陳旭艷 諸葛小菊 陳仁聘 黃智銘

胃癌細(xì)胞株MGC803中LTF基因的表達(dá)及其啟動(dòng)子甲基化相關(guān)性研究

陳旭艷 諸葛小菊 陳仁聘 黃智銘

目的鉬檢測(cè)胃癌細(xì)胞株MGC803內(nèi)乳鐵蛋白（LTF）基因的甲基化和表達(dá)情況，探討LTF的DNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化異常與其在胃癌內(nèi)表達(dá)的相關(guān)性。方法鉬用亞硫酸氫鹽測(cè)序PCR方法檢測(cè)MGC803啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，使用real-time PCR和Western b lot分別檢測(cè)LTF在MGC803內(nèi)的mRNA和蛋白表達(dá)水平。同時(shí)使用去甲基化劑5-aza-CdR處理胃癌細(xì)胞株，觀察給藥前后的DNA甲基化狀態(tài)和mRNA表達(dá)情況。結(jié)果 MGC803啟動(dòng)子甲基化率達(dá)59.8%，使用5-aza-CdR處理的兩組（2μmol/L組和10μmol/L組）和空白對(duì)照組甲基化率差異、LTF的mRNA表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），并且隨著MGC803啟動(dòng)子甲基化程度的下降，其mRNA和蛋白表達(dá)增加；而不同濃度藥物處理組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。結(jié)論 LTF基因在胃癌細(xì)胞株MGC803內(nèi)表現(xiàn)為較高甲基化狀態(tài)，而且LTF的表達(dá)和其啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況相關(guān)，使用去甲基化劑能逆轉(zhuǎn)DNA的甲基化情況從而使其m RNA重新表達(dá)。

LTF基因 胃腫瘤 5-雜氮脫氧胞苷 DNA甲基化 CpG島

胃癌發(fā)病過(guò)程受到多基因、多因素的影響。抑癌基因的表觀遺傳學(xué)改變是在胃癌癌變演變過(guò)程早期非常關(guān)鍵的因素之一。表觀遺傳學(xué)變化主要包含DNA異常甲基化，雜合性丟失（loss of Heterozygosity，LOH）以及組蛋白修飾等三大方面[1]。Lund等[2]證實(shí)DNA甲基化是腫瘤抑制基因（tumor suppressor gene，TSG）失活機(jī)制中除基因缺失和基因突變這兩大重要因素外的第三重要機(jī)制，有時(shí)候甚至越過(guò)前兩者成為T(mén)SG沉默的唯一機(jī)制。

分子遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤內(nèi)中染色體3p21區(qū)存在高頻基因缺失[3]，有學(xué)者通過(guò)基因組雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)胃癌里3p21-23的缺失率為22%[4]。乳鐵蛋白（lactotransferrin，LTF）基因，作為轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的一員，亦位于人類(lèi)染色體3p21.3區(qū)域，其在鼻咽癌、肺癌、前列腺癌等多種腫瘤及相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞株呈現(xiàn)表達(dá)降低或缺失的狀態(tài)，有研究顯示這與該基因啟動(dòng)子區(qū)域的異常甲基化高度相關(guān)[5-8]。5-Aza-2′-deoxycytidine（5-aza-CdR），能結(jié)合DNA甲基轉(zhuǎn)移酶I并使其失活，逆轉(zhuǎn)抑癌基因的高甲基化狀態(tài)，重新激活基因表達(dá)。而目前對(duì)于LTF基因在胃癌內(nèi)的研究尚少，因此本實(shí)驗(yàn)選擇胃癌細(xì)胞株MGC803，觀察LTF基因的表達(dá)和其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，旨在研究胃癌細(xì)胞株內(nèi)LTF基因表達(dá)水平和啟動(dòng)子異常甲基化相關(guān)性，為胃癌臨床診斷治療提供一個(gè)新的可能靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料 人胃腺癌細(xì)胞株MGC803（中國(guó)上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫(kù)），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），PRMI1640、PBS、青/鏈霉素（100U/ml）購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；5-aza-CdR（美國(guó)Sigma公司），用培養(yǎng)基充分溶解配成適量濃度的母液，分裝后存于-80℃?zhèn)溆?；TRIzol（美國(guó)Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，real-time PCR試劑盒（SYBRRGreen Realtime PCRMasterMix，日本TOYOBO公司）；亞硫酸氫鈉修飾試劑盒（美國(guó)ZYMO公司），Ex Taq HSDNA聚合酶、pMD 19-T Vecto（r日本TaKaRa公司）?？贵wanti-Lactoferrin（美國(guó)Abcam公司，77 kDa，1∶1 000#ab10110），β-actin antibody（中國(guó)碧云天公司，42kDa，1∶1 000）。熒光定量PCR儀（型號(hào)CFX96，美國(guó)BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和5-aza-CdR藥物處理 SGC7901細(xì)胞用含10%胎牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)液放置在37℃、5%C O2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。以1×105均勻鋪入6孔板內(nèi)，生長(zhǎng)過(guò)夜。饑餓處理16 h，然后給予0μmol/L（空白對(duì)照組）、2μmol/L、10μmol/L的5-aza-CdR藥物處理（分別為2μmol/L組和10μmol/L組），24h換液1次，培養(yǎng)5d后處理細(xì)胞。

1.2.2 real-time PCR檢測(cè)藥物干預(yù)前后LTF基因mRNA表達(dá) 取對(duì)照和藥物處理組后回收細(xì)胞，用TRIzol提取細(xì)胞總RNA。約取1μg總RNA根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反應(yīng)得到20μl體系的cDNA。以得到cDNA為模板，進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)。引物由上海生工公司設(shè)計(jì)并合成，用GAPDH作為內(nèi)參，引物序列分別為上游5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′，下游5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度113 bp。LTF引物序列分別為：上游5′-TACAAATCCCAACAAAGCAGTG-3′，下游5′-CTTCCACAGGTCTATCCACACA-3′，產(chǎn)物大小約58bp。20μl PCR體系包括：SYBRRGreen Realtime PCR Master Mix 10μl，Plus solution 2μl，PCR Forward Prime（r10μmol/L）1.2μl，PCR Reverse Primer（10μmol/L）1.2μl，模板 cDNA 2μl，ddH2O 3.6μl。反應(yīng)條件是95℃預(yù)變性30s，95℃5s、62℃10s、72℃15s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析來(lái)辨別是否有非特異性擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。數(shù)據(jù)用2－ΔΔCt法分析。

1.2.3 Western blot檢測(cè)藥物干預(yù)前后LTF基因蛋白表達(dá) 回收空白對(duì)照組和藥物處理組細(xì)胞，加入適量的蛋白抽提 cell lysis buffer（每孔50μg）裂解細(xì)胞，然后用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。用12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，將蛋白用半干式電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，用5%脫脂牛奶TBST封閉硝酸纖維膜，室溫下?lián)u2 h。與一抗anti-Lactoferrin（77 kDa）結(jié)合（以TBS稀釋?zhuān)瑵舛纫揽贵w而定)，4℃搖過(guò)夜，TBST洗4次，每次5min，用β-actin antibody（42kDa）作為內(nèi)參。加入二抗(以TBS稀釋?zhuān)瑵舛纫揽贵w而定)，室溫?fù)u1 h，TBST洗4次，每次5min。用碧云天公司的ECL試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。X線(xiàn)片壓片、顯影、定影。

1.2.4 亞硫酸氫鹽修飾DNA和BSP反應(yīng) 取對(duì)照和藥物處理組后回收細(xì)胞，按DNA提取試劑盒提取胃癌細(xì)胞株的基因組DNA。然后按甲基化修飾試劑盒進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾，使未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶（T），而甲基化的Cm不變。以修飾后基因組DNA為模板，用Ex Taq HSDNA聚合酶進(jìn)行LTF基因啟動(dòng)子擴(kuò)增。LTF特異性引物參考文獻(xiàn)[5]，分別是上游5′-TTGAGATTAGAGTTGGGATAGGG-3′，下游：5′-CCCCCAAACACCTACACTCA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為397bp。其反應(yīng)體系為50μl，包括：TaKaRa Taq HS 0.25μl，10×PCR Buffer 5μl，dNTPMixture 4μl，上游引物（10μmol/L）1μl，下游引物（10μmol/L）1μl，模板DNA 1μl（≤50ng），ddH2O 37.75μl。反應(yīng)條件為95℃變性15min，94℃ 30s、56℃30s、72℃30s進(jìn)行35次循環(huán)，然后72℃延伸7min。將獲得的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)記錄數(shù)據(jù)。

1.2.5 挑選陽(yáng)性克隆和測(cè)序 于紫外燈下切取含目的DNA的條帶，按DNA凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化。取回收純化的DNA 4.5μl，與pMD 19-T Vector 0.5μl，solution I 5μl配成10μl體系，輕輕混勻后16℃連T載體12h。取2.5μl連接產(chǎn)物與25μl的大腸桿菌感受態(tài)冰浴30min，42℃水浴90s，冰上放置3min，加入不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基600μl，37℃，250r/min振搖45min，離心將菌液濃縮為15μl，并涂于氨芐（100μg/ml）抗性的LB平板上，先正面向上放置平板1h風(fēng)干，翻轉(zhuǎn)倒置平板37℃培養(yǎng)過(guò)夜，12～16h后即可長(zhǎng)出菌落。隨機(jī)挑選15個(gè)單克隆菌落，放在500μlLB液體培養(yǎng)基（含有氨芐青霉素100μg/ml），搖渾濁菌液。用普通PCR鑒定陽(yáng)性重組子，取1μl搖渾的菌液做PCR模板，2×Taq酶MIX 5μl，上下游通用引物各0.2μl，ddH2O 3.6μl構(gòu)成10μl PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果。最后送檢10個(gè)克隆于上海生工公司測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，realtime PCR結(jié)果和總體甲基化率組間比較采用Oneway ANOVA分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。CpG位點(diǎn)甲基化率比較采用行×列表χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞株MGC803 LTF基因的mRNA表達(dá)和啟動(dòng)子甲基化率 見(jiàn)圖1。

圖1 3組LTFmRNA表達(dá)（A）和啟動(dòng)區(qū)甲基化率（B）的比較（與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05）

由圖1可見(jiàn)，不同濃度5-aza-CdR處理胃癌細(xì)胞株MGC803后，2μmol/L組和10μmol/L組其mRNA表達(dá)較空白對(duì)照組明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），但2μmol/L組和10μmol/L組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。甲基化率空白對(duì)照組為59.82%，2μmol/L組為29.46%，10μmol/L組為15.17%（P＜0.05），但2μmol/L組和10μmol/L組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 胃癌細(xì)胞株MGC803 LTF基因蛋白表達(dá) 見(jiàn)圖2。

圖2 5-aza-CdR藥物處理前后LTF的蛋白表達(dá)（1、2、3分別代表空白對(duì)照組、2μmol/L組、10μmol/L組）

由圖2可見(jiàn)，藥物處理前后LTF基因蛋白表達(dá)空白對(duì)照組較低，兩個(gè)不同濃度藥物組均較空白對(duì)照組明顯增加。

2.3 胃癌細(xì)胞株MGC803藥物處理前后LTF基因甲基化情況 見(jiàn)圖3～5。

圖3 LTF基因的BSP法電泳圖結(jié)果

由圖3可見(jiàn)，目的條帶397bp清晰。

由圖4可見(jiàn)，所選陽(yáng)性單克隆概率達(dá)83.3%（5/6）。

由圖5可見(jiàn)，其中3，4，5，6，11，12，13號(hào)CpG位點(diǎn)甲基化程度超過(guò)50%，呈高甲基化狀態(tài)。而用5-aza-CdR處理后，與空白對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)14號(hào)位點(diǎn)甲基化情況變化不大。3、4、5、6、10、11、12、13號(hào)這8個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化率較空白對(duì)照組明顯降低，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

3 討論

LTF基因位于染色體短臂3p21.3的CER1區(qū)，編碼包含17個(gè)外顯子長(zhǎng)約2.4kb的mRNA，翻譯一個(gè)分子質(zhì)量約為80kD的鐵結(jié)合蛋白，命名為乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）[9]。該基因在多種惡性腫瘤內(nèi)表現(xiàn)為候選的抑癌基因。

LTF基因在鼻咽癌，肺癌，前列腺癌等多種腫瘤及相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞株呈表達(dá)降低或缺失的狀態(tài)，有研究顯示這種現(xiàn)象與該基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化異常高度相關(guān)[5-8]。為研究LTF基因啟動(dòng)子甲基化對(duì)LTF在胃癌里表達(dá)的影響，我們使用BSP方法來(lái)檢測(cè)胃癌細(xì)胞株的甲基化情況。BSP法是公認(rèn)的分析DNA甲基化的金標(biāo)準(zhǔn)[10-11]。本研究結(jié)果顯示LTF基因在胃癌細(xì)胞株MGC803內(nèi)是呈高甲基化的（總體甲基化率是59.82%），這與學(xué)者在鼻咽癌和肺癌里的報(bào)道一致[6-7]。去甲基化劑5-aza-CdR作用后隨著藥物處理組LTF基因啟動(dòng)子區(qū)總體甲基化程度下降，其mRNA重新表達(dá)。這些結(jié)果進(jìn)一步證明LTF基因啟動(dòng)子區(qū)異常高甲基化是引起LTF基因在胃癌組織和細(xì)胞株里沉默的關(guān)鍵表觀遺傳學(xué)機(jī)制，同時(shí)這種“疾病狀態(tài)”是可以被去甲基化劑逆轉(zhuǎn)的。但是兩個(gè)藥物處理組間的甲基化率和mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能和5-aza-CdR對(duì)BGC823的去甲基化作用達(dá)到平臺(tái)期相關(guān)。該段DNA啟動(dòng)子區(qū)含有14個(gè)CpG島，CpG島是一段長(zhǎng)約1kb的富含飾CpG和GpC序列的DNA結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其中3，4，5，6，11，12，13號(hào)CpG位點(diǎn)甲基化程度超過(guò)50%，呈高甲基化狀態(tài)。而用5-aza-CdR處理后，與空白對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)14號(hào)位點(diǎn)甲基化情況變化不大。3，4，5，6，10，11，12，13號(hào)這8個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化率較空白對(duì)照組明顯降低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。我的猜測(cè)這些位點(diǎn)和LTF在胃癌的表達(dá)缺失及逆轉(zhuǎn)其表達(dá)可能相關(guān)。

圖4 LTF甲基化后目的DNA連T載體挑選陽(yáng)性克隆電泳圖（1，2，3，4，6為陽(yáng)性克隆，成功連接T載體，509 bp；5為陰性克隆，未連接T載體，397 bp）

圖5 3組LTF基因啟動(dòng)子區(qū)14個(gè)CpG島的甲基化率改變（與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05）

大量研究證明LTF在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中有抗腫瘤作用[12-14]，但是其機(jī)制目前并不明確。大量文獻(xiàn)報(bào)道在乳腺癌，頭頸部腫瘤和其他腫瘤細(xì)胞內(nèi)，LTF蛋白可以激活細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，進(jìn)而阻滯惡性腫瘤細(xì)胞從G1期到S期的過(guò)渡，最終抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[15－16]。這提示LTF蛋白對(duì)這些腫瘤有化學(xué)預(yù)防作用。有些研究認(rèn)為L(zhǎng)TF的蛋白能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，如細(xì)胞周期蛋白cyclin、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑（cyclin dependent kinase inhibitor，CKI）和抑癌基因（p53和Rb）的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞周期的整個(gè)進(jìn)程[17]。但是也有學(xué)者持不同意見(jiàn)，認(rèn)為L(zhǎng)TF蛋白補(bǔ)給治療能調(diào)節(jié)MAPK（mitogen-activated protein kinase）通路卻不會(huì)影響p53的表達(dá)[18]。Oh等[19]證實(shí)LTF蛋白參與激活NF-kB（nuclear factor-κB，NF-kB）信號(hào)通路，進(jìn)而激活NF-kB的相關(guān)靶基因，同時(shí)激活的NF-kB能抑制p53的轉(zhuǎn)錄，p53能反向調(diào)節(jié)下游基因mdm2和p21的表達(dá)，最終遏制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。Xu等[20]報(bào)道LTF在SGC7901里能夠抑制蛋白激酶的活化，調(diào)節(jié)其下游蛋白的磷酸化然后誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。另有學(xué)者報(bào)道LTF在結(jié)腸癌里促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制與激活Fas信號(hào)通路，增強(qiáng)caspase-8和caspase-3表達(dá)相關(guān)[21]。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)LTF基因在胃癌里是低表達(dá)的，而且與LTF啟動(dòng)子甲基化高度相關(guān)。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)重要機(jī)制之一，其本身優(yōu)勢(shì)在于不涉及基因序列的改變就可以調(diào)控基因的表達(dá)，并且能夠被甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑逆轉(zhuǎn)的。5-aza-CdR，作為一種甲基化轉(zhuǎn)移酶，已成功應(yīng)用于白血病的臨床治療[22]，這對(duì)其他機(jī)制和抑癌基因甲基化異常相關(guān)的腫瘤來(lái)說(shuō)是個(gè)成功的鼓舞。LTF可作為胃癌內(nèi)的候選抑癌基因，由于LTF在胃癌內(nèi)表達(dá)和基因甲基化機(jī)制相關(guān)，為未來(lái)可能

通過(guò)甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑來(lái)進(jìn)行腫瘤的預(yù)防和早期治療提供理論依據(jù)。

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Expression of LTF gene and its promotor region methylation in human gastric cancer cell lines MGC803

CHEN Xuyan，ZHUGE Xiao-ju,CHEN Renpin,et al.Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the exp ression of LTF(lactotransferrin)gene and its p romoter region in human gastric cancer cell line MGC803.Methods The exp ression of LTFm RNA and p rotein levels in MGC803 cells were detected by real-time PCR and Western b lot,respec tively;LTF p romotormethylation status was determ ined by Bisulfite genom ic sequencing PCR(BSP).MGC803 cells were treated w ith 5-aza-CdR to reversemethylation status,Results LTF p romotormethylation rate in MGC803 was 59.8%.Compared to control g roup,methylation status and m RNA exp ression of LTF in 5-aza-CdR treatment groups(2μmol/L and 10μmol/L)were reversed(P＜0.05);however there was no d ifference between d ifferent treatmentg roups(P＞0.05).Conclusion The LTFmethylation in p romoter region is high and LTFm RNA exp ression in MGC803 cells is low,5-aza-CdR can reverse themethylation status and up-regulate LTFm RNA exp ression.

Stomach neop lasms Lac totransferrin 5-aza-CdR DNAmethylation CpG island

2015-03-06）

（本文編輯：沈昱平）

溫州市科技局項(xiàng)目（Y20140275）

325000溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科（陳旭艷、陳仁聘、黃智銘）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院消化內(nèi)科（諸葛小菊）

黃智銘，E-mail：w yyyhzhim ing@126.com