韓劍翠, 馬步云, 吳程雨, 王毅剛, 王世兵,b

(浙江理工大學(xué), a. 新元醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)研究所; b. 生命科學(xué)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心, 杭州 310018)

新型CDK抑制劑聯(lián)合ZD55-MnSOD溶瘤腺病毒體外抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的研究

韓劍翠a, 馬步云a, 吳程雨a, 王毅剛a, 王世兵a,b

(浙江理工大學(xué), a. 新元醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)研究所; b. 生命科學(xué)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心, 杭州 310018)

探究攜帶MnSOD的溶瘤腺病毒Ad-E1B55Kd-MnSOD(ZD55-MnSOD)聯(lián)合小分子藥物新型CDK抑制劑SNS-032對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620、HCT116、HT-29生長(zhǎng)的體外抑制效果,通過(guò)溶瘤病毒與藥物聯(lián)合,以期尋求較好的抗癌作用。實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)5 MOI的ZD55-MnSOD與不同劑量的SNS-032(0、20、40、80、160 ng/mL)聯(lián)合處理人結(jié)腸癌細(xì)胞株,發(fā)現(xiàn)病毒與藥物聯(lián)合處理有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。ZD55-MnSOD(5 MOI)與SNS-032(80 ng/mL)聯(lián)合處理SW620、HT-29細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合作用具有很大程度上的時(shí)間依賴(lài)性,Hoechst33342染色法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡也顯示ZD55-MnSOD與SNS-032聯(lián)合處理組的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象比二者單獨(dú)使用均具有顯著差異。該研究初步證實(shí)了ZD55-MnSOD與SNS-032聯(lián)合具有互補(bǔ)作用,能有效地在體外抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。

溶瘤腺病毒; SNS-032; 結(jié)腸癌; 抗癌作用

0 引 言

ZD55病毒是腫瘤特異性增殖型病毒,ZD55溶瘤病毒它缺少在正常細(xì)胞中復(fù)制所必需的基因,因此它可以特異性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制,然而在正常細(xì)胞中卻不復(fù)制,由此達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。目前,關(guān)于溶瘤腺病毒的研究迅速發(fā)展,可以通過(guò)改造啟動(dòng)子或者刪除非必須基因來(lái)達(dá)到較好的靶向效果,也有人用溶瘤腺病毒作為載體攜帶抗體或RNA治療癌癥[1-2]。中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所的劉新垣院士在2001年首次正式提出了癌癥的靶向基因-病毒治療(Targeting Gene-Virotherapy)的概念[3-4],基于此概念,本實(shí)驗(yàn)采用ZD55溶瘤腺病毒,因?yàn)樗軌驖M足腫瘤基因-病毒治療的兩個(gè)需要元素:具有靶向性和有可插入外源基因的位點(diǎn),這為我們進(jìn)一步開(kāi)展腫瘤的靶向基因-病毒治療提供了一個(gè)理想的平臺(tái)。本實(shí)驗(yàn)采用的是錳超氧化物歧化酶基因(manganese superoxide dismutase, MnSOD),它是一種新型腫瘤抑制基因[5],屬于超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)家族。SOD家族是將超氧陰離子轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫的抗氧化酶,可以保護(hù)細(xì)胞免受過(guò)氧化氫損傷,是機(jī)體內(nèi)的一系列抗氧化防御系統(tǒng)。MnSOD它作為細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶,不但可以清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧(reactive oxygen species, ROS),從而減少失衡或高濃度的ROS的產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一系列的損傷,對(duì)蛋白和核酸的損傷所導(dǎo)致的細(xì)胞的變異包括細(xì)胞的癌變和細(xì)胞的死亡,進(jìn)而防止細(xì)胞癌變[6]。實(shí)驗(yàn)證實(shí),MnSOD基因具有防止正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞的功能,并且可以抑制腫瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)和促使腫瘤細(xì)胞的凋亡,MnSOD基因在治療人結(jié)腸癌方面具有很好的抗腫瘤效果[7-10]。然而,ZD55-MnSOD又有一定的局限性,因?yàn)橐_(dá)到一定的治療效果就需要增加病毒的使用劑量,但是由于腺病毒它本身會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的傷害,所以高的病毒劑量會(huì)增加治療的風(fēng)險(xiǎn)。要實(shí)現(xiàn)使用很少的病毒劑量又要達(dá)到很好的治療效果,筆者認(rèn)為可否將病毒與新型小分子藥物進(jìn)行聯(lián)合治療。研究發(fā)現(xiàn)其與某些抗腫瘤藥物的機(jī)制很不相同,二者有可能存在協(xié)同性,將二者進(jìn)行聯(lián)合作用有可能進(jìn)一步有助于腫瘤方面的研究。

SNS-032(也稱(chēng)為BMS-387032)是一種新型CDK抑制劑,它可以有效地選擇性抑制CDK2、CDK7、CDK9[11-17]。對(duì)于SNS-032的研究已有很多報(bào)道,它的抗腫瘤效果在多種細(xì)胞中都有很好的作用,如結(jié)腸癌[18]、乳腺癌[19]、肺癌[12]。該藥已進(jìn)入臨床一期實(shí)驗(yàn)階段[16,20],無(wú)論是作用于實(shí)體瘤還是惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞,甚至是腫瘤干細(xì)胞都都顯示出很好的抗腫瘤效果[21],并且與一般的抗腫瘤藥物相比,其具有更高的選擇性,并且作用于實(shí)體瘤時(shí)毒性很弱,較低的藥物劑量便可達(dá)到很好的抗腫瘤效果[14,20,22]。然而此藥物與病毒聯(lián)合治療的效果尚不清楚,本實(shí)驗(yàn)研究溶瘤腺病毒ZD55-MnSOD與小分子藥物SNS-032聯(lián)合抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的抗癌作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物及試劑

腺病毒ZD55-MnSOD由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建完成。SNS-032購(gòu)自SELLECK公司。細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM及胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司。

1.1.2 人結(jié)腸癌細(xì)胞株及培養(yǎng)

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、HT-29、SW620均為本實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中,37℃,5% CO2條件下恒溫培養(yǎng),每2～3 d傳代1次。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞按每孔5 000個(gè)細(xì)胞植入96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),每孔加入培養(yǎng)液的體積為100 μL,待細(xì)胞貼壁后,加入相應(yīng)的病毒與藥物,體積為20 μL,37℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至指定的時(shí)間,每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT。37℃,5% CO2培養(yǎng)4 h后,每孔加入150 μL DMSO,劇烈震蕩10 min,在酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的吸光值。實(shí)驗(yàn)中設(shè)不加細(xì)胞的空白對(duì)照孔。按以下公式計(jì)算腫瘤細(xì)胞的存活率:

腫瘤細(xì)胞存活率=(處理組OD值—空白組OD值)/(對(duì)照組OD值—空白組OD值)×100%。

1.2.2 Western blot檢測(cè)溶瘤腺病毒ZD55-MnSOD 目的基因的表達(dá)

將5×105個(gè)腫瘤細(xì)胞鋪于6孔板,每孔加入培養(yǎng)液的體積為1.6 mL,待細(xì)胞貼壁后,按照要求分別加入5 MOI的病毒、終濃度為80 ng/mL的SNS-032及加入5 MOI的病毒聯(lián)合80 ng/mL的SNS-032各400 μL,以不加病毒的細(xì)胞作為對(duì)照,在37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,用4℃預(yù)冷的PBS洗板兩次,每孔加入100 μL裂解液,冰上充分裂解15 min后,收入離心管,100℃變性10 min,12 000 r/min,5 min。將上清分裝于-20℃?zhèn)溆?用時(shí)直接溶解上樣。將定量蛋白以每孔加入10 μg總蛋白樣加入SDS-PAGE電泳,電泳結(jié)束后按半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜(PVDF膜),5%的脫脂奶粉中封閉2 h,一抗孵育,按抗體說(shuō)明書(shū)上的最佳稀釋濃度稀釋加一抗(1∶1 000稀釋),室溫下于搖床孵育2 h,TBST洗膜3次,每次10 min,加入稀釋好的熒光二抗(1∶15 000稀釋),室溫下?lián)u床孵育45～60 min,TBST洗膜3次,每次10 min,用LI-COR掃膜儀掃膜,紅外激光成像系統(tǒng)對(duì)待測(cè)蛋白進(jìn)行分析。

1.2.3 Hoechst33342染色檢測(cè)細(xì)胞的凋亡

將對(duì)數(shù)期的腫瘤細(xì)胞按5 000個(gè)/孔植入96孔培養(yǎng)板,每孔加入培養(yǎng)液的體積為100 μL,在37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后,用不同濃度的藥物處理HCT116細(xì)胞,36 h后,用PBS洗細(xì)胞兩次,加入濃度為1 mg/mL的Hoechst33342體積為1 μL,使Hoechst33342的終濃度在0.5～10 μg/mL之間,繼續(xù)在37℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育15 min,然后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的變化并拍照。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡

接種5×105個(gè)腫瘤細(xì)胞鋪于6孔板,每孔加入培養(yǎng)液的體積為1.6 mL,待細(xì)胞貼壁后,按照要求分別加入5 MOI的病毒、終濃度為80 ng/mL的SNS-032及加入5 MOI的病毒聯(lián)合80 ng/mL的SNS-032各400 μL,以不加病毒的細(xì)胞作為對(duì)照,在37℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,用PBS洗細(xì)胞兩次,收集細(xì)胞,參照AnnexinV/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明,于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Excel 2003分析數(shù)據(jù),用GraphPad5.0作圖,結(jié)果采用t檢驗(yàn),NS表示差異不顯著,P<0.05表示差異顯著,用“*”表示,P<0.01表示差異極顯著,用“**”表示。

2 結(jié) 果

2.1 單獨(dú)使用SNS-032對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的存活率的 影響

通過(guò)MTT法檢測(cè)不同劑量的SNS-032對(duì)不同結(jié)腸癌細(xì)胞在不同時(shí)間的殺傷作用,結(jié)果如圖1所示。圖1顯示SNS-032對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用具有劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。較低劑量的SNS-032就可以達(dá)到很好的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用;同時(shí),可以看出不同的結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感度不同。如圖1所示,在24 h時(shí),藥物劑量為160 ng/mL SNS-032對(duì)HCT116細(xì)胞和SW620細(xì)胞作用效果稍差于80 ng/mL的藥物劑量,說(shuō)明在短期內(nèi),細(xì)胞對(duì)較高的藥物劑量具有一定的耐藥性,因此,筆者進(jìn)一步做了將病毒與不同的藥物劑量聯(lián)合處理不同的結(jié)腸癌細(xì)胞。

2.2 不同劑量的SNS-032與5 MOI的ZD55-MnSOD 病毒聯(lián)合作用于三種不同的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、 HT-29、SW620的抗癌效果

以不同劑量的SNS-032與5MOI的溶瘤腺病毒聯(lián)合分別感染HCT116、HT-29、SW620細(xì)胞,在72 h后,檢測(cè)其對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的存活率的影響,結(jié)果如圖2所示。圖2可見(jiàn)，SNS-032與ZD55-MnSOD聯(lián)合作用時(shí),對(duì)三種結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用,并且隨著SNS-032藥物濃度增加,對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的抗癌效果越好,在劑量為160 ng/mL的SNS-032與ZD55-MnSOD聯(lián)合作用于HT-29時(shí),HT-29細(xì)胞存活率大約只有10%左右。

2.3 用5MOI的溶瘤腺病毒與80 ng/mL的SNS- 032藥物聯(lián)合,在不同時(shí)間對(duì)HT-29和SW620 細(xì)胞的抗癌作用

用5MOI的溶瘤腺病毒與80 ng/mL的SNS-032藥物處理HT-29細(xì)胞和SW620細(xì)胞24、48、72 h和96 h后,MTT檢測(cè)不同時(shí)間聯(lián)合處理對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果如圖3。SNS-032與ZD55-MnSOD聯(lián)合作用HT-29細(xì)胞96 h時(shí),對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)使用病毒或藥物。SNS-032

與ZD55-MnSOD聯(lián)合作用于SW620細(xì)胞96 h時(shí),聯(lián)合作用的效果明顯高于單獨(dú)使用藥物或病毒,并且對(duì)HT-29和SW620細(xì)胞均呈現(xiàn)出隨著時(shí)間的增加,作用效果越明顯,說(shuō)明病毒與藥物聯(lián)合具有明顯的時(shí)間依賴(lài)性。

2.4 Western blot檢測(cè)溶瘤腺病毒ZD55-MnSOD 目的基因的表達(dá)

ZD55-MnSOD,SNS-032,ZD55-MnSOD與SNS-032聯(lián)合處理HCT116細(xì)胞,劑量分別為5 MOI、80 ng/mL以及5 MOI+80 ng/mL,設(shè)立加等量的PBS作為對(duì)照組,在37℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,Western blot檢測(cè)目的基因MnSOD的表達(dá)，結(jié)果如圖4。圖4顯示，GAPDH為內(nèi)參蛋白,單獨(dú)使用ZD55-MnSOD處理HCT116細(xì)胞表達(dá)的MnSOD比對(duì)照組和單獨(dú)使用SNS-032的量都明顯提高,并且ZD55-MnSOD與SNS-032聯(lián)合處理的表達(dá)量比任何一種也都明顯提高,說(shuō)明ZD55-MnSOD與SNS-032聯(lián)合可以增加MnSOD的表達(dá)量。

2.5 Hoechst33342染色觀察細(xì)胞凋亡

通過(guò)染色,檢測(cè)病毒及藥物處理后細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化及凋亡情況。如圖5所示:PBS處理的對(duì)照孔細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生形態(tài)學(xué)的變化,細(xì)胞密度大,并且均勻鋪散開(kāi),基本沒(méi)有細(xì)胞凋亡;然而病毒與藥物處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯的抑制并且出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡狀態(tài),發(fā)生凋亡的的細(xì)胞其細(xì)胞核染色質(zhì)會(huì)發(fā)生明顯凝集、固縮、并伴有凋亡小體出現(xiàn)。并且,隨著藥物劑量的升高,凋亡增多。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

ZD55-MnSOD與不同劑量的SNS-032(0、20、40、80、160 ng/mL)聯(lián)合處理HCT116細(xì)胞,設(shè)立加等量PBS的對(duì)照組,在37℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,用不含EDTA的胰酶收集細(xì)胞,AnnexinV/PI雙染參見(jiàn)流式試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡(圖6)。圖6(a)顯示,病毒與不同濃度的藥物聯(lián)合,所用藥物濃度越高,早期和晚期凋亡都有增加,隨著藥物劑量的提高,早期和晚期凋亡現(xiàn)象越明顯。在藥物劑量為160 ng/mL時(shí),早晚期凋亡共達(dá)到12%左右。圖6(b)為統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)照組與加藥組出現(xiàn)明顯差異。

3 討 論

隨著科技的不斷發(fā)展,治療癌癥的藥物大批涌現(xiàn),但藥物的副作用及其抗癌效果都還很難預(yù)測(cè),找到一種科學(xué)合理的治療方法勢(shì)在必行。本實(shí)驗(yàn)采用ZD55-MnSOD與不同劑量的SNS-032聯(lián)合作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞株,實(shí)驗(yàn)證明二者的聯(lián)合作用比單獨(dú)使用病毒或單獨(dú)使用藥物效果均要顯著,可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。MTT結(jié)果表明,單獨(dú)使用藥物處理人結(jié)腸癌細(xì)胞時(shí),在一定范圍內(nèi)隨著藥物劑量的增加,藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用,但較高的藥物劑量時(shí),會(huì)降低對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制能力。然而,用病毒與藥物聯(lián)合處理人結(jié)腸癌細(xì)胞,隨著藥物劑量的增加,對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力越強(qiáng),并且,二者的聯(lián)合具有時(shí)間依賴(lài)性。Hoechst33342染色觀察發(fā)現(xiàn),單獨(dú)SNS-032或ZD55-MnSOD處理的細(xì)胞只有很少凋亡現(xiàn)象出現(xiàn)。而藥物聯(lián)合組有明顯的凋亡小體出現(xiàn),并且有大量細(xì)胞發(fā)生凋亡。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡,驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)與MTT結(jié)果符合,發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合作用時(shí),能有效地促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡,并且凋亡多發(fā)生于凋亡早期階段。在本實(shí)驗(yàn)中,為了降低過(guò)高的病毒劑量可能會(huì)增加治療的風(fēng)險(xiǎn),采用較低的病毒劑量與藥物聯(lián)合,這樣既能降低各自的劑量,又能達(dá)到很高的抗腫瘤效果。然而,ZD55-MnSOD聯(lián)合SNS-032時(shí),最佳協(xié)同作用的劑量以及具體的引起它們聯(lián)合作用的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。并且筆者所用的SNS-032并不是具有廣譜性的抗癌藥物,因?yàn)橛醒芯勘砻魉鼘?duì)某些細(xì)胞具有一定的耐藥性,由于具有耐藥性,有可能需加大藥物的使用劑量,因此,SNS-032對(duì)其他腫瘤細(xì)胞的治療效果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)為以后的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)打下理論基礎(chǔ),對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)也具有一定的參考價(jià)值。

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(責(zé)任編輯： 許惠兒)

In-Vitro Inhibitory Effect of Oncolytic Adenovirus ZD55-MnSODCombined with New CDK Inhibitor on Human Colon Cancer Cells

HAN Jian-cuia, MA Bu-yuna, WU Cheng-yua, WANG Yi-ganga, WANG Shi-binga,b

(a. Xinyuan Institute of Medicine and Biotechnology, b. Research Centre, School of Life Science,Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

The research is to develop in-vitro inhibitory effect of MnSOD carried oncolytic adenovirus Ad-E1B55Kd-MnSOD (ZD55-MnSOD) combiend with small molecular drug novel CDK inhibitor SNS-032 on colon cancer cell lines such as SW620, HCT116 and HT-29. Oncolytic virus and drugs were combined to seek good antitumor effects. In this experiment, MTT was used to detect the application effect of 5MOI ZD55-MnSOD combined with different dosage of SNS-032 (0, 20, 40, 80, 160 ng/mL) on human colon cell line. The authors found that the combination of oncolytic virus and drug could promot tumor cell apoptosis; and also found that treatment of SW620 and HT-29 with combined ZD55-MnSOD (5 MOI) and SNS-032 (80 ng/mL) had great time dependence. Hoechst33342 staining method and flow cytometry were used to detect apoptosis. The results aslo show that the apoptosis phenomenon in the group of combined use of ZD55-MnSOD with SNS-032 has better effects than separate use of oncolytic virus or drug alone. This research preliminarily proves ZD55-MnSOD (5 MOI) and SNS-032 have supplementary effect and can effectively inhibit the growth of colon cancer cells in vitro.

oncolytic adenovirus; SNS-032; colon cancer; antitumor effect

1673- 3851 (2015) 05- 0688- 06

2014-09-26

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81272687);浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY13H080005,LZ13H160004);浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014C37101);浙江理工大學(xué)科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(1204807-Y)

韓劍翠(1988-),女,黑龍江林口人,碩士研究生,主要從事腫瘤的靶向基因-病毒治療方面的研究。

王世兵,E-mail:wsb@zstu.edu.cn

Q789

A