不同數(shù)量的ADSCs快速均勻地重懸于盛有1%瓊脂糖的冷凍管中進行體外MRI成像，測量T2*圖像信號強度。將50 μg/mL的SPIO標記的ADSCs接種至聚乳酸-羥基乙酸共聚酶[Poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA]支架材料后，回植入兔(n=5)膝關(guān)節(jié)軟骨直徑為3 mm的軟骨缺損處，分別于術(shù)后1、4、8和12周進行MRI T2*序列動態(tài)掃描，監(jiān)測干細胞在體內(nèi)的變化及關(guān)節(jié)軟骨的修復情況。結(jié)果： 原代培養(yǎng)的ADSCs呈成纖維細胞樣外觀，培養(yǎng)7 d后細胞呈聚集樣生長。普魯士藍染色見細胞質(zhì)內(nèi)有明顯的藍色致密顆粒，隨著SPIO濃度的升高，藍色致密顆粒增多；當SPIO的濃度≥50 μg/mL時，細胞的標記率可達100%。CCK-8檢測顯示，SPIO的濃度越高，細胞的活性越低，當SPIO的濃度大于50 μg/mL時，細胞的活性明顯降低(P<0.05)。體內(nèi)MRI顯示，術(shù)后1周和4周可見顆粒狀低信號區(qū)域，信號強度明顯低于對照組。術(shù)后8周，顆粒狀低信號范圍逐漸縮小，信號強度接近周圍組織，說明SPIO標記的ADSCs在動物體內(nèi)存活良好，并正常分裂增殖，形成正常關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)。結(jié)論： MRI聯(lián)合SPIO可以動態(tài)監(jiān)測細胞在體內(nèi)的分布、生長和轉(zhuǎn)歸，有望作為一種動態(tài)監(jiān)測組織工程修復關(guān)節(jié)軟骨缺損效果的方法。

關(guān)鍵詞磁共振；脂肪干細胞；超順磁性氧化鐵；細胞示蹤

中圖分類號R684

文獻標識碼A

MRI Tranking of Superparamagnetic Iron Oxide-Labeled Rabbit Adipose-Derived Stem Cells for Treatment of Carticular Carilage DefectLIUKai1a△LIChunbo1b△CHENZenggan1bZENGMengsu1aFUCaixia2CHENCaizhong1a

1.aDepartmentofRadiology,bDepartmentofOrthopedics,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China; 2.SiemensShenzhenMagneticResonanceLtd.,Shenzhen518057,China

AbstractObjective： To detect dynamically in vivo superparamagnetic iron oxide-labeled rabbit adipose-derived stem cells (ADSCs) for treatment of carticular cartilage defect with MRI tracking technique. Methods： Rabbit ADSCs were firstly labeled with different concentrations of SPIO (0 μg/mL,12.5 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, and 100 μg/mL). The labeled ADSCs were stained with Prussian blue and the labeling rates were calculated. The activities of different concentration SPIO-labeled ADSCs were determined by CCK-8. Different amounts of different concentration SPIO-labeled ADSCs were dissolved homogeneously in cryovial with 1% agarose and T2*-weighted MRI was used to evaluate their signal intensity in vitro. Then 50 μg/mL SPIO-labeled ADSCs and unlabeled ADSCs were seeded in PLGA [Poly (lactic-co-glycolic acid)] scaffold, respectively. Following that, the cells-PLGA scaffold compounds were implanted in the rabbit (n=5) articular cartilage defect with average diameter 3 mm. At 1, 4, 8, and 12 weeks post-operatively, the change of implanted-ADSCs and the repain of articular cartilage defect were dynamically detected by T2*-weighted MRI. Results： Primarily cultured rabbit ADSCs presented fibroblast-like appearance, and ADSCs proliferated with aggregations after 7 days. Prussian blue staining showed amount of blue dense granules in cytoplasm. With the increasing of SPIO concentration, the count and region of blue dense granules increased. When SPIO concentration reached 50 μg/mL, the labeling rate of ADSCs reached 100%. The measure of CCK-8 showed that the activities of ADSCs decreased with the increasing of SPIO concentration. When the SPIO concentration was greater than 50 μg/mL, the activities of ADSCs were obvious low (P<0.05). In vivo, MRI showed postoperative 1 week and 4 weeks visible granules with low signal area, and the signal strength was significantly lower than the control group. Until 8 weeks post-surgery, granules with low signal area gradually narrowed and signal strength was similar to the control group. SPIO-labeled ADSCs lived with a normal division growth and performed normal cartilage articular. Conclusions： MRI combined SPIO is a potential method to dynamically detect the distribution, growth and prognosis of cells in the body, and can also be used to determine the respiration of articular cartilage defect.

Key WordsMagnetic resonance imaging；Adipose-derived stem cells;Superparamanetic iron;Cell tracking

脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是一類來源于脂肪組織、具有自我更新及多向分化能力的成體間充質(zhì)干細胞。在特定的誘導條件下培養(yǎng)，ADSCs可以向心肌細胞、骨細胞、神經(jīng)元和軟骨細胞等終末細胞分化，在疾病治療和再生醫(yī)學方面具有潛在的研究及應用價值[1-5]。近年來，干細胞移植技術(shù)的研究主要集中于干細胞植入機體后的細胞分布、分化、增殖及轉(zhuǎn)歸等生物學行為。但是，如何無創(chuàng)地監(jiān)測植入細胞在機體內(nèi)的生存遷徙情況一直困擾著臨床。超順磁性氧化鐵顆粒(superparamagnetic iron oxide，SPIO)是一類MRI陰性對比劑[6-7]，它的有效成分是Fe3O4晶體核心，被包以葡聚糖生物高分子物質(zhì)，構(gòu)成核殼結(jié)構(gòu)。包覆后的SPIO具有一定的超順磁性，能明顯縮短組織的T2值。本研究通過對兔ADSCs進行不同濃度的SPIO標記，研究SPIO對干細胞的生物學行為的影響，并觀察特定濃度SPIO的體外和體內(nèi)MRI成像效果，為干細胞的廣泛應用奠定基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1材料成年新西蘭大白兔10只，體質(zhì)量約1.8 kg(購自復旦大學附屬中山醫(yī)院實驗動物中心)。DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自澳大利亞JRH公司；L-谷氨酰胺(300 g/mL)、SPIO、 胰蛋白酶、聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)PLGA]支架材料購自上海實生細胞生物技術(shù)有限公司；抗壞血酸(50 g/mL)、氯仿、氯化鈉購自國藥集團上?；瘜W試劑有限公司；青霉素(0.062 5 g/L)、鏈霉素 (100 g/L)購自石家莊華北制藥有限公司；I型膠原酶購自美國sigma公司。

1.2兔ADSCs的分離和培養(yǎng)ADSCs的培養(yǎng)參照我們以往的研究[8]，具體步驟為：成年大白兔麻醉后，取腹股溝處皮下脂肪組織，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3遍，將脂肪組織剪成1 mm×1 mm×1 mm的顆粒，置于相等體積、質(zhì)量分數(shù)為0.075%的I型膠原酶中，37℃恒溫攪拌消化60 min。取等體積的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(低糖DMEM、10% FBS、100 g/L鏈霉素、0.062 5 g/L青霉素)中和后，重新懸浮并離心(2000 r/min，10 min)。棄去上層的脂肪細胞、脂滴和液體，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細胞，將混懸液體加入培養(yǎng)皿，置于37℃、CO2體積分數(shù)為5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d換液1次，待細胞生長融合達80%～90%時，用胰蛋白酶消化傳代備用。

1.3SPIO標記ADSCs將經(jīng)高溫滅菌處理的SPIO加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，配成濃度分別為100、50、25和12.5 μg/mL的SPIO混合液，未加入SPIO的培養(yǎng)基定義為 0 μg/mL。待上述第三代ADSCs長至培養(yǎng)皿底面積的85%時，棄去原培養(yǎng)基，PBS充分沖洗2次后，加入含不同濃度SPIO的培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱孵育24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，加入未標記的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.4普魯士藍染色及標記率計算選擇不同濃度SPIO標記的ADSCs，棄去原培養(yǎng)基，無菌PBS沖洗3次，加入4%的多聚甲醛溶液固定15 min，水洗3次。加入普魯士藍(2% 亞鐵氫化鉀和2% 鹽酸的體積比為1∶1)孵育30 min，水洗。在倒置顯微鏡下觀察并拍照，計算鐵染陽性率。

1.5不同濃度SPIO對ADSCs生物活性影響的檢測將ADSCs用基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸后，以每孔3×103個細胞接種于96孔板。然后將板置于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。細胞標記參照上述方法，待細胞完全貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，將含不同濃度SIPO的培養(yǎng)基分別加入不同的孔中，每組6孔。培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，加入CCK-8試劑，每孔10 μL，混合均勻，于37℃恒溫箱避光孵育2 h，用酶標儀檢測波長450 nm處的熒光強度。將未標記的ADSCs作為對照，計算ADSCs的活性。

1.6標記細胞的體外MRI成像將各濃度SPIO標記的ADSCs快速均勻地重懸于盛有1%的瓊脂糖的冷凍管中(細胞密度分別為1×107個/mL、0.5×107個/mL、1×106個/mL、0.5×106個/mL)，每組3個樣本。待瓊脂冷卻凝固后，進行MRI掃描。應用3.0T MR機，實驗專用線圈，采用梯度回波T2*序列。成像參數(shù)：掃描野(FOV)為120 mm×120 mm，重復時間(TR) 445.00 ms，回波時間(TE) 4.36 ms，矩陣256×256，層厚2 mm，層間距0.6 mm，翻轉(zhuǎn)角60°，帶寬 228Hz/像素， 激勵次數(shù)2.0。測量每個樣本的信號強度，根據(jù)信號強度確定不同SPIO濃度及細胞數(shù)量對T2*WI圖像的影響。

1.7細胞支架材料復合物的制備細胞支架材料復合物的制備根據(jù)我們以前的方法[8]，具體制備步驟為：將第3～5代50 μg/mL SPIO標記的ADSCs用含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的消化液消化后，收集細胞于50 mL離心管，2000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，計數(shù)，配制成1×107個/mL的細胞懸液，用微量移液槍將細胞接種于滅菌的PLGA支架材料。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基。24 h后，把細胞支架材料復合物移至6孔板。用同樣的方法制備未標記的ADSCs支架材料復合物。

1.8兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型的制備取健康西蘭兔5只，將其放置于動物臺上，用氯胺酮(1 mg/kg)經(jīng)肌內(nèi)注射麻醉后，固定、備皮、常規(guī)消毒鋪巾。于膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)作縱行切口，逐層切開關(guān)節(jié)腔，將髕骨推向外側(cè)，暴露雙側(cè)髕股的關(guān)節(jié)面(圖1A)。于股骨滑車關(guān)節(jié)面處用直徑為3 mm的鉆頭鉆孔，造成軟骨全層缺損(圖1B)。完全去除組織碎屑和血塊后暴露缺損，左肢植入SPIO標記的ADSCs支架材料復合物(實驗組，n=5)，右肢植入未標記的ADSCs支架材料復合物(對照組，n=5)，見圖1C。分層縫合膝關(guān)節(jié)囊、組織、皮膚。

A：充分暴露髕骨關(guān)節(jié)面；B：關(guān)節(jié)面正中以3 mm為直徑鉆孔，去除組織碎屑，充分暴露缺損；C：充分填充ADSC支架材料復合物

圖1兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型的制作過程

1.9標記細胞的體內(nèi)MRI成像干細胞支架材料移植后第1、4、8和12周，分別行兔膝MRI檢查。應用德國Siemens verio 3.0T超導磁共振掃描儀，8通道膝關(guān)節(jié)專用線圈。用前述方法將兔麻醉后取仰臥位，分別固定雙前肢和雙后肢行MRI成像，將膝關(guān)節(jié)缺損局部置于線圈中心部位。T2*序列：FOV為140 mm×140 mm，TR 445.00 ms，TE 4.36 ms，矩陣320×320，層厚2 mm，層間距0.4 mm,帶寬228Hz/pixel，激勵次數(shù)7.0； 快速自旋回波(FSE)序列：T2WI TR 4500 ms，TE 100 ms，翻轉(zhuǎn)角30°，激勵次數(shù)2.0。

1.10統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0軟件進行多樣本方差分析，比較不同濃度SPIO對ADSCs的標記率及細胞活性的影響，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1兔ADSCs的形態(tài)觀察ADSCs培養(yǎng)24 h后，可見散在少量的貼壁細胞，以短梭形細胞為主，部分呈三角形或不規(guī)則形(圖2A)。72 h后，可見較多的梭形貼壁細胞，分裂增殖速度快，增生為形態(tài)相對均一的成纖維樣梭形細胞。7 d后，80%～90%細胞融合，并呈束狀、菊花狀或旋渦狀排列。傳代至第3代，可見ADSCs呈長梭形，形態(tài)均一(圖2B)。

A：原代ADSCs培養(yǎng)24 h后；B：第3代ADSCs培養(yǎng)72 h后

圖2倒置顯微鏡觀察ADSCs的形態(tài)

2.2SPIO標記ADSCs情況SPIO標記的ADSCs呈普魯士藍染色陽性，可見細胞內(nèi)藍色致密顆粒分布。隨著SPIO濃度的增加，藍色致密顆粒顏色加深。而未標記SPIO的ADSCs細胞質(zhì)中未見藍色顆粒物質(zhì)。顯微鏡下觀察藍染ADSCs并計算陽性率。當SPIO的濃度≥50 μg/mL時，標記24 h后，陽性率幾乎達100%(圖3A～B)；當SPIO的濃度<50 μg/mL時，標記24 h后，隨著SPIO濃度的降低，標記率也顯著下降(圖3C～E)。不同濃度SPIO對ADSCs的標記率見圖4A。

A～E分別為100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL和0 μg/mL的SPIO標記的ADSCs

圖3普魯士藍染色顯示SPIO標記的ADSCs

2.3SPIO對ADSCs生物活性的影響用CCK法檢測不同濃度SPIO標記的ADSCs的活性。當SPIO的濃度為12.5、25、50 μg/mL時，與未標記SPIO(0 μg/mL)的ADSCs相比，活細胞率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。當SPIO的濃度為100 μg/mL時，活細胞率較SPIO濃度為50 μg/mL時顯著減少。這些結(jié)果表明，低濃度的SPIO(≤50 μg/mL)對ADSCs的活性沒有明顯影響；但是當SPIO的濃度大于50 μg/mL時，細胞活性顯著降低。見圖4B。

注：與50 μg/mL 相比，*P<0.05； A：不同濃度SPIO的細胞標記率；B：不同濃度SPIO對ADSCs活性的影響

圖4不同濃度SPIO的ADSCs標記率及

2.4SPIO標記ADSCs的體外信號特征不同濃度SPIO標記的ADSCs培養(yǎng)24 h后，在T2*加權(quán)MRI掃描圖像上，可見SPIO的濃度及細胞的數(shù)量均會影響MRI信號強度。在SPIO濃度一定的條件下，隨著細胞數(shù)量的增多，MRI信號強度逐漸減低；在細胞數(shù)量一定的條件下，隨著SPIO濃度的增加，MRI信號強度逐漸減低。見圖5。

A：T2*加權(quán)MRI圖像；B：T2*序列MRI信號強度變化

圖5不同濃度SPIO標記的不同數(shù)量ADSCs的體外信號強度變化對ADSCs活性的影響

2.5SPIO標記ADSCs的MRI體內(nèi)成像關(guān)節(jié)軟骨損傷模型制作成功后，實驗組術(shù)后1周見關(guān)節(jié)軟骨缺損處出現(xiàn)彌漫性顆粒狀異常低信號改變；術(shù)后4 周見軟骨缺損部位低信號范圍擴大，但隨著支架植入時間的延長，信號減低程度逐漸減輕；術(shù)后8周和12周軟骨缺損處信號減低程度明顯減弱，范圍亦明顯縮小，信號強度類似于周圍組織。對照組于術(shù)后1周、4周、8周和12周未見信號強度的明顯變化。見圖6。

A1～A4：植入50 μg/mL SPIO標記的ADSCs支架材料復合物后，第1、4、8和12周MRI圖像；B1～B4: 植入未標記SPIO的ADSCs支架材料復合物后，第1、4、8和12周的MRI圖像；C：正常兔膝關(guān)節(jié)MRI圖像；D：細胞支架材料植入體內(nèi)后，MRI信號強度的變化

圖6SPIO標記ADSCs修復兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的MRI體內(nèi)成像

3討論

軟骨組織是由多糖和膠原組成的乏血管組織。軟骨組織損傷修復的過程復雜，已是臨床的難題之一。組織工程的出現(xiàn)為軟骨損傷的修復提供了新的方法，其中，獲得理想的種子細胞是其最核心的環(huán)節(jié)[1-3]。2004年，Zuk等[9]首次從脂肪組織中分離培養(yǎng)出具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。大量的研究證實了來自于脂肪組織的MSCs表現(xiàn)出與骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)類似的增殖分化能力。體外培養(yǎng)的ADSCs在不同的誘導條件下，不但能夠向脂肪、軟骨、骨、肌肉等中胚層細胞系分化[5, 8-10]，而且能夠向神經(jīng)、內(nèi)皮、心肌等其他胚層細胞系分化[11-13]。體外培養(yǎng)的ADSCs植入機體后能分化形成特定的組織，在組織損傷的修復與重建方面具有巨大的應用價值。但是，應用組織工程的方法重建組織缺損涉及到一個關(guān)鍵的問題，即如何動態(tài)地評估干細胞等移植物在活體中的存活、分布、遷移、轉(zhuǎn)歸等過程。目前，大多數(shù)用于鑒定干細胞體內(nèi)存活的方法均需要在植入后的一定時間內(nèi)處死實驗動物。因此，探索一種有效的無創(chuàng)方法對植入的種子細胞進行動態(tài)追蹤和監(jiān)測，顯得非常重要。本研究選擇具有高度增殖及分化潛能的ADSCs來重建兔關(guān)節(jié)軟骨的缺損，同時結(jié)合MRI技術(shù)來評估ADSCs在體內(nèi)的生存、遷徙情況。

SPIO是一種由葡聚糖生物高分子包裹Fe3O4晶體形成的呈核殼式結(jié)構(gòu)的磁標記探針，其可明顯縮短MRI T2值，降低組織的信號強度[6-7]。當標記ADSCs時，細胞團可因吞噬鐵顆粒而呈現(xiàn)明顯的低信號，可以間接地反應移植物的分布及聚集情況[14]。本實驗通過SPIO標記ADSCs來檢測磁性材料對細胞的影響，結(jié)果顯示，隨著SPIO濃度的增加，細胞的標記率增高，當SPIO的濃度為50 μg/mL 時，細胞的標記率可達100%；但是隨著SPIO濃度的增加，細胞的活性逐漸下降，壞死細胞的數(shù)量增多，SPIO濃度≤50 μg/mL時，對細胞活性的影響則不明顯。Arbab等[15]的研究亦顯示，濃度為25～50 μg/mL的SPIO對細胞的有效標記率最高，同時不影響細胞的生存、增殖能力及活性。體外MRI顯示，標記細胞的SPIO濃度和細胞數(shù)量均會影響MRI的信號強度。當SPIO的濃度<25 μg/mL時，單純增加細胞的數(shù)量不明顯影響MRI的信號強度。我們推測，可能由于細胞的標記率太低，即使細胞的數(shù)量增加了，但是標記細胞的數(shù)量并沒有明顯增加，因此MRI信號強度不會隨之改變。當SPIO的濃度為50 μg/mL和100 μg/mL時，隨著細胞數(shù)量的增加，MRI信號強度明顯減低。因此，我們認為，SPIO的濃度為50 μg/mL時，既可以獲得較高的細胞標記率，同時不影響細胞活性，還可以產(chǎn)生隨著細胞數(shù)量變化的MRI信號變化趨勢，這對于評價細胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸具有重要意義。

組織工程技術(shù)的不斷進步為軟骨損傷的修復重建開辟了一條新的途徑[16]。本研究采用濃度為50 μg/mL的SPIO標記兔ADSCs，并種植于PLGA支架材料來修復兔的膝關(guān)節(jié)軟骨缺損。MRI顯示，實驗組術(shù)后1周軟骨缺損處出現(xiàn)明顯的低信號影像；術(shù)后4周，低信號強度較前明顯減弱，低信號范圍明顯縮??；術(shù)后8周和12周，低信號消失，信號強度類似于周圍的軟骨組織，說明植入ADSCs支架材料復合物可以修復兔的膝關(guān)節(jié)軟骨缺損。但是植入未標記SPIO的ADSCs支架材料復合物的對照組的MRI 信號強度自術(shù)后1周到12周沒有發(fā)生明顯的變化。為了進一步評估ADSCs支架材料復合物的體內(nèi)情況，我們定量測定了細胞支架材料的MRI信號強度，結(jié)果顯示，實驗組術(shù)后1周的MRI信號強度明顯低于對照組和正常組；術(shù)后4周，實驗組的信號強度逐漸升高，較術(shù)后1周差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；術(shù)后8周，實驗組的信號強度升高到接近對照組和正常組。ADSCs吞噬的SPIO在體內(nèi)逐漸代謝，可能涉及以下兩個方面：(1)由于ADSCs在體內(nèi)的分裂增殖，子代中的總鐵含量降低；(2)干細胞凋亡或裂解，游離的鐵離子會被周圍巨噬細胞吞噬。因此，局部干細胞SPIO產(chǎn)生的信號逐漸減弱。盡管這種代謝過程可能會影響MRI信號強度，而巨噬細胞吞噬磁性材料后游走、遷徙，在早期即可以改變MRI的信號強度，但對于干細胞的原位分裂、分化來說，這個過程相對緩慢。本研究證實，ADSCs支架材料復合物植入體內(nèi)后，MRI的信號強度變化是一個逐漸減低的過程，8周后接近于對照組，說明ADSCs在體內(nèi)增殖、分化良好，且沒有發(fā)生明顯的凋亡。因此，我們認為，利用3T MRI動態(tài)示蹤SPIO標記的細胞，可較好地顯示移植細胞在活體內(nèi)的分布和遷徙，有望成為無創(chuàng)、動態(tài)、直觀的組織工程種子細胞示蹤方法。

綜上所述，本研究通過用不同濃度的SPIO體外標記ADSCs，證實低濃度的SPIO不會影響細胞的活力和增殖等生物學行為，與研究[17]的結(jié)果一致；體外及體內(nèi)MRI掃描示，50 μg/mL的SPIO標記細胞可有效地顯示細胞在體內(nèi)的生存和轉(zhuǎn)歸情況。盡管SPIO在MRI中的應用極大地促進了細胞示蹤及細胞治療技術(shù)的發(fā)展，為組織工程的臨床應用提供了更多客觀、準確的數(shù)據(jù)，但是，目前MRI示蹤干細胞仍有很多的不足，如標志物是否影響干細胞的遠期安全性、標志物是否影響干細胞在體內(nèi)分化的轉(zhuǎn)歸、標志物在體內(nèi)的代謝方向如何等。因此，在以后的研究中，需要通過提高MRI技術(shù)及改善標志物的理化性質(zhì)等來進一步研究干細胞在體內(nèi)的遷徙、分化和轉(zhuǎn)歸的進程。

參考文獻

[1]Gwak SJ, Bhang SH, Yang HS,et al. In vitro cardiomyogenic differentiation of adipose-derived stromal cells using transforming growth factor-beta1[J]. Cell Biochem Funct,2009,27(3):148-154.

[2]Lu W, Ji K, Kirkham J, et al. Bone tissue engineering by using a combination of polymer/Bioglass composites with human adipose-derived stem cells[J]. Cell Tissue Res,2014,356(1):97-107.

[3]Abdanipour A, Tiraihi T, Delshad A. Trans-differentiation of the adipose tissue-derived stem cells into neuron-like cells expressing neurotrophins by selegiline[J]. Iran Biomed J, 2011,15(4):113-121.

[4]Guasti L, Vagaska B, Bulstrode NW, et al. Chondrogenic differentiation of adipose tissue-derived stem cells within nanocaged POSS-PCU scaffolds: a new tool for nanomedicine[J].Nanomedicine,2014,10(2):279-289.

[5]Liu Y, Zhang Z, Qin Y, et al. A new method for Schwann-like cell differentiation of adipose derived stem cells[J].NeurosciLett, 2013,551:79-83.

[6]Bulte JW, Kraitchman DL. Monitoring cell therapy using iron oxide MR contrast agents[J].Curr Pharm Biotechnol,2004, 5(6):567-584.

[7]Luchetti A, Milani D, Ruffini F, et al. Monoclonal antibodies conjugated with superparamagnetic iron oxide particles allowmagnetic resonance imaging detection of lymphocytes in the mouse brain[J].Mol Imaging,2012,11(2):114-125.

[8]李春波，王紅，陳增淦，等.兔脂肪干細胞(ADSCs)與聚羥基乙酸/殼聚糖(PLGA/CS)支架材料生物相容性研究[J]. 復旦學報(醫(yī)學版),2014,41(4)：472-478.

[9]Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J].Mol Biol Cell,2002,13(12):4279-4295.

[10]Fu Y, Li R, Zhong J, et al. Adipogenic differentiation potential of adipose-derived mesenchymal stem cells from ovariectomized mice[J]. Cell Prolif,2014, 47(6):604-614.

[11]Zhang Y, Luo H, Zhang Z, et al. Anerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells[J]. Biomaterials, 2010,31(20):5312-5324.

[12]Shi Z, Neoh KG, Kang ET，et al.Enhanced endothelial differentiation of adipose-derived stem cells by substrate nanotopography[J].J Tissue Eng Regen Med,2014,8(1):50-58.

[13]Yang JJ, Yang X, Liu ZQ, et al. Transplantation of adipose tissue-derived stem cells overexpressing heme oxygenase-1 improves functions and remodeling of infarcted myocardium in rabbits[J]. Tohoku J Exp Med, 2012,226(3):231-241.

[14]Yang CY, Hsiao JK, Tai MF, et al. Direct labeling of hMSC with SPIO: the long-term influence on toxicity, chondrogenic differentiation capacity, and intracellular distribution[J]. Mol Imageing Biol, 2011,13(3):443-451.

[15]Arbab AS, Wilson LB, Ashari P, et al. A model of lysosomal metabolism of dextran coated superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles: implications for cellular magnetic resonance imaging[J]. NMR Biomed, 2005,18(6):383-389.

[16]Baums MH, Schultz W, KostujT,et al.Cartilage repair techniques of the talus: An update[J]. World J Orthop,2014,5(3):171-179.

[17]譚樹森，賈長青，劉振寧，等. 經(jīng)超順磁性氧化鐵標記的自體BMSCs在兔椎間盤內(nèi)存活時間研究[J].中國修復重建外科雜志,2009,23(11)：1355-1359.

通訊作者陳財忠，E-mail:chen.caizhong@zs-hospital.sh.cn

△劉鍇和李春波對本文有同等貢獻，為共同第一作者。

·論著·