鄭羅凝, 徐增輝, 王 真, 錢其軍,

(1. 浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 杭州 310018; 2. 第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院, 上海 200438)

基于OptiPrep的循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集體系研究

鄭羅凝1, 徐增輝2, 王 真2, 錢其軍1,2

(1. 浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 杭州 310018; 2. 第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院, 上海 200438)

建立一種簡易高效的外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell, CTC)富集方法。配比不同濃度的OptiPrep溶液梯度離心分離外周血各細(xì)胞成分,比較OptiPrep液與現(xiàn)行Ficoll液富集腫瘤細(xì)胞的效率、回收率、活性率。以此系統(tǒng)富集腫瘤患者血樣中的CTC,結(jié)合免疫磁珠篩選、染色體原位熒光雜交和表面抗原免疫熒光技術(shù)精確鑒定CTC細(xì)胞。結(jié)果顯示OptiPrep液以1.079 g/mL的密度濃度在1 900 r/min離心20 min為最優(yōu)分離條件。32例臨床腫瘤患者血樣的CTC檢測實(shí)驗(yàn)中,均發(fā)現(xiàn)有循環(huán)腫瘤細(xì)胞的存在。結(jié)果表明基于OptiPrep液結(jié)合免疫磁珠篩選能有效富集外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞,為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展CTC的計(jì)數(shù)、培養(yǎng)等研究奠定基礎(chǔ)。

OptiPrep分離介質(zhì); 密度梯度離心法; 循環(huán)腫瘤細(xì)胞; 免疫磁珠

0 引 言

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell, CTC)從原發(fā)腫瘤病灶脫落下來,通過血液循環(huán)系統(tǒng)傳播到遠(yuǎn)端器官,在新的環(huán)境中生長并形成轉(zhuǎn)移病灶。目前認(rèn)為,腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)鍵在于CTC潛在的侵襲能力[1]。有報(bào)道顯示CTC檢測及其預(yù)后相關(guān)性對(duì)于評(píng)估臨床治療效果十分有意義。除了轉(zhuǎn)移性癌癥患者的預(yù)后價(jià)值以外,CTC對(duì)于早期癌癥的預(yù)測價(jià)值也很有吸引力[2]。因而CTC成為研究癌癥治療和轉(zhuǎn)移潛在機(jī)制的重要生物標(biāo)志物。然而,外周血中能檢測到的CTC個(gè)數(shù)極少,每7.5 mL血液中可能僅含幾個(gè)[3],從而對(duì)血液中富集CTC這一技術(shù)提出了挑戰(zhàn)。

當(dāng)前的富集方法主要是基于細(xì)胞的物理特性(大小和密度),包括密度梯度離心分離,微孔過濾,ISET(上皮腫瘤細(xì)胞大小分選)等[4-5]。已經(jīng)獲得美國FDA批準(zhǔn)的CellSearch用作晚期乳腺癌、結(jié)腸直腸癌以及前列腺癌的預(yù)后[6]。它是基于細(xì)胞表面特異生物標(biāo)記物,從而分離血液中的CTC,以此為技術(shù)的方法必須預(yù)先了解待測癌細(xì)胞的特異抗原,因而不能通用于所有癌癥,容易漏檢或錯(cuò)檢。另外,此技術(shù)試驗(yàn)成本高(約5000元/例),設(shè)備費(fèi)用更是高昂,一般實(shí)驗(yàn)室難以承受。為了克服這種局限性,考慮去除血液中的紅細(xì)胞、血漿和大量白細(xì)胞,留存CTC以達(dá)到富集的目的。

密度梯度離心是根據(jù)細(xì)胞密度分選多種細(xì)胞,可有效去除紅細(xì)胞和血漿等。分離的關(guān)鍵因素是高質(zhì)量的分離介質(zhì)。目前應(yīng)用于細(xì)胞分離的介質(zhì)主要有Ficoll、Percol、Nycodenz和Onco-Quick[7],Percol的價(jià)格雖然較低,但是很難聚集細(xì)胞形成清晰的條帶,Nycodenz為固體,配制復(fù)雜且不易控制濃度。本研究為采用OptiPrep法分離外周血CTC。OptiPrep是一種60%的Iodixanol水溶液,Iodixanol則是非離子等滲分子[8]。相比而言,OptiPrep液體配制簡便,對(duì)細(xì)胞的損傷較小,富集條帶明顯,細(xì)胞純度高。已有研究發(fā)現(xiàn)OptiPrep主要應(yīng)用于鼠原代肝星狀細(xì)胞的分離純化,且使用OptiPrep純化胰島細(xì)胞可能有助于增加胰島移植的成功[9]。本文旨在探討OptiPrep液富集CTC的可行性,建立一種合理、便捷的分離方法,為實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)的CTC檢測和分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 血樣:取長海醫(yī)院血庫健康人外周血10 mL全血30份用于試驗(yàn);實(shí)體腫瘤患者血樣由東方肝膽外科醫(yī)院生物治療科提供,入組患者多為中晚期腫瘤,采血前多接受過手術(shù)、放療、化療等相關(guān)治療,均已獲得患者知情同意。

1.1.2 人腫瘤細(xì)胞株:肝癌細(xì)胞QGY-7701、SMMC-7721、Huh-7,卵巢癌細(xì)胞HO-8910,肺癌細(xì)胞A549均來自東方肝膽外科醫(yī)院基因與病毒治療實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 試劑與儀器:Hepes(上海博光生物科技有限公司),OptiPrep(Sigma公司),Ficoll(GE Healthcare公司),Viacount(密理博中國有限公司),CD45-FITC(美國BD公司),CFSE(eBioscience公司)。低速臺(tái)式大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),Guava流式細(xì)胞儀(密理博中國有限公司),光學(xué)顯微鏡(上海悌可光電科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 OptiPrep離心分離外周血

最佳離心條件的確定:離心機(jī)使用時(shí)選擇慢制動(dòng)狀態(tài),避免短時(shí)加速使各密度梯度細(xì)胞發(fā)生混雜。將外周血與生理鹽水1∶1混合稀釋,沿壁緩慢加至1.079 g/mL細(xì)胞分離液液面上。分別以不同離心轉(zhuǎn)速分離,記錄不同時(shí)間紅細(xì)胞沉淀體積。

各層細(xì)胞CD45標(biāo)記流式檢測:密度梯度離心后分別吸取上清液、白膜層和分離液,各取200 uL細(xì)胞懸液,加CD45-FITC熒光單抗,輕輕混勻,4℃避光孵育15～30 min,重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測CD45+陽性細(xì)胞比例。

1.2.2 篩選OptiPrep分離液最佳密度濃度

3種密度濃度的OptiPrep分離液配制:室溫條件下,將60% OptiPrep原液稀釋至40%工作液,與緩沖液按比例混合,充分混勻后得到3種密度濃度的分離液:1.074、1.079、1.085 g/mL。4℃避光保存。

Viacount試劑盒檢測3種密度濃度的OptiPrep液分離外周血單核細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力。

1.2.3 OptiPrep離心分離腫瘤細(xì)胞

CFSE熒光標(biāo)記腫瘤細(xì)胞:用PBS等合適的緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度少于107個(gè)/mL;加入1 uL濃度為5 uM的CFSE工作液,輕輕吹打混勻;37℃避光孵育15 min;加入4～5倍體積的完全培養(yǎng)基,冰上孵育5 min;離心后去上清,加入1 mL PBS溶液,再離心后去上清,重復(fù)清洗3遍。流式檢測腫瘤細(xì)胞CFSE熒光表達(dá)。

外周血腫瘤細(xì)胞的分離:將帶有熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞株QGY-7701加入外周血混勻,以此模擬CTC,密度梯度離心后分別吸取白膜層和分離液,各取200 uL細(xì)胞懸液上機(jī)檢測CFSE陽性細(xì)胞比例。

1.2.4 比較OptiPrep液與Ficoll液的富集效率

將帶有熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞QGY-7701、SMMC-7721、Huh-7、HO-8910、A549等量加入外周血混勻(1×105個(gè)/mL),分別在兩種分離液中密度梯度離心后吸取白膜層,流式檢測富集細(xì)胞中CFSE陽性細(xì)胞的比例并進(jìn)行比較。

1.2.5 比較OptiPrep液與Ficoll液的回收效率

由于實(shí)際患者血液中CTC數(shù)量極少,為檢驗(yàn)建立的方法是否能夠富集到極少量的腫瘤細(xì)胞,逐個(gè)挑取了50個(gè)左右的單細(xì)胞加入5 mL外周血中,密度梯度離心分離進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。單個(gè)腫瘤細(xì)胞的挑選采用CellEctor Plus細(xì)胞分選系統(tǒng)。

極少量腫瘤細(xì)胞的富集回收效率:將帶有熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞QGY-7701適量加入5 mL外周血混勻(以50個(gè)為宜),分別在兩種分離液中密度梯度離心后吸取白膜層,固定細(xì)胞后將細(xì)胞懸液涂于載玻片上,避光晾干后蓋上蓋玻片,熒光顯微鏡下觀察帶有熒光的細(xì)胞即為回收得到的腫瘤細(xì)胞,計(jì)數(shù)并記錄結(jié)果。

1.2.6 腫瘤患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測試驗(yàn)

患者7.5 mL外周血進(jìn)行OptiPrep介質(zhì)分離富集后,結(jié)合免疫磁珠純化,將獲得的細(xì)胞固定后,進(jìn)行原位熒光雜交和免疫細(xì)胞化學(xué)染色以鑒別循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 OptiPrep離心分離外周血

2.1.1 細(xì)胞分層效果的研究

OptiPrep液離心后細(xì)胞分層效果明顯,利用不同密度細(xì)胞沉降系數(shù)的不同能夠有效地富集單核細(xì)胞形成云霧狀的白膜層,清晰可見于分離液上層(圖1b)。

OptiPrep液離心條件的優(yōu)選:外周血密度梯度分離后,在不同時(shí)間觀察紅細(xì)胞沉淀體積隨著時(shí)間的增加而增長,分離液由渾濁逐漸變清,并且比較20 min和30 min沒有顯著差異。同時(shí)選取不同離心轉(zhuǎn)速重復(fù)實(shí)驗(yàn),由表1可見1 600、1 800 r/min離心力較弱,液體分層不明顯,紅細(xì)胞沉降體積較少,而1 900 r/min和2 100 r/min的分離效果相似,為保護(hù)細(xì)胞活性因而選擇1 900 r/min離心20 min為最優(yōu)條件進(jìn)行后續(xù)分離實(shí)驗(yàn)(表1)。

2.1.2 流式檢測各層單核細(xì)胞

流式結(jié)果顯示,白膜層中大部分細(xì)胞表達(dá)CD45+,分離液中僅部分細(xì)胞表達(dá)CD45+,而上清液中的細(xì)胞量很少且均為CD45-細(xì)胞(圖2)。

2.1.3 篩選OptiPrep最優(yōu)密度濃度

從表2可知,外周血中單核細(xì)胞數(shù)在OptiPrep液密度濃度1.085 g/mL時(shí)最多,并隨分離液密度濃度的減少而呈現(xiàn)下降趨勢;同時(shí),3種密度濃度的OptiPrep液獲得的細(xì)胞活性率均在90%以上,活力較高。比較分析1.079 g/mL的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活性率比1.074 g/mL的有顯著差異(P<0.05),對(duì)比1.085 g/mL無顯著差異;細(xì)胞活性率1.079 g/mL的最高,并且所有報(bào)道中細(xì)胞分離液的密度為1.077 g/mL,因而選取1.079 g/mL的OptiPrep液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 OptiPrep離心分離腫瘤細(xì)胞

選取肝癌細(xì)胞株QGY-7701,CFSE標(biāo)記腫瘤細(xì)胞后,流式檢測熒光信號(hào)表達(dá)為100%(圖3a)。

將帶有熒光的肝癌細(xì)胞QGY-7701加入外周血中,模擬外周血分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞,流式檢測CFSE熒光發(fā)現(xiàn),在白膜層中部分細(xì)胞表達(dá)CFSE,分離液中細(xì)胞不表達(dá)CFSE(圖3b、c)。

2.3 比較OptiPrep液與Ficoll液的富集效率

2.3.1 不同腫瘤細(xì)胞株的比較

將CFSE熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞QGY-7701、SMMC-7721、Huh-7、HO-8910、A549流式檢測(見圖4),完全陽性表達(dá)的細(xì)胞以1×105個(gè)/mL加入外周血混勻后分離獲取細(xì)胞富集層。流式細(xì)胞術(shù)檢測QGY-7701-CFSE陽性細(xì)胞百分比,在OptiPrep液與Ficoll液中分別為4.67%和2.89%,OptiPrep液富集腫瘤細(xì)胞的效率高于Ficoll液。其他幾種腫瘤細(xì)胞Huh7、SMMC-7721、HO-8910和A549在OptiPrep液中CFSE的陽性細(xì)胞百分比為2.07%、3.34%、3.70%、3.50%,均高于Ficoll液中CFSE的陽性細(xì)胞百分比1.38%、1.89%、2.52%、2.91%,兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3.2 比較OptiPrep液與Ficoll液的回收效率

單個(gè)腫瘤細(xì)胞的挑選:由于CTC的稀有性,利用少量腫瘤細(xì)胞混入血液模擬外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

借助光學(xué)立體顯微鏡直接觀察到目的細(xì)胞,通過操作毛細(xì)玻璃管吸取單個(gè)腫瘤細(xì)胞(圖5)。

比較兩種分離介質(zhì)的腫瘤細(xì)胞回收率結(jié)果(表3):5次OptiPrep的回收率平均值為84.6%,比Ficoll的81.9%略高(P=0.086),表明OptiPrep分離紅細(xì)胞、富集腫瘤細(xì)胞的效果與商品化的Ficoll試劑有較好的一致性。

2.4 患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測

用OptiPrep法對(duì)32例腫瘤患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行富集,再用抗CD45免疫磁珠進(jìn)一步去除大量的白細(xì)胞,最后通過免疫熒光染色和熒光原位雜交技術(shù)對(duì)CTC進(jìn)行鑒定和計(jì)數(shù)。細(xì)胞表型為DAPI+CD45-,并且染色體異?；駽K18+的即定義為循環(huán)腫瘤細(xì)胞。32例患者均檢測到有循環(huán)腫瘤細(xì)胞,CK18表達(dá)陰性的有25例,其中14例肝癌相關(guān)的患者均無法檢測到CK18表達(dá)(表4)。

腫瘤細(xì)胞具有異質(zhì)性,不同腫瘤以及同一種腫瘤、甚至是同一患者的不同發(fā)展階段,其腫瘤細(xì)胞表面抗原均會(huì)發(fā)生變化[10]。本研究聯(lián)合了腫瘤細(xì)胞表面抗原的免疫熒光染色和染色體的原位熒光雜交技術(shù)檢測CTC,從表面標(biāo)記和染色體異常雙重角度鑒定CTC,相比CellSearch系統(tǒng)單一的表面抗原免疫熒光鑒定方法更具優(yōu)勢。實(shí)際檢驗(yàn)結(jié)果也表明,肝癌中CK18表達(dá)很少或不表達(dá),因而本研究采用的雙重鑒定法更能有效預(yù)防對(duì)CTC的漏檢、錯(cuò)檢(圖6)。

3 討 論

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)可作為一種癌癥血源性轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)記物。現(xiàn)有充分證據(jù)顯示CTC的檢測與癌癥的預(yù)后相關(guān),在臨床上通過監(jiān)測CTC評(píng)估治療效果,以減少疾病的復(fù)發(fā)和改善病人的管理,同時(shí)對(duì)于早期癌癥的發(fā)現(xiàn)也有意義[11]。但是,CTC在血液中的含量濃度非常低,數(shù)百萬的血液細(xì)胞中可能僅有一個(gè)腫瘤細(xì)胞,而目前的技術(shù)對(duì)檢測CTC十分困難,因而富集稀有CTC細(xì)胞并最大程度地去除血液中其他成分細(xì)胞是研究CTC的關(guān)鍵。目前最為常用的CTC富集方法是經(jīng)由FDA批準(zhǔn)上市的CellSearch系統(tǒng),它利用上皮細(xì)胞特異性抗原EpCAM陽性篩查CTC,但事實(shí)上這一標(biāo)志物的表達(dá)并不穩(wěn)定,多數(shù)惡性腫瘤會(huì)發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition, EMT),甚至約30%的上皮源性腫瘤不表達(dá)EpCAM,因而CellSearch方法限定CTC為EpCAM陽性細(xì)胞則可能漏檢上皮間質(zhì)化的腫瘤細(xì)胞。密度梯度離心結(jié)合免疫磁珠法能很好地避免這一缺陷,而其中分離介質(zhì)的選擇是密度梯度離心法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

比較幾種常用的血液分離介質(zhì):Percol是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒,價(jià)格較低,但很難聚集細(xì)胞形成清晰的條帶;Nycodenz為固體,溶解度小,配制復(fù)雜且不易控制濃度;Onco-Quick增加了一層濾膜,可避免全血與分離液的混合,但其敏感度低,易造成腫瘤細(xì)胞的丟失。選擇OptiPrep液作分離介質(zhì)是由其為無菌液體,易于稀釋為各種密度濃度,低滲透壓和不穿過生物膜等分子特性決定的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,OptiPrep液分離外周血能有效形成云霧狀的單核細(xì)胞層,清晰可見于分離液上層。離心后各分層細(xì)胞的流式檢測表明,白膜層細(xì)胞中CD45標(biāo)記的白細(xì)胞和CFSE標(biāo)記的QGY-7701腫瘤細(xì)胞陽性均較高,而分離液和上清中兩種細(xì)胞的陽性率很低甚至為陰性,上清中的細(xì)胞量也不多,說明需要富集的單核細(xì)胞主要聚集于白膜層中。

多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道中,外周血分離介質(zhì)的密度濃度一般為1.077 g/mL。本研究中涉及的3種密度濃度OptiPrep液中,3種密度濃度的OptiPrep液獲得的細(xì)胞活性率均在90%以上,活力較高,有助于后期獲取CTC并進(jìn)行培養(yǎng)研究。比較分析1.079 g/mL的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活性率比1.074 g/mL的有顯著差異(P<0.05),對(duì)比1.085 g/mL無顯著差異;細(xì)胞活性率1.079 g/mL的最高,并且所有報(bào)道中細(xì)胞分離液的密度為1.077 g/mL,因而選取1.079 g/mL的OptiPrep液作為最佳密度濃度分離外周血CTC。

由于CTC的稀有性,便于更好地收集CTC,使后期的檢測和鑒定實(shí)驗(yàn)相對(duì)簡單,需要進(jìn)一步檢測富集細(xì)胞中CTC的純度。通過3種肝癌細(xì)胞株和肺癌細(xì)胞株以及卵巢癌細(xì)胞株混入外周血模擬循環(huán)腫瘤細(xì)胞,比較OptiPrep液和Ficoll分離液的腫瘤細(xì)胞回收實(shí)驗(yàn),研究發(fā)現(xiàn)幾種腫瘤細(xì)胞在OptiPrep液中的富集效率均高于Ficoll液。另外,為了更真實(shí)的驗(yàn)證OptiPrep液富集CTC的效率并進(jìn)行回收率的計(jì)算,本研究中用毛細(xì)微觀進(jìn)行單細(xì)胞挑取50個(gè)左右的腫瘤細(xì)胞,混合入血后進(jìn)行回收率的研究。結(jié)果表明OptiPrep分離紅細(xì)胞、富集腫瘤細(xì)胞的效果較好。

綜上所述,本研究采用OptiPrep液作為分離外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離介質(zhì),其液體具有配制方便穩(wěn)定,分層清晰易于獲取細(xì)胞,滲透壓低對(duì)細(xì)胞損傷較小,富集的CTC純度高等優(yōu)點(diǎn),建立了一種簡易高效的CTC富集體系。在此基礎(chǔ)上,結(jié)合免疫磁珠篩選、染色體原位雜交和表面抗原免疫熒光技術(shù),建立了高效精確的CTC鑒定體系,為進(jìn)一步研究CTC甚至獲取單個(gè)CTC進(jìn)行分子鑒定奠定了基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯： 許惠兒)

Study on OptiPrep-based Enrichment System of Circulating Tumor Cell

ZHENG Luo-ning1, XU Zeng-hui2, WANG Zhen2, QIAN Qi-jun1,2

(1. School of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China;2. Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200438, China)

This study aimed to establish a simple and efficient enriching method of CTC (circulating tumor cell, CTC) in the peripheral blood. OptiPrep solutions with different concentration was prepared to separate different types of cells in peripheral blood, and the efficiency of enrichment, recovery, and cell viability of OptiPrep solution and Ficoll solution were compared. This system was used to enrich CTC in blood samples of cancer patients. CTC cells were identified in combination of immunomagnetic beads, chromosome fluorescence in situ hybridization and surface antigen immunofluorescence technique. The results show that the optimal separation condition is as follows: OptiPrep density 1.079 g/mL; the centrifugation speed and time 1 900 r/min, 20 min. During CTC examination of blood samples of 32 enrolled cancer patients, it is found that there exist circulating tumor cells. This study demonstrats that OptiPrep-based enrichment system combined with immunomagnetic beads could effectively capture circulating tumor cells in peripheral blood, which flays a foundation for CTC count, culture and other researches in laboratory.

OptiPrep separation medium; density gradient centrifugation; circulating tumor cells; immunomagnetic beads

1673- 3851 (2015) 05- 0699- 07

2014-11-24

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81071850,81301307)

鄭羅凝(1986-),女,浙江臺(tái)州人,碩士研究生,主要從事腫瘤基因治療方面的研究。

錢其軍,E-mail:qianqj@163.com

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