張 寶，魏曙光，范乾瑞，李文浩，李生斌

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生部法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710061）

多巴胺（Dopamine，DA）是兒茶酚胺及苯乙胺家族的一類化學(xué)物質(zhì)，對于人及動(dòng)物的機(jī)體尤其是大腦具有重要的作用。大腦中，由神經(jīng)細(xì)胞分泌的多巴胺作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，具有調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知、情感、獎(jiǎng)賞、神經(jīng)血管等多種機(jī)能［1］。多巴胺受體分布于脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，是一類G 蛋白偶聯(lián)受體。其中，D1 受體由DRD1基因編碼，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)最多的多巴胺受體，調(diào)控神經(jīng)元的生長，介導(dǎo)一些行為應(yīng)激，同時(shí)調(diào)控多巴胺D2 受體介導(dǎo)的生理活動(dòng)。近年來，多巴胺D1 受體功能的研究成為熱門，對于該基因敲除小鼠的應(yīng)用研究也日益增長。本試驗(yàn)通過對敲除雜合子小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖，以獲得DRD1 基因敲除純合小鼠，為研究多巴胺D1受體功能建立模型，為動(dòng)物繁育研究提供思路。本文對DRD1基因敲除小鼠的飼養(yǎng)、繁殖及鑒定方法進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

DRD1基因敲除小鼠由美國芝加哥大學(xué)（University of Chicago）徐明教授饋贈(zèng)引進(jìn)，飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 小鼠的飼養(yǎng)和繁殖

小鼠均飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的層流動(dòng)物房內(nèi)，室內(nèi)溫度為18～22 ℃，相對濕度50%～60%，光照明暗交替12h／d。進(jìn)出動(dòng)物房須穿無菌隔離衣、戴口罩、帽子、手套，每天進(jìn)入層流動(dòng)物房1次，觀察小鼠生長發(fā)育情況。鼠盒、墊料均經(jīng)過高壓消毒（131 ℃、5 min），飼料是由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供的Co60照射滅菌的飼料，飲水經(jīng)制水機(jī)處理為純凈無菌水。飼料、水自由采食，給與充足，墊料每2～3d更換一次。依照無特定病原體動(dòng)物（specific pathogen free，SPF）級動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。仔鼠的性成熟期為60d左右，母鼠妊娠期為21d左右。

1.3 小鼠的基因型鑒定

引進(jìn)小鼠均為DRD1基因敲除雜合子，最初繁殖采用1雄1雌配對的方式進(jìn)行飼養(yǎng)，依據(jù)孟德爾遺傳定律，其子代將出現(xiàn)野生型（DRD1＋／＋）、敲除雜合子（DRD1＋／－）以及敲除純合子（DRD1－／－）3種基因型，故需要對子代進(jìn)行鑒定。本課題組采用PCR 的方法進(jìn)行基因型鑒定。

1.3.1 基因組DNA 提取 剪小鼠腳趾標(biāo)記，小鼠10～13d時(shí)，采取尾尖0.3cm 左右大小組織，利用Chelex－100結(jié)合蛋白酶K 消化組織，提取基因組DNA，雙蒸水或TE 溶解。測OD 值，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR 反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳 引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)［2］，由上海生工合成：D1F 引物1：5＇－TAAGCCACCGGAAGTGCTTTC－3＇；D1R 引物2：5＇－AGTTGGTCACCTTGGACC－3＇；D1R－NEO 引物3：5＇－AGCCCAGAAAGCGAAGGAG－3＇（上游與D1F共用）。為節(jié)省時(shí)間和成本，減少單次間的試驗(yàn)誤差，簡便、快捷、準(zhǔn)確地獲得試驗(yàn)結(jié)果，采用混合引物擴(kuò)增法。將3條引物按照2∶1∶1混合至10 μmol／L。擴(kuò)增目的DNA 片斷分別為209bp和446 bp。PCR 反應(yīng)體系（下列組分構(gòu)成20μL 的反應(yīng)體系）：10μL 2×Taq PCR Mix，4μL 混合引物，2μL模板DNA，滅菌ddH2O4μL 補(bǔ)足至20μL。擴(kuò)增程序：預(yù)變性，95 ℃5min；95 ℃變性30s；55 ℃復(fù)性30s，72 ℃延伸35s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃，延伸10min；4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取PCR 反應(yīng)終產(chǎn)物5μL 2%瓊脂糖凝膠電泳120V 電泳40 min，凝膠成像系統(tǒng)中分析帶型。電泳片段為：野生型209bp一條帶（由D1F與D1R 擴(kuò)增而成）；敲除純合子446bp 一條帶（由D1F 與D1R－NEO 擴(kuò)增而成）；敲除雜合子446bp和209bp兩條帶，按此條帶類型可以分析出各基因型小鼠。

1.4 DRD1敲除小鼠分娩數(shù)、總產(chǎn)數(shù)、平均每胎產(chǎn)數(shù)和成活數(shù)分析

試驗(yàn)設(shè)計(jì)四種繁殖方式：a.純合子雄鼠和雜合子雌鼠交配；b.純合子雌鼠和雜合子雄鼠交配；c.純合子雄鼠和純合子雌鼠交配；d.雜合子雄鼠和雜合子雌鼠交配。對三個(gè)月內(nèi)四種不同交配方式生產(chǎn)仔鼠的分娩數(shù)、總產(chǎn)數(shù)、平均每胎產(chǎn)數(shù)和成活數(shù)的差別進(jìn)行觀察比較。

圖1 DRD1基因敲除小鼠基因型鑒定1，3，5.敲除純合子（KO）；4.敲除雜合子；2，6，7.野生型（WT）Fig.1 The identification of DRD1knockout mice genotypeLane 1，3，5are DRD1knockout mice（KO）；lane 4is heterozygotic mouse；lane 2，6，7are wild mice（WT）

2 結(jié)果

2.1 小鼠的繁殖情況

經(jīng)過多代繁殖，雌雄小鼠均為DRD1敲除純合子（DRD1－／－）配對成功，繁殖出子代幼鼠。母鼠妊娠期為19～21d，每胎平均約產(chǎn)4～6只仔鼠。

2.2 小鼠基因型鑒定結(jié)果

基因型鑒定結(jié)果見圖1。由圖1知，其中1、3、5號泳道出現(xiàn)446bp一條帶，為敲除純合子；4 號泳道出現(xiàn)446bp和209bp兩條帶型，為敲除雜合子；2、6、7號泳道出現(xiàn)209bp一條帶，為野生型。

2.3 不同繁殖模式下DRD1 小鼠的分娩數(shù)、總產(chǎn)仔數(shù)、平均每胎產(chǎn)仔數(shù)和成活數(shù)比較

如圖2所示，對相等數(shù)量小鼠四種不同的交配方式進(jìn)行觀察后發(fā)現(xiàn)，d 方法在仔鼠分娩數(shù)、總產(chǎn)數(shù)、平均每胎產(chǎn)數(shù)和成活數(shù)上處于最高水平；c方法在仔鼠分娩數(shù)、總產(chǎn)數(shù)、平均每胎產(chǎn)數(shù)和成活數(shù)上處于最低水平。其它兩種方法a，b的各項(xiàng)數(shù)值介于二者之間。說明雜合子的繁殖能力平均高于DRD1－／－小鼠。進(jìn)一步進(jìn)行方差分析并進(jìn)行Bonferroni post－h(huán)oc檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，b和c兩種方法與d方法相比，在總產(chǎn)數(shù)和成活數(shù)兩方面均較差，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＊p＜0.05，＊＊p＜0.01）；而a和b兩種方法相比，平均的仔鼠成活數(shù)、分娩數(shù)、平均產(chǎn)數(shù)、總產(chǎn)數(shù)上a較b高，但是統(tǒng)計(jì)結(jié)果并無顯著性區(qū)別。此外，DRD1－／－小鼠做父源或做母源對于大量繁殖DRD1－／－小鼠來講沒有明顯差異。上述結(jié)果說明d 方法是利用雜合子交配的方式得到DRD1－／－小鼠，產(chǎn)仔數(shù)最多，最為有效的方式，但需要每代進(jìn)行鑒定；而a，b 和c方法作為大量繁育DRD1－／－小鼠可選用的配種方式產(chǎn)仔數(shù)較少；c方法作為配種方式雖然產(chǎn)仔數(shù)少，但不需每代進(jìn)行鑒定，相對經(jīng)濟(jì)簡便。

圖2 不同交配方式對DRD1－／－小鼠繁殖的影響Fig.2 Different mating mode effect on reproduction of DRD1－／－ mice

3 討論

多巴胺是大腦中主要的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，由中腦質(zhì)神經(jīng)元和腹側(cè)被蓋區(qū)合成，它通過中腦邊緣多巴胺通路調(diào)控情緒和動(dòng)機(jī)行為，同時(shí)它通過與受體相結(jié)合發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)，包括調(diào)控運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知、攝食、內(nèi)分泌等多種功能［3－7］。多巴胺受體是由7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)組成的G－蛋白藕聯(lián)受體，它們激活誘導(dǎo)第二信使的形成，激活或抑制特定的信號通路。目前共發(fā)現(xiàn)有5種多巴胺受體亞型。其中，人多巴胺D1受體（DRD1）基因定位于5q35，全長約4kb，由兩個(gè)外顯子一個(gè)內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄446個(gè)氨基酸組成蛋白質(zhì)，在腦內(nèi)廣泛表達(dá)，主要存在于伏隔核（Acb），視束（OT），腦皮層（Cx），杏仁核和尾殼核（Cpu）［8］。

多巴胺受體中，D1受體分布最為廣泛，對其研究也是治療神經(jīng)性疾病的熱點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn)，D1受體激動(dòng)劑對于帕金森病程的減緩有一定的作用［9］。嚙齒類和非人靈長類動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DRD1適當(dāng)激活是形成前額皮質(zhì)相關(guān)認(rèn)知功能的重要前提，其異常表達(dá)均會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙［10－11］。Xu等研究報(bào)道，DRD1突變鼠運(yùn)動(dòng)能力未受影響，揭示多巴胺多個(gè)受體間具有復(fù)雜的相互調(diào)節(jié)作用［2］。對DRD1突變鼠進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練，發(fā)現(xiàn)DRD1突變鼠具有空間學(xué)習(xí)障礙，但不存在視覺或運(yùn)動(dòng)障礙［12］。

對于眼科領(lǐng)域的研究，在細(xì)胞水平和動(dòng)物試驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)DRD1 激活后可保護(hù)損傷的視神經(jīng)元。揭示DRD1可促進(jìn)視網(wǎng)膜的發(fā)育，可能成為治療青光眼等眼科疾病的一個(gè)分子靶點(diǎn)［9］。通過細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DRD1影響腦膜細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等多種類型細(xì)胞的增殖［13－14］。同時(shí)，文獻(xiàn)報(bào)道DRD1基因與精神分裂癥具有相關(guān)性，由于樣本量或種族差異等原因，結(jié)果還不盡一致，需要大樣本的后續(xù)研究［15－16］。

為了研究多巴胺D1受體相關(guān)疾病的需要，本實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)DRD1雜合子小鼠，嚴(yán)格按照SPF級要求，飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 層流動(dòng)物房中。依據(jù)孟德爾遺傳定律，敲除雜合子小鼠交配子代出現(xiàn)3種基因型，即野生型（DRD1＋／＋）、敲除雜合子（DRD1＋／－）及敲除純合子（DRD1－／－）3種類型，需要進(jìn)行鑒定。將鑒定出的野生型同野生型，純合子同純合子進(jìn)行交配，子一代即可獲得大量野生型（DRD1＋／＋）和純合子（DRD1－／－）小鼠，用于試驗(yàn)研究。本研究采用PCR 方法對出生10d左右的小鼠進(jìn)行基因型鑒定，說明其可作為基因敲除小鼠基因型鑒定的一種可靠快速的方法。通過對DRD1基因敲除小鼠不同繁殖模式下小鼠的分娩數(shù)、總產(chǎn)數(shù)、平均每胎產(chǎn)數(shù)和成活數(shù)比較，發(fā)現(xiàn)雜合子的繁育能力最強(qiáng)，純合子之間進(jìn)行交配繁育能力最低。此外，雜合子與DRD1－／－小鼠進(jìn)行交配時(shí)，DRD1－／－小鼠做父方或做母方在繁殖能力上沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

目前關(guān)于動(dòng)物繁殖的研究大多是集中在下丘腦－垂體－性腺軸（HPG 軸）分泌的激素及其受體基因上［6，17－18］。多巴胺通過與受體結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)功能，主要通過調(diào)節(jié)促性腺激素釋放激素、卵泡刺激素、黃體生成素和催乳素等激素的分泌而調(diào)控動(dòng)物生殖［19－22］。本研究中飼養(yǎng)的DRD1 敲除小鼠表現(xiàn)繁殖能力下降，DRD1基因如何影響繁殖相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控，如何影響激素水平的具體分子生物學(xué)機(jī)理還需要深入的研究。

本研究對DRD1基因敲除鼠的成功鑒定，為建立基因敲除鼠模型及探討疾病的發(fā)生機(jī)制和基因治療提供理論依據(jù)。分析不同配種類型下小鼠的繁殖數(shù)據(jù)，DRD1敲除雜合子小鼠較敲除純合子小鼠繁育能力強(qiáng)，提示DRD1 基因可能影響動(dòng)物繁育能力，本研究結(jié)果為動(dòng)物繁育研究提供新的研究思路。

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