吳登偉, 王毅剛, 鄭婷婷, 鄭旭升, 周秀梅, 許傳蓮

(浙江理工大學生命科學學院, 杭州 310018)

黃酮類化合物與阿霉素聯(lián)用對乳腺癌細胞MCF7凋亡的影響

吳登偉, 王毅剛, 鄭婷婷, 鄭旭升, 周秀梅, 許傳蓮

(浙江理工大學生命科學學院, 杭州 310018)

為了考察6種不同結(jié)構(gòu)黃酮類化合物(5-OH-3′-OCH3黃酮,7-OH-3′-OCH3黃酮,7-OH-2′-OCH3黃酮,3,5,7,4′-4OH黃酮,5,7,3′,4′-4OH黃酮,Neodiosmin)對乳腺癌細胞MCF7的藥物敏感性,綜合運用MTT法,Hoechst 33342染色法以及流式細胞術(shù)評價黃酮類化合物與阿霉素聯(lián)用對MCF7的抑制效果。結(jié)果表明,部分黃酮類化合物細胞毒性較低,其中5-OH-3′-OCH3黃酮,7-OH-3′-OCH3黃酮,3,5,7,4′-4OH黃酮能明顯增強阿霉素對MCF7細胞的抑制作用。同時發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物與阿霉素聯(lián)用在MFC7細胞上所表現(xiàn)出來的協(xié)同作用可能與黃酮類化合物A環(huán)上5位與7位的羥基取代相關(guān)。

黃酮類化合物; 阿霉素; 乳腺癌細胞MCF7; 聯(lián)合用藥; 凋亡

0 引 言

黃酮類化合物廣泛存在于蔬菜水果等植物中,是一類天然多酚化合物,目前已被鑒定的黃酮化合物超過9000種,并且不斷有新的結(jié)構(gòu)被發(fā)現(xiàn)[1]。黃酮類化合物毒性小,分布廣泛,藥理活性豐富,被證明具有抗氧化[2]、抗炎[3]、抗菌[4]、抗病毒[5]等作用。近年來研究發(fā)現(xiàn),黃酮類化合物具有良好的體內(nèi)外抗腫瘤活性[6-7],可以同化療藥物聯(lián)合使用,增加藥物的敏感性,達到逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的效果。例如,白血病耐藥細胞HL-60/ADM耐藥株的體外實驗發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物槲皮素能明顯提高化療藥物的敏感性[1]。而目前對于黃酮類化合物增強化療藥物對乳腺癌細胞MCF7抑制作用的研究相對缺乏,本研究主要利用MTT比色法檢測黃酮類化合物增強阿霉素對乳腺癌細胞MCF7的抑制效果,并利用hoechst33342染色法及流式細胞術(shù)分析黃酮類化合物與阿霉素聯(lián)合作用對乳腺癌細胞MCF7細胞凋亡的影響,考察乳腺癌細胞MCF7對治療藥物阿霉素的敏感性,為逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥性、增強化學藥物治療效果提供新的思路和實驗依據(jù)。

1 實 驗

1.1 實驗材料與儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱(德國HERAEUS公司);超凈工作臺(美國NUAIRE公司);DK-8D型恒溫水槽(上海一恒科技有限公司);超低溫冰箱(美國NUAIRE公司);酶標儀(瑞士TECAN公司);流式細胞儀(美國BD公司);熒光倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司);液氮罐(英國ICI公司);高速冷凍離心機(日本HITACHI公司)。

MCF7細胞購自中科院上海細胞庫;5-OH-3′-OCH3黃酮、7-OH-3′-OCH3黃酮、7-OH-2′-OCH3黃酮、Neodiosmin(新地奧明)購自美國SIGAMA公司;3,5,7,4′-4OH黃酮、5,7,3′,4′-4OH黃酮購自中國藥品生物制品檢定所;MEM培養(yǎng)基,胎牛血清(FBS)購自美國GIBCOBRL公司;胰酶,四甲基偶氮唑藍(MTT),阿霉素(Doxorubicin)購自美國SIGAMA公司;二甲基亞砜(DMSO)購自杭州屹達化工有限公司;Hoechst33342購自上海碧云天生物技術(shù)研究所;Annexin V-ITC細胞凋亡檢測試劑盒購自上海凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 MCF7細胞培養(yǎng)

MCF7細胞株用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的MEM培養(yǎng)基,于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),傳代時用0.25%的胰酶消化。

1.2.2 檢測黃酮類化合物對MCF7細胞的抑制效果

1.2.3 檢測黃酮類化合物作用前后阿霉素對MCF7 細胞的抑制效果

取對數(shù)期生長的MCF7細胞,以8×103個/孔接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h,加入終濃度為40 μmol/L的黃酮類化合物,同時加入終濃度為0.03、0.1、0.3、1、3、10 μmol/L的阿霉素,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,加入MTT(5 mg/mL,10 μL/孔),繼續(xù)避光孵育4 h,棄上清,每孔加入DMSO 150 μL,振蕩10 min,用酶標儀測定570 nm波長處的吸光度A。計算阿霉素對MCF7細胞增殖的抑制率及IC50。

1.2.4 檢測不同濃度黃酮類化合物對阿霉素抑制 MCF7效果的影響

取對數(shù)期生長的MCF7細胞,以8×103個/孔接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h,加入終濃度為0.2 μmol/L的阿霉素,同時加入終濃度為10、20、40 μmol/L黃酮類化合物,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,加入MTT(5 mg/mL,10 μL/孔),繼續(xù)避光孵育4 h,棄上清,每孔加入DMSO 150 μL,振蕩10 min,用酶標儀測定570 nm波長處的吸光度A。計算不同濃度的黃酮化合物與阿霉素聯(lián)用對MCF7細胞增殖的抑制率。

1.2.5 Hoechst染色法觀察黃酮類化合物聯(lián)合阿霉 素促MCF7細胞的凋亡情況

取對數(shù)期生長的MCF7細胞,以8×103個/孔接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h,分別加入終濃度為0.2 μmol/L的阿霉素與終濃度為40 μmol/L的黃酮類化合物,培養(yǎng)24 h,加入終濃度為5 μg/mL的Hoechst 33342,染色30 min,在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測黃酮類化合物聯(lián)合阿霉素對 MCF7細胞凋亡影響

取對數(shù)期生長的MCF7細胞,以8×103個/孔接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h,分別加入終濃度為0.2 μmol /L的阿霉素與終濃度為40 μmol /L的黃酮類化合物,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集細胞,4 000 r/min離心5 min,預冷PBS洗1遍,4 000 r/min離心5 min,棄上清,加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液,輕輕重懸細胞,加入5 μL Annexin V-FITC,輕輕混勻,室溫避光孵育10 min,4 000 r/min離心5 min棄上清,加入190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液,輕輕重懸細胞,加入10 μL碘化丙啶染色液,輕輕混勻,冰浴避光,隨即用流式細胞儀進行檢測。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 黃酮類化合物對MCF7細胞的細胞抑制效果

黃酮類化合物基本結(jié)構(gòu)如圖1,6種黃酮化合物的結(jié)構(gòu)見圖2,同時它們(5-OH-3′-OCH3黃酮、7-OH-3′-OCH3黃酮、7-OH-2′-OCH3黃酮、3,5,7,4′-4OH黃酮、5,7,3′,4′-4OH黃酮、Neodiosmin)對MCF7細胞的IC50分別為209.51、344.39、126.14、191.27、147.07、241.80 μmol/L。圖3顯示6種黃酮類化合物對MCF7的抑制作用呈濃度依賴性增強,且在終濃度為40 μmol/L時整體上對細胞的抑制作用都較小,僅有5-OH-3′-OCH3黃酮與7-OH-2′-OCH3黃酮對細胞的抑制率高于30%。

2.2 黃酮類化合物對阿霉素化療效果的影響

2.2.1 黃酮類化合物作用后阿霉素對MCF7細胞 的抑制率及IC50值

表1顯示阿霉素對MCF7細胞的抑制作用呈劑量依賴性。當阿霉素濃度低于1 μmol/L時,與黃酮類化合物(40 μmol/L)聯(lián)用對MCF7細胞增殖抑制率基本都明顯(P>0.05)高于阿霉素單獨作用;當阿霉素濃度為10 μmol/L時,只有與5-OH-3′-OCH3黃酮和3,5,7,4′-4OH黃酮聯(lián)用的高于單獨用藥的抑制率。采用金氏公式分析兩種藥物聯(lián)用的合并用藥效應(yīng),結(jié)果表明5-OH-3′-OCH3黃酮、7-OH-3′-OCH3黃酮及3,5,7,4′-4OH黃酮與阿霉素聯(lián)合作用Q值>1.15,表明與阿霉素聯(lián)用具有協(xié)同作用;7-OH-2′-OCH3黃酮與阿霉素聯(lián)合作用Q值在0.85～1.15之間，表明與阿霉素聯(lián)用為相加作用;而Neodiosmin和5,7,3′,4′-4OH黃酮與阿霉素聯(lián)合作用Q值<0.85,表明與阿霉素聯(lián)用為拮抗作用。

注:與阿霉素單獨作用組比較*P<0.05,**P<0.01.

2.2.2 黃酮類化合物作用后阿霉素化療敏感性的影響

0.2 μmol/L阿霉素與10、20、40 μmol/L的黃酮類黃酮化合物聯(lián)合作用MCF7細胞,如圖4所示黃酮類化合物(3,5,7,4′-4OH黃酮,5-OH-3′-OCH3黃酮,7-OH-3′-OCH3黃酮,7-OH-2′-OCH3黃酮,5,7,3′,4′-4OH黃酮,Neodiosmin)對阿霉素的增敏作用隨濃度增大而增強,說明黃酮類化合物能在一定程度上增強阿霉素的化療敏感性。

2.2.3 Hoechst33342染色觀察黃酮類化合物作用 后阿霉素對MCF7細胞凋亡的影響

0.2 μmol/L阿霉素與40 μmol/L黃酮類化合物聯(lián)合作用MCF7細胞24 h,Hoechst33342染色30 min,結(jié)果如圖5所示。圖5可見，不加藥物處理的對照組細胞基本沒有發(fā)生凋亡現(xiàn)象,黃酮類化合物單獨處理組也較少發(fā)生凋亡現(xiàn)象,阿霉素單獨處理組則有凋亡小體(亮白色)出現(xiàn),而阿霉素與5-OH-3′-OCH3黃酮,7-OH-3′-OCH3黃酮,3,5,7,4′-4OH黃酮聯(lián)合作用MCF7細胞后凋亡小體較單獨阿霉素處理組有明顯增加,這表明上述幾類黃酮類化合物有增強阿霉素促凋亡的功效。

2.2.4 流式細胞術(shù)檢測黃酮類化合物聯(lián)合阿霉素 對MCF7細胞凋亡影響

0.2 μmol/L阿霉素單獨作用MCF7細胞凋亡及與40 μmol/L黃酮類化合物聯(lián)合作用MCF7細胞48 h,結(jié)果如圖6及圖7顯示,3,5,7,4′-4OH黃酮,5-OH-3′-OCH3黃酮,7-OH-3′-OCH3黃酮與阿霉素聯(lián)合作用的凋亡率比阿霉素單獨作用高,說明上述黃酮類化合物具有增強阿霉素誘導MCF7細胞凋亡的作用。

3 討 論

乳腺癌是女性多發(fā)的惡性腫瘤之一,據(jù)統(tǒng)計世界范圍內(nèi)每年新增患者約200萬人,死亡率呈逐年上升趨勢[8]。近年來我國乳腺癌發(fā)病率以每年將近3%的幅度遞增,對中國婦女的健康危害非常大[9]。

阿霉素作為臨床常用的治療乳腺癌藥物,是一種細胞毒素類抗腫瘤藥物?？梢种艱NA及DNA依賴性的RNA的合成,抗瘤譜較廣,對多種腫瘤均有作用,但是其容易引起嘔吐惡心,脫發(fā),高熱,靜脈炎等不良反應(yīng)[10],其不良反應(yīng)與用藥劑量具有一定正相關(guān)性,這也在一定程度上限制其在臨床上的使用。此外,單一使用阿霉素對乳腺癌患者進行化療時,在中后期藥效明顯減弱,容易產(chǎn)生多藥耐藥性(multiple drug resistance, MDR)[11]。

鑒于阿霉素單獨用藥存在的缺點,發(fā)展聯(lián)合用藥成為阿霉素治療乳腺癌的新方案。本實驗將6種不同結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物分別與阿霉素聯(lián)合作用于乳腺癌MCF7細胞,發(fā)現(xiàn)其中4種黃酮類化合物(5-OH-3′-OCH3黃酮,7-OH-3′-OCH3黃酮,3,5,7,4′-4OH黃酮,Neodiosmin)能顯著增強低濃度阿霉素(0.01 μmol/L)對MCF7細胞的生長抑制效果(P<0.05),同時隨黃酮類化合物濃度升高其增強效果也越明顯。這說明上述幾類黃酮類化合物能在保持阿霉素的化療效果的基礎(chǔ)上通過降低阿霉素用量來大大降低其副作用;另外一方面,黃酮類化合物的抗腫瘤活性研究一直是國內(nèi)外的熱點,例如,Lepley等[12]研究發(fā)現(xiàn)芹菜素能阻斷人白血病細胞株HL-60、小鼠皮膚308細胞株的細胞周期于G2/M期,抑制細胞增殖;金雀異黃酮抑制乳腺癌細胞增殖,且同時抑制細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。Danyetta等[13]研究發(fā)現(xiàn)異黃酮對乳腺癌細胞增殖、雌激素受體親和力及細胞凋亡有影響。

4 結(jié) 論

a) MTT實驗表明7-OH-3′-OCH3黃酮,3,5,7,4′-4OH黃酮,5,7,3′,4′-4OH黃酮,Neodiosmin四個黃酮化合物本身對MCF7的抑制作用并不明顯;進一步采用Hoechst 33342染色法以及流式細胞術(shù)考察阿霉素與黃酮類化合物聯(lián)用發(fā)現(xiàn)5-OH-3′-OCH3黃酮,7-OH-3′-OCH3黃酮及3,5,7,4′-4OH黃酮與阿霉素聯(lián)合能表現(xiàn)出很好的協(xié)同作用,明顯增強阿霉素對MCF7細胞的抑制效果。

b) 初步的構(gòu)效關(guān)系分析結(jié)果表明:黃酮類化合物上B環(huán)的取代基團數(shù)目越多,其在與阿霉素聯(lián)用過程中表現(xiàn)出的拮抗效果就越強;A環(huán)和C環(huán)取代基團數(shù)目越多,在與阿霉素聯(lián)用過程中表現(xiàn)出的協(xié)同效果就越強;A環(huán)5位的羥基取代在表現(xiàn)協(xié)同作用時較A環(huán)7位更強,而A,B及C環(huán)羥基取代越多,在一定程度上與阿霉素表現(xiàn)出的協(xié)同作用也越強,可能與其抗氧化性越強有一定關(guān)系。總之,黃酮類化合物與阿霉素聯(lián)用,其羥基取代基的數(shù)目和位置對協(xié)同效果有顯著的影響。

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(責任編輯： 許惠兒)

Inhibitory Effect of Doxorubicine Combined with Flavonoidson MCF7 Breast Cancer Cell

WU Deng-wei, WANG Yi-gang, ZHENG Ting-ting, ZHENG Xu-sheng, ZHOU Xiu-mei, XU Chuan-lian

(School of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

To investigate inhibition effects of Doxorubicine combined with 6 different kinds of flavonoids (5-OH-3′-OCH3flavonoid, 7-OH-3′-OCH3flavonoid, 7-OH-2′-OCH3flavonoid, 3, 5, 7, 4′-4OH flavonoid, 5, 7, 3′, 4′-4OH flavonoid, Neodiosmin) on MCF7 breast cancer cell, MTT assay, hoechst 33342 dyeing and flow cytometry were applied to assess inhibition effects of Doxorubicine combined with flavonoids. The result shows that some flavonoids have low cytotoxicity, such as 5-OH-3′-OCH3flavonoid, 7-OH-3′-OCH3flavonoid and 3, 5, 7, 4′-4OH flavonoid which can greatly enhance inhibition effect of Doxorubicine on MCF7 cell. And synergistic effect of Doxorubicine combined with flavonoids on MCF7 cell may be related to hydroxy replacement (5-OH, 7-OH) of flavonoids.

flavonoids; Doxorubicine; breast cancer cell MCF7; drug combination; apoptosis

1673- 3851 (2015) 05- 0706- 06

2014-12-12

國家自然科學基金項目(81272687)

吳登偉(1991-),男,浙江溫州人,碩士研究生,主要從事藥用植物生態(tài)方面的研究。

許傳蓮,E-mail:chuanlianxu@163.com

R961

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