李 婧

綜 述

骨膜來源細胞在骨組織工程應用中的研究進展

李 婧

骨膜來源細胞； 骨組織工程； 成骨作用； 血管形成； 擬生態(tài)骨膜

創(chuàng)傷、骨變性疾病、腫瘤等導致骨組織的損傷是矯形外科面臨的主要難題。自體骨、異體骨和基于可降解生物材料的人工骨，是近幾十年來治療骨缺損的主要方法。但存在各自的缺點和局限性，包括自體骨來源有限和供體區(qū)存在壞死風險，異體骨存在潛在感染性和免疫原性及人工骨替代物缺乏成骨潛力等。目前，自體骨移植仍是治療不愈合骨缺損的金標準，而骨組織工程(bone tissue engineering)作為替代方法正成為研究熱點。該方法所需自體組織量少，侵襲性小，比傳統方法更安全。骨組織工程主要目的是將種子細胞接種在可降解生物載體上，修復受損或不健全的骨組織，并尋找克服自體組織移植缺陷的方法，種子細胞的選擇和功能改進是其中重要方面[1-3]。

間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是組織工程應用最多的種子細胞，具有高度自我更新和分化成不同細胞系的能力，來源廣泛。但不同來源的MSCs存在表型異質性，尤其是移植后在移植區(qū)域產生不同體內結果和/或特異功能，因此，正確選擇MSCs來源對受損組織再生得到更有效治療十分重要[4]。骨髓來源MSCs是研究骨組織工程常用細胞，但從骨髓中分離MSCs存在潛在的風險和難度。近年來，從骨膜組織中分離培養(yǎng)骨膜來源細胞(periosteum derived cells, PDCs)用于骨組織工程正逐漸興起[5-7]。臨床實踐表明，骨膜損傷將延遲骨愈合或導致不愈合，原因在于骨膜中存在大量具有MSCs表型特征的細胞群，其增殖分化潛力與骨髓來源MSCs相當或更佳，在骨損傷修復中發(fā)揮重要作用[8]。許多動物實驗也已證明了PDCs具有修復骨缺損的能力[2,9-12]。從解剖學角度，骨膜與骨形成和修復更近，可能是更相關的細胞來源；從臨床應用角度，小塊骨膜組織中獲取PDCs侵襲性更小，更安全。因此，以PDCs作為種子細胞修復骨缺損將是更佳策略。筆者現就近年來PDCs在骨組織工程中的應用研究進行綜述。

1 骨膜及骨膜來源細胞分離培養(yǎng)

骨膜是被覆在除關節(jié)以外的骨表面上堅固的含有微血管的結締組織包膜，由外部的纖維層(fibrous layer)和內部的形成層(cambium layer)組成。纖維層主要由具有高度組織性和方向性的膠原纖維組成，富含血管、神經，有營養(yǎng)和感覺作用，沿縱向隨著骨生長擴展；形成層較薄，是MSCs、成骨細胞(osteoblasts)、成纖維細胞(fibroblasts)和周皮細胞(pericytes)等的聚集地，在骨生長過程中沿著逐漸增加骨周長和長度的方向擴展。骨膜通過Sharpey氏纖維牢固地錨定在位于其下部的骨上。應用專業(yè)手術器械可以較容易地從手術部位獲得骨膜組織，例如在關節(jié)置換術中從股骨頭中獲得骨膜組織[13]。但應注意的是，不同部位來源的骨膜成骨能力存在差異[14]，例如脛骨骨膜比顱蓋骨骨膜成骨能力更強[15]。新鮮的骨膜組織經液氮凍存2年后仍可用于分離PDCs，方便儲存?zhèn)溆肹16]。

目前，從骨膜中分離培養(yǎng)PDCs，主要有組織塊培養(yǎng)法和酶消化法。組織塊培養(yǎng)法是一種簡便易行且成功率較高的原代培養(yǎng)方法，優(yōu)點是細胞從天然環(huán)境中遷出，能保證細胞的生理狀態(tài)，避免PDCs受到外界因素的影響。缺點是耗時較長，且反復剪切和接種過程可能會對組織造成損傷，不能保證每個組織塊都能長出細胞。酶消化法使用膠原酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶等，將妨礙細胞生長的細胞間質去除，使細胞分散，形成懸液，易于從外界吸收養(yǎng)分和排出代謝產物，可以短時間內得到大量活細胞并生長成片。但步驟繁瑣，易污染，同時消化酶對細胞有一定損傷作用，需要摸索消化條件，且消化酶價格昂貴，實驗成本高。盡管兩種方法各有優(yōu)缺點，但是方法學的差異不會影響所分離的PDCs的增殖能力和多能性，除了在細胞表面標志物表達上有些許差異[17]。

成功的器官組織工程，不能缺少支持細胞增殖和分化的適宜培養(yǎng)條件。培養(yǎng)基成分會影響細胞增殖和存活，調節(jié)細胞的生物學行為。文獻報道，高糖或低糖DMEM、RPMI1640、DMEM/F12、α-MEM都可以用于PDCs的體外培養(yǎng)，但使用最多的當屬α-MEM培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基特點是容易使細胞貼壁生長，若適當添加某些營養(yǎng)成分，如加入谷氨酰胺或用D-纈氨酸代替L-纈氨酸，可以改善不同物種PDCs的生長狀況[16,18-19]。胎牛血清是細胞體外培養(yǎng)的必要成分，但將PDCs應用于轉化醫(yī)學時，還要考慮動物血清替代物問題，既要保留PDCs表型特征，又要減少免疫原性[15,20]。

常規(guī)細胞培養(yǎng)多為二維培養(yǎng)系統，對于具有自我更新和分化能力的MSCs來說細胞增殖可獲得的表面積有限，且在長期培養(yǎng)過程中存在失去分化能力的可能性。利用三維細胞培養(yǎng)系統可以改善這種狀況。有研究顯示，PDCs在旋轉式三維培養(yǎng)平臺中的擴增成球形，并保持存活性和增殖能力，標志性基因和蛋白的表達水平要高于二維培養(yǎng)，這對于提高PDCs的臨床應用潛力大有裨益[21]。

2 骨膜來源細胞體外培養(yǎng)特點

骨膜中含有多種細胞類型，具有自我更新能力。在機械和生化等各種局部因素作用下分化產生成骨細胞和軟骨細胞，參與軟骨內成骨和膜內成骨[22-23]。體外培養(yǎng)的PDCs在不同誘導介質存在下，能向成骨細胞、成軟骨細胞和成脂肪細胞分化，并且具備體內成骨潛力。這歸因于PDCs中包含功能不同的祖細胞或多能性的原始干細胞，當受到周圍組織或結構信號刺激后可以被活化。多能性可能是儲存在成人骨膜中通常處于靜息狀態(tài)的細胞固有特性。正如胚胎期軟骨膜(骨化后稱為骨膜)為發(fā)育中骨骼的生長提供多能性細胞一樣，成人骨膜中也存在未分化的多能MSCs，參與骨生理性生長和重塑。這為基于細胞的組織工程技術提供了豐富的細胞來源[19,24-25]。

體外培養(yǎng)的PDCs光鏡下多數呈現成纖維細胞樣形態(tài)特點，與MSCs類似，但不同物種來源的PDCs形態(tài)有所差異。PDCs具備MSCs的特征，應用MSCs表面標志物可以鑒定和分選PDCs[24]。在骨組織工程中，可以從骨膜中分選出較純的MSCs，也可以直接用從骨膜組織分離培養(yǎng)的混合細胞群進行修復骨缺損。Arnsdorf等[25]證明，PDCs的異質性群體與NIH3T3成纖維細胞以相似的潛力表達成骨細胞樣和脂肪細胞樣標志物，從而認為骨膜內成纖維細胞可能也具有祖細胞樣潛力，在組織多系分化中發(fā)揮作用；體外培養(yǎng)擴增的原代PDCs可以作為組織工程應用來源，不需要廣泛的富集或分子標志分選。筆者認同此觀點，因為PDCs存在異質性，目前尚不清楚骨形成、血管生成、招募成骨細胞、支持血管這些功能是由單一細胞類型完成，還是由特定亞群協同完成。PDCs應是一個有機整體，其中的各種組分可能相互協調，相互促進，細胞分選可能會遠離骨膜組織本身在骨再生和修復中的天然作用。

種子細胞體外擴增能力是臨床應用時必須考慮的一個重要問題。實驗證明，PDCs在體外培養(yǎng)條件下保持快速增殖能力，沒有接觸抑制現象，能連續(xù)傳數代仍保留分化潛能。PDCs增殖速度顯著快于骨髓MSCs，在未來應用中可以縮短培養(yǎng)周期，降低消耗和污染的可能性。PDCs具有長的端粒，傳代30代后也不會出現衰老現象。從老年患者分離的PDCs，仍具有高增殖潛力和分化能力。相反，骨髓MSCs隨供體年齡增加，壽命縮短，呈現端?？s短和衰老現象，且骨髓MSCs數量和分化潛力也隨年齡降低。由于相當多老年患者需要矯形外科手術，因此，PDCs的增殖特點，使其在再生治療的潛力更大。

3 生長因子調節(jié)骨膜來源細胞分化能力

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMPs)是一組多功能生長因子，在骨骼發(fā)育、修復和再生的早期階段，招募局部祖細胞進入骨膜和內膜并決定其分化方向，參與所有物種的骨和軟骨發(fā)育。獨特的骨再生能力使其成為用于骨組織修復和再生的誘導因子。Wang等[26]證明，在愈合初期刪除BMP-2基因將導致骨膜介導的骨痂形成消失，說明內源性表達的BMP-2對修復過程中PDCs的成骨和成軟骨分化相當重要；而外源導入的BMP-2能以劑量依賴方式增強PDCs的成骨分化能力。

利用基因工程技術遺傳修飾PDCs，外源性導入生長因子是改進其功能的重要方法。Sun等[2]利用復制缺陷型腺病毒轉運BMP-2對來自兔的PDCs進行遺傳修飾，并用于修復兔下頜骨缺損。結果表明，PDCs是基因轉運的優(yōu)秀靶細胞，易被腺病毒載體轉導。基因修飾后的PDCs不僅保持較高的增殖能力，而且處于更強的分化狀態(tài)。此外，基因修飾的PDCs能通過分泌生長因子誘導其他未分化干細胞或受體部位細胞分化和骨形成。Samee等[27]聯合轉染BMP-2和血管內皮生長因子(vascular endothelium growth factor, VEGF)，增強了PDCs成骨分化和骨形成能力。其原因之一是骨形成需要內皮細胞和成骨細胞的協同作用，這一過程被多種生長因子和細胞因子介導。BMPs與血管生成相關生長因子協同作用能進一步刺激骨形成[28-29]。研究表明，PDCs能表達VEGF及其受體，VEGF可以作為一種自分泌生長因子，用于PDCs的成骨分化。PDCs上的VEGF受體與血管形成無關，只促進成骨作用[4,30-31]。

此外，堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)能在骨再生的早期階段，增強PDCs的分裂增殖活性，從而增加分裂期PDCs的數量[32]。激活PDCs中Hedgehog (Hh) 信號通路，可以通過增強供體細胞的存活、分化和新生血管化改進骨缺損的重建[33]。

4 骨膜來源細胞具有致血管生成潛力

血管生成(vascularization)在骨發(fā)育和骨折修復中有重要作用。臨床實踐表明，缺乏活細胞的異體移植物與宿主骨的整合(osseointegration)緩慢而有限。移植部位血管系統的血液供應對維持成骨細胞的存活并促進移植物愈合和融入是必要的。有研究顯示，在皮下骨移植模型中新鮮異體移植物比凍存異體移植物對來自宿主的血管形成應答大5～10倍，證明了血管生成和成骨之間的相互作用在骨再生和修復中的重要性。骨膜是高度血管化組織，能為骨和骨骼肌提供血液供應，其中的PDCs必定在血管生成中扮演重要角色。van Gastel等[34]首次描述了小鼠PDCs的致血管生成性質。當接種有PDCs的磷酸鈣支架植入小鼠皮下后，PDCs能顯著吸引新生血管進入支架材料。而且，PDCs與內皮細胞聯合接種時，在體內形成的新生血管數要高于每種細胞單獨接種形成的血管數量。表明PDCs的存在增強了宿主的血管形成應答：一方面，PDCs能表達并分泌血管生長因子VEGF，增強內皮細胞的增殖和存活[30]；另一方面，PDCs可以通過與內皮細胞形成血管網絡，獲得周皮細胞樣表型，從而在結構上促進新生血管化。這也為組織工程構建血管化人工骨提供一種新思路。骨組織工程選擇的細胞來源不僅要考慮成骨性質，而且也要關注致血管生成潛力，因此，PDCs的優(yōu)勢特征使其成為骨再生治療的理想細胞來源。

5 基于骨膜來源細胞構建擬生態(tài)骨膜

臨床實踐已證明，保留骨膜的完整性能顯著提高骨移植物的融合和重塑?；诋斍案杉毎飳W、基因治療和生物材料裝配方面的研究進展，有學者提出應用組織工程原理，制備模擬天然骨膜結構和功能的骨膜替代物，覆蓋并活化任何大小或形狀的異體骨或骨替代物，增強其骨修復和再生能力。人們已開始嘗試構建這種基于細胞的擬生態(tài)骨膜(biomimetic periosteum)，來彌補骨組織工程修復骨缺損中骨膜缺失的不足。

了解細胞自我組裝和表型調節(jié)的機制是模擬天然組織從頭合成的基礎。Evans等[35]利用固體支持脂雙層(solid supported lipid bilayer, SLB)膜系統，從細胞之間的連接作用角度闡述了人PDCs引導組織形成(de novo tissue generation)的機制他們用重組的細胞黏附蛋白N-cadherin使SLB功能化后，高密度接種PDCs后，與接種在玻璃片上的PDCs進行瞬時表型和基因型差異比較。結果顯示，N-cadherin功能化的SLB促進PDCs聚集，但不伴隨PDCs中N-cadherin轉錄水平顯著改變。相反，接種在非功能化SLB上的細胞不貼壁，但PDCs中N-cadherin轉錄顯著上調。MSCs聚集是骨形成關鍵步驟。N-cadherin是MSCs聚集的標志，敲除N-cadherin將擾亂MSCs聚集和軟骨形成。本研究表明，PDCs表達N-cadherin，為軟骨內和膜內成骨提供分子基礎，因此,在構建擬生態(tài)骨膜時首先要考慮細胞外基質在PDCs成骨分化中的作用。

失活的異體移植物是目前修復大段骨缺損廣泛使用的材料，但存在較高的移植后10年骨折發(fā)生率。異體移植物愈合比自體移植物差，部分歸因于缺乏骨膜調控的重塑。Hoffman和Benoit[36]提出,用含有可調節(jié)且可降解的聚乙二醇水凝膠制備組織工程化“擬生態(tài)骨膜”覆蓋異體移植物，從而使其更適于細胞接種，更好地模擬自體移植物愈合期間細胞密度和持久性。通過顯微CT、力學實驗和組織學分析，證明了這種組織工程化骨膜替代物能使小鼠股骨缺損的愈合效果更佳。此外，還可從細胞密度、水凝膠組成和遺傳修飾等方面改進組織工程化骨膜的特性，啟動種子細胞和/或宿主-材料之間的相互作用，進一步改進異體移植物修復效果，減少或消除與異體移植物失敗相關的修復手術。

總之，骨膜組織相對容易獲得，PDCs能進行體外分離培養(yǎng)，并保持比骨髓MSCs更快的增殖能力，具備MSCs表型特征，在適當的體外誘導條件下能向成骨細胞、成軟骨細胞和成脂肪細胞分化，其增殖和分化能力不受年齡因素影響。這些特點使PDCs必然會成為骨組織工程研究中種子細胞的選擇熱點。動物試驗也已證明，PDCs在組織工程修復臨界大小骨缺損中的潛力。在未來，應從遺傳學、細胞生物學、材料學等方面充分開發(fā)PDCs在骨修復重塑中的功能，使其在基于細胞治療的骨組織工程中發(fā)揮更大作用。

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261021 山東 濰坊，中國人民解放軍第八十九醫(yī)院 骨科實驗室

李 婧(1974-)，女，遼寧興城人，副主任技師，博士.

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.08.016

2015-04-12)