何 偉，付相敏，王金華，包可翔

（1福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，福建 廈門361022；2湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部，湖北 武漢430068）

不同等級煙葉中纖維素和果膠等化學(xué)成分的含量有所差異［1］，其中果膠在各等級煙葉中所占比例約為6%～20%［2］。煙草制品中所含的果膠質(zhì)，不僅影響煙葉的燃燒性，而且在燃吸過程中容易產(chǎn)生甲醇、甲醛、甲酸和焦油等有害物質(zhì)［3］。另外，煙葉中所含果膠在自然醇化發(fā)酵［4］過程中會產(chǎn)生乙酸，使得煙葉燃吸時(shí)有辛辣味和刺激味，產(chǎn)生一種嗆咳感［5］。研究表明，煙葉中果膠含量越高，味覺、嗅覺和評吸總分越差［6］，且煙葉燃吸產(chǎn)生的甲醛及乙酸會產(chǎn)生嗆咳、辛辣等刺激性氣味，不利于吸食［7］。

煙葉表面存在大量微生物，這些微生物的活動在煙葉醇化發(fā)酵過程中起到了重要作用［8］，其實(shí)質(zhì)是微生物發(fā)酵產(chǎn)酶降解煙葉中的有害成分。鄧國賓等［9］從煙葉中篩選出一株果膠酶高產(chǎn)菌株黑曲霉DPE-005，其產(chǎn)生的果膠酶可使煙葉中果膠質(zhì)降解高達(dá)18.50%；楊慧芳［10］從煙梗中篩選到一株青霉菌JXY-17，將其發(fā)酵粗酶液噴灑于煙梗，煙梗中所含果膠質(zhì)降低了17.53%。果膠酶有降解煙葉中果膠的作用，從而降低了燃吸時(shí)產(chǎn)生甲醇等有害成分的含量［11］，進(jìn)而提高了吸味品質(zhì)。于建軍等［12］利用果膠酶處理煙葉，使煙葉在燃吸時(shí)降低了有害成分的含量，改善了吸味口感。目前，多采用商品酶制劑降解煙葉中的果膠，但其價(jià)格較高，在實(shí)際應(yīng)用中難以控制成本［13］。果膠酶是一種誘導(dǎo)酶，煙葉中的果膠為菌株生產(chǎn)果膠酶提供了誘導(dǎo)環(huán)境，有利于產(chǎn)酶。如錢衛(wèi)等［14］在培養(yǎng)基中添加果膠，果膠酶的產(chǎn)量有明顯提高；尤華等［15］發(fā)現(xiàn)在果膠誘導(dǎo)物存在的條件下，才能產(chǎn)生果膠酶。

本實(shí)驗(yàn)室從煙葉表面篩選到一株果膠酶高產(chǎn)菌，經(jīng)16SrRNA序列鑒定為克雷白氏桿菌（Klebsiella sp.）。為了進(jìn)一步提高該菌株果膠酶產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，本研究選擇煙葉為碳源，無機(jī)氮化物為氮源，并對培養(yǎng)基的碳源、氮源及初始pH進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化，為果膠酶的發(fā)酵提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 片煙，由福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供。

1.1.2 菌種 克雷白氏桿菌（Klebsiella sp.），由湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部實(shí)驗(yàn)室分離及保藏。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）:蛋白胨1.0%，酵母粉0.5%，NaCl 0.5%，葡萄糖2.0%。發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)）:果膠1.0%，酵母粉0.5%，硫酸銨 0.2%，K2HPO40.2%，NaCl 0.03%，Mg－SO4·7H2O 0.05%，瓊脂2.0%，pH 7.0。

1.1.4 試劑及儀器 果膠，美國Sigma-Aldrich公司；D-半乳糖醛酸，97%，美國Sigma-Aldrich公司；DNS試 劑；0.05MpH10的 Na2PO4－NaOH 緩 沖液；可見分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海智成分析儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 分別以果膠、橘皮粉、葡萄糖和煙末作為碳源進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，考察不同碳源種類對果膠酶活的影響；將碳源濃度分別設(shè)為0、1%、2%、3%、4%、5%進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，考察不同碳源濃度對果膠酶活力的影響；分別以硫酸銨、氯化銨、蛋白胨、胰蛋白胨作為氮源進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，并提取粗酶液，測定其果膠酶活；將氮源濃度分別設(shè)為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，考察不同氮源濃度對果膠酶活力的影響；將菌株接種到初始pH 為4、5、6、7、8、9、10的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，考察不同初始pH發(fā)酵對果膠酶活力的影響。

1.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以發(fā)酵液粗酶液酶活力為響應(yīng)值，以單因素實(shí)驗(yàn)得到的顯著因子起始pH（A）、煙末、硫酸銨為自變量。根據(jù) Central Composite實(shí)驗(yàn)確定中心點(diǎn)，各因子實(shí)際值及自變量水平見表1。利用Design-Expert8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及分析。

1.2.3 粗酶液的制備 將篩選得到的產(chǎn)果膠酶菌株Tg1在LB固體培養(yǎng)基上活化2～3代，挑取單菌落接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、220r/min搖床培養(yǎng)72h。發(fā)酵液于8 000r/min 4℃下離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.2.4 果膠酶活力測定 采用DNS顯色法測定果膠酶活性。在刻度為20mL試管中加入1.0mL 0.1%果膠溶液 （0.05MpH10Na2HPO4緩沖液配制），60℃水浴預(yù)熱5min，加入1.0mL粗酶液，50℃水浴反應(yīng)60min后，加入2mL DNS溶液，沸水浴10min，取出后浸入自來水中冷卻至室溫，定容至10mL。以滅活酶液為對照，在540nm下測定吸光度，根據(jù)半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖含量。

在上述反應(yīng)條件下，每小時(shí)水解果膠底物產(chǎn)生1μmol半乳糖醛酸的酶量為1個(gè)酶活性單位，以U/mL表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對酶活力的影響

實(shí)驗(yàn)分別以葡萄糖、煙末、果膠和橘皮粉為碳源，考察不同碳源對酶活力的影響，如圖1所示，果膠酶活力由高到低依次為煙末、果膠、橘皮粉和葡萄糖，對應(yīng)果膠酶活力分別為10.20、9.56、9.19、7.53 U/mL。由于菌種來源于煙末，煙末中所含果膠可以誘導(dǎo)果膠酶的合成，因此所產(chǎn)酶活力最高；葡萄糖作為碳源可以促進(jìn)菌體生長，但無法誘導(dǎo)果膠酶的合成；以果膠為碳源有利于誘導(dǎo)果膠酶的合成，但營養(yǎng)單一，不利于菌體生長。橘皮粉含有一定量的果膠，但由于該菌株來源于煙末，不能較好地利用橘皮粉所含營養(yǎng)成分。

圖1 不同碳源對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.2 碳源濃度對酶活力的影響

分別以碳源濃度0、1%、2%、3%、4%、5%、6%進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察碳源濃度對酶活力的影響。如圖2所示，果膠酶活力隨煙末濃度的增大呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)煙末濃度為3%時(shí)果膠酶活力最高，為10.20U/mL。煙末濃度繼續(xù)增加，酶活反而呈下降趨勢，說明過高的煙末濃度對產(chǎn)果膠酶不利。

圖2 碳源濃度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.3 不同氮源對酶活力的影響

以3%煙末作為碳源，氯化銨、硫酸銨、蛋白胨和胰蛋白胨為氮源，考察不同氮源對酶活力的影響。如圖3所示，果膠酶活力由高到低依次為硫酸銨、胰蛋白胨、蛋白胨和氯化銨，對應(yīng)果膠酶活力分別為9.92、8.80、6.32、6.36U/mL，可知硫酸銨和胰蛋白胨作為氮源時(shí)效果較好，胰蛋白胨中含有多種有機(jī)成分供菌體生長及產(chǎn)酶，而硫酸銨相對廉價(jià)，且果膠酶活最高，因此選用硫酸銨作為氮源進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 不同氮源對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.4 氮源濃度對酶活力的影響

分別以氮源濃度0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察氮源濃度對酶活力的影響。如圖4所示，果膠酶活力隨煙末濃度的增大呈先上升后下降的趨勢。硫酸銨濃度過低或過高，則碳氮比過高或過低。不能為菌體生長和產(chǎn)酶提供合適的碳氮比；當(dāng)濃度為0.3%時(shí)，果膠酶活力最高，為14.88U/mL，因此選取該濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 氮源濃度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.5 不同起始pH對酶活的影響

分別以濃度3%煙末、濃度0.3%硫酸銨為碳源和氮源，起始pH 分別為5、6、7、8、9的條件下，考察不同起始pH對果膠酶活力的影響。如圖5所示，起始pH＜7時(shí)，果膠酶活力隨pH增加而變大；起始pH＞7時(shí)，果膠酶活力隨pH增加而變??；當(dāng)起始pH為7時(shí)，果膠酶活力最高為8.71U/mL。發(fā)酵液起始pH偏酸（＜7）或偏堿（＞7）對酶活均不利。pH值影響培養(yǎng)基中一些成分的解離度，同時(shí)對酶的穩(wěn)定性有影響。實(shí)驗(yàn)表明該菌株適合在中性pH環(huán)境下產(chǎn)果膠酶。

圖5 不同起始pH對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.6 對影響產(chǎn)酶的因素運(yùn)用RSM法進(jìn)行優(yōu)化

用Design-Expert8.0軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表1。對Central Composite試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行方差分析（表2），利用 Design-Expert 8.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行三元二次回歸方程得到果膠酶活力Y對編碼自變量起始pH（A）、煙末（B）、硫酸銨（C）的二次多項(xiàng)回歸方程為:酶活力（Y）＝－18.54756＋6.13519×A＋3.73272×B＋16.90083×C－0.029722×A×B＋0.058333×A×C－1.53056×B×C－0.41439×A2－0.40578×B2－15.88333×C2。由表2中回歸模型方差分析（ANOVA）可以看出，F(xiàn)M＝26.40，P＝0.0001，表明該模型顯著；F失擬＝1.72，失擬項(xiàng)P＝0.3007＞0.05，表明失擬不顯著；A，B，C，BC，A2，B2，C2項(xiàng)中P ＜0.05，表明影響顯著；回歸模型 的 調(diào) 整 確 定 系 數(shù) （AdjR-squared）Adj R2＝0.954 6，即該模型能解釋95.46%響應(yīng)值的變化，表明該回歸模型擬合程度較好，誤差小，可用此模型優(yōu)化果膠酶發(fā)酵條件。

表2列出了3個(gè)因素在Central Composite試驗(yàn)設(shè)計(jì)下影響果膠酶活力的回歸方程系數(shù)及其顯著性分析［16］。結(jié)果表明，起始pH、煙末、硫酸銨的一次項(xiàng)及其二次項(xiàng)以及煙末和硫酸銨的交互作用對酶活力有顯著影響（P＜0.05）。其他兩兩交互效應(yīng)不顯著。

由圖6可知，當(dāng)起始pH值固定時(shí)，硫酸銨取某一定值，煙末用量從0到6%范圍內(nèi)增大時(shí)曲線較陡，在煙末濃度約為3%果膠酶活達(dá)到最大值后開始下降。且硫酸銨與煙末之間交互影響顯著。對上述回歸模型方程進(jìn)行典型性分析表明，該模型具有穩(wěn)定點(diǎn)，即果膠酶活力最大值。

模型給出的最有組合為pH7.20，煙末3.30%，硫酸銨0.35%，在此最優(yōu)條件下模型預(yù)測酶活為15.12U/mL。為了驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，設(shè)計(jì)三組試驗(yàn)在最優(yōu)條件下?lián)u瓶發(fā)酵產(chǎn)酶，結(jié)果平均值15.07 U/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明回歸模型可信度較高，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值基本符合，能夠較好地預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果。調(diào)整系數(shù)R2＝0.9546

表1 Central Composite試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 回歸方程系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)

圖6 煙末與硫酸銨的交互作用

3 結(jié)論

從煙葉表面篩選得到一株果膠酶高產(chǎn)菌株克雷白氏桿菌，最初測得其所產(chǎn)果膠酶活力為10.12U/mL。通過單因素實(shí)驗(yàn)確定最佳發(fā)酵產(chǎn)酶條件為pH7、碳源為3.00%煙末、氮源為0.30%硫酸銨；在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面分析對發(fā)酵條件進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)果表明:起始pH7.2，煙末3.30%，硫酸銨0.35%為最佳發(fā)酵條件。經(jīng)搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，在該條件下，果膠酶活力為15.07U/mL。與優(yōu)化前相比，酶活提高約49%。

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