沈淑蓉 朱靜 張浩 曾靜靜 付瑤陽 王雅琪 王方巖

酪酸梭菌抗阿司匹林致小鼠胃潰瘍作用的初步研究

沈淑蓉 朱靜 張浩 曾靜靜 付瑤陽 王雅琪 王方巖

目的鉬觀測酪酸梭菌是否對阿司匹林導(dǎo)致的胃潰瘍具有預(yù)防效應(yīng)，并對其機制進(jìn)行初步探討。方法鉬取30只健康雄性ICR小鼠，隨機分成3組，每組各10只，即模型組、酪酸梭菌組、奧美拉唑組。酪酸梭菌組以6×108c fu/只的菌量，模型組和奧美拉唑組均予以相同體積的無菌培養(yǎng)基，灌胃4d后再饑餓處理48h，然后以250mg/kg劑量的阿司匹林灌胃造模，奧美拉唑組小鼠于造模前30m in，腹腔注射奧美拉唑（13mg/kg）。造模4h后，取胃組織分別測定SOD、CAT活力、MDA含量；進(jìn)行常規(guī)HE染色觀察胃黏膜組織結(jié)構(gòu)變化，PAS染色判斷黏液量的變化，免疫組化法測定Bc l-2、Bax表達(dá)水平。結(jié)果 模型組的SOD、CAT活性明顯降低，MDA含量顯著增加，而酪酸梭菌預(yù)處理后逆轉(zhuǎn)了該趨勢（P＜0.01），與奧美拉唑組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。HE染色觀察，酪酸梭菌能減輕胃黏膜的病理損傷，與奧美拉唑組無統(tǒng)計學(xué)差異。PAS結(jié)果提示酪酸梭菌能夠增加黏液量。酪酸梭菌組的Bc l-2表達(dá)較模型組顯著增多，同時Bax表達(dá)顯著減少。結(jié)論 酪酸梭菌預(yù)處理通過抗氧化應(yīng)激、增加胃黏液量、上調(diào)Bc l-2/Bax表達(dá)比例，減輕阿司匹林造成的胃潰瘍損傷。

酪酸梭菌 阿司匹林 胃潰瘍 氧化應(yīng)激

胃潰瘍（gastric ulcer，GU）是最為常見的胃部疾病，其發(fā)病率高，在造成胃黏膜損傷的諸多原因中，以非甾體抗炎藥物（non-steroidalanti-inflammatory drug，NSAID）的廣泛應(yīng)用最為突出[1-3]，其中阿司匹林對胃黏膜的直接損害作用最為顯著。如何防治該類GU的發(fā)生與復(fù)發(fā)，仍是廣大研究人員所面對的重大課題。酪酸梭菌（Clostridium butyricum，C.butyricum）是專性厭氧的革蘭陽性芽胞桿菌，1933年由日本宮入近治博士首次發(fā)現(xiàn)。其形態(tài)呈直桿狀或稍有彎曲，中間輕度膨隆，兩端鈍圓，是一種存在于人和畜禽腸黏膜內(nèi)的益生菌。其在人體腸道內(nèi)可促進(jìn)多種有益菌群的增殖，抑制有害菌和腐敗菌的生長、繁殖，改善腸道內(nèi)的微生態(tài)環(huán)境，減少腸毒素的產(chǎn)生。在臨床應(yīng)用中，酪酸梭菌治療腸道菌群紊亂引起的腸炎、腹瀉、消化不良等疾患，取得了顯著療效[4-6]。在胃部疾病的治療中，酪酸梭菌已被用于拮抗幽門螺桿菌，且效果頗佳，但該菌對胃黏膜是否具有直接的保護(hù)作用，仍未有探討。本實驗旨在探索酪酸梭菌能否預(yù)防阿司匹林導(dǎo)致的GU，希望由此改善阿司匹林的不良反應(yīng)，并且對酪酸梭菌在GU直接防治方面，提供更有力的支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 本實驗室保藏酪酸梭菌株（CGMCC NO. 8808）

1.1.2 液體培養(yǎng)基（TPY培養(yǎng)基） 水解酪蛋白10g/L，植物胨5.0g/L，酵母粉2.0g/L，葡萄糖5.0g/L，L-半胱氨酸0.5g/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，氯化鎂0.5g/L，硫酸鋅0.25g/ L，氯化鈣0.15g/L，氯化鐵0.0001g/L，吐溫80 1.0g/L，pH 6.5±0.1。

1.1.3 試劑 注射用奧美拉唑鈉（江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司），BCA蛋白定量試劑盒丙二醛（MDA）測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），PAS染色試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），阿司匹林（美國Sigma公司），Bcl-2多克隆抗體（美國Biovision公司），Bax多克隆抗體（美國Cell signal公司），免疫組化試劑盒（北京中杉公司）。

1.1.4 動物 ICR小鼠30只，雄性，體重（25.0±2.0）g，購自溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，按隨機數(shù)字表法分成3組，每組各10只。

1.2 方法

1.2.1 酪酸梭菌活化與傳代 取酪酸梭菌活化后將培養(yǎng)基置于37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，菌的濃度達(dá)2× 109cfu/ml。

1.2.2 造模 酪酸梭菌組灌胃0.3ml酪酸梭菌培養(yǎng)液/只；模型組和奧美拉唑組均灌胃相同體積的無菌培養(yǎng)基，處理4d后饑餓48h，以250mg/kg劑量的阿司匹林灌胃造模[7]。奧美拉唑組造模前30min腹腔注射奧美拉唑13mg/kg。

1.2.3 胃組織獲取 將小鼠頸椎脫臼處死，分別結(jié)扎賁門，幽門端后取胃，每組4只鼠胃置于10%甲醛中固定15min，沿胃大彎剪開，0.9%氯化鈉溶液沖洗，濾紙吸干水分，拍照。保存至甲醛溶液中，用于后期組織切片與染色觀察；剩余胃組織（每組6只）用冰0.9%氯化鈉溶液洗凈，存于-80℃冰箱，用于后續(xù)SOD、CAT、MDA指標(biāo)測定。

1.2.4 潰瘍面積測定 將上述固定胃組織展開平置用掃描儀掃描，通過軟件Image-Pro Plus（IPP）6.0測量胃組織的總面積及出血潰瘍面，并計算兩者的相對面積比例。

1.2.5 HE染色 將固定后的胃組織進(jìn)行常規(guī)脫水石蠟包埋，制成病理切片，切片厚度約為5μm，HE染色在光鏡下觀察胃黏膜的組織學(xué)變化。

1.2.6 PAS染色 將石蠟包埋的胃組織標(biāo)本切片后，行常規(guī)PAS染色，在光鏡下觀察胃黏膜的黏液變化情況。

1.2.7 氧化還原指標(biāo)測定 取出凍存胃組織稱重，用冰0.9%氯化鈉溶液制成10%胃組織勻漿，4℃2 500r/min× 10min，離心取上清液，采用雙縮脲蛋白質(zhì)定量（BCA）法進(jìn)行蛋白定量，檢測并計算以下各氧化還原指標(biāo)單位含量。（1）SOD活力測定采用黃嘌呤氧化酶法：通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧自由基，后者氧化羥氨形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，顯色后于550nm處有最大吸收峰[以吸光度（A）表示]。具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。（2）CAT活力測定采用H2O2法：過氧化氫酶（CAT）分解H2O2的反應(yīng)可通過鉬酸銨而迅速中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生淡黃色的絡(luò)合物，在405nm處測定生成量，可以利用對照管和測定管的A值差異即可求出每毫克蛋白CAT活力（U/mgprot）。具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。（3）MDA含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法：MDA與TBA縮合，生成紅棕色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算獲得MDA的摩爾濃度（μmol/mgprot）。具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.8 免疫組化法測定Bcl-2、Bax表達(dá) 將組織切片常規(guī)脫蠟后，行枸櫞酸抗原修復(fù)。分別用Bcl-2（1∶80）、Bax（1∶200）一抗4℃孵育過夜，滴加二抗室溫2h后，DAB工作液顯色，在顯微鏡下觀察，當(dāng)出現(xiàn)特異性顯色時用蒸餾水終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染10s左右，PBS返藍(lán)。最后脫水、透明、中性樹脂封片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，測得計量資料采用表示，方差齊性者采用LSD法分析，不齊者采用Tamhane’s T2分析，兩兩比較采用q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 小鼠胃黏膜損傷情況 見圖1-2。

由圖1可見，模型組的胃黏膜表面出血明顯，呈彌散性。但經(jīng)酪酸梭菌預(yù)防性處理后，黏膜損傷顯著減輕，與奧美拉唑的效果相似。

由圖2可見，經(jīng)PPI軟件計算所得的潰瘍指數(shù)，也提示模型組黏膜潰瘍顯著，而酪酸梭菌與奧美拉唑預(yù)處理后潰瘍指數(shù)得到明顯改善（均P＜0.01）。

圖1 各組小鼠胃黏膜標(biāo)本形態(tài)（A：模型組；B：酪酸梭菌組；C：奧美拉唑組）

圖2 各組胃黏膜潰瘍指數(shù)變化

2.2 小鼠胃黏膜HE染色光鏡觀察 見圖3。

圖3 各組小鼠胃黏膜HE染色病理圖（A：模型組；B：酪酸梭菌組；C：奧美拉唑組；×200）

由圖3可見，模型組胃黏膜嚴(yán)重缺損，局部壞死脫落，腺體破壞嚴(yán)重。酪酸梭菌組和奧美拉唑組胃黏膜組織較完整，腺體排列較整齊，有少量炎癥細(xì)胞浸潤。

2.3 小鼠胃黏膜PAS染色光鏡觀察 見圖4。

圖4 各組小鼠胃黏膜PAS染色病理圖（A：模型組；B：酪酸梭菌組；C：奧美拉唑組；×200）

由圖4可見，模型組胃黏膜黏液層明顯變薄。與模型組相比，酪酸梭菌組與奧美拉唑組黏液層顯著增厚，酪酸梭菌組PAS甚至略優(yōu)于奧美拉唑組。

2.4 各組胃組織的SOD、CAT活性及MDA含量變化見表1。

表1 各組胃組織的SOD、CAT活性及MDA含量變化

由表1可見，阿司匹林處理后，胃組織內(nèi)的SOD、CAT活性明顯降低，而MDA含量顯著升高，在酪酸梭菌預(yù)處理后，以上這些變化都得到明顯改善（均P＜0.01）。酪酸梭菌組的各項指標(biāo)較奧美拉唑組無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.5 胃組織Bcl-2、Bax表達(dá)情況 見圖5。

圖5 各組胃組織Bcl-2，Bax免疫組化（上排：Bcl-2，下排：Bax；A：模型組，B：酪酸梭菌組，C：奧美拉唑組，×200）

由圖5可見，模型組Bcl-2的表達(dá)呈陰性或弱陽性，Bax呈強陽性。酪酸梭菌處理后Bcl-2顯著升高、Bax明顯下降，而奧美拉唑組Bcl-2、Bax的表達(dá)基本都呈陰性或弱陽性。

3 討論

阿司匹林是臨床上廣泛應(yīng)用的NSAID類藥物，常用于預(yù)防及治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和血栓性心血管病。隨著人口老齡化的加劇，此類疾病日益增多，阿司匹林的應(yīng)用越來越廣泛，由其誘發(fā)的GU亦愈發(fā)常見。環(huán)氧合酶（COX）能夠促進(jìn)胃黏液分泌，增強胃的屏障作用，而阿司匹林抑制了COX，從而削弱了胃黏膜的屏障功能，造成胃對損傷因素的易感性[8]。在此過程中，有炎癥因子的參與如IL-1β、TNF-α等[9]，活性氧族（reactive oxygen species，ROS）也是重要的損傷因素[10]。

阿司匹林復(fù)制的小鼠GU模型，與患者服用NSAID類藥物造成的GU，在發(fā)病機制及臨床表現(xiàn)方面都有高度的擬合性。該模型是研究NSAID造成GU的機制及篩選防治藥物的良好模型[11]。本研究中，我們也成功復(fù)制該模型，并發(fā)現(xiàn)明顯的病理損傷及氧化應(yīng)激，這與以往的研究相一致[10]。

在本研究中，酪酸梭菌預(yù)處理后，能夠較明顯的緩解阿司匹林所造成GU。肉眼觀察及病理切片結(jié)果顯示，酪酸梭菌減輕了胃黏膜的損傷程度。阿司匹林造成的SOD、CAT含量活性降低以及MDA升高，經(jīng)酪酸梭菌預(yù)處理后也得到明顯改善。該結(jié)果提示，酪酸梭菌可能通過減輕氧化應(yīng)激實現(xiàn)對胃黏膜的保護(hù)作用。在非酒精性肝病的研究中，酪酸梭菌可減少由肝病引起的ROS產(chǎn)量，實現(xiàn)對肝臟的保護(hù)效應(yīng)[12]。PAS染色的結(jié)果提示酪酸梭菌能夠促進(jìn)胃黏液的產(chǎn)生，從而保護(hù)胃黏膜，這是臨床現(xiàn)行的GU治療措施所不具備的特性，在將來的研究中可以更深入的闡述其機制，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。免疫組化的結(jié)果提示酪酸梭菌具有上調(diào)Bcl-2/Bax比例的能力，提示該菌能夠由此發(fā)揮抗凋亡作用。

正常人胃液的pH值為1.5～2.0，胃液里的鹽酸可以殺死隨食物進(jìn)入胃內(nèi)的細(xì)菌[13]，因此鮮有細(xì)菌能在胃內(nèi)定植。但酪酸梭菌具有較強的抗酸能力，有學(xué)者已發(fā)現(xiàn)該菌能夠在小鼠胃內(nèi)定植[14]，本研究則發(fā)現(xiàn)該菌能從多層面多角度對胃黏膜實施的保護(hù)作用，該特點是其他益生菌很難企及的。酪酸梭菌的這種顯著效應(yīng)可能與其代謝產(chǎn)物有關(guān)，已有多個中心證實該菌兩個主要代謝產(chǎn)物丁酸和氫氣均是較為有效的抗氧化物質(zhì)，而且丁酸是典型的組蛋白去乙?；敢种苿軌蛘{(diào)節(jié)基因的表達(dá)，這很可能是酪酸梭菌改變Bcl-2/Bax比例的主要原因[15-16]。

該菌是臨床上常規(guī)使用的益生菌，廣泛用于治療腸炎、腹瀉、消化不良等疾患，若在臨床研究中也能夠證實其對胃黏膜的直接保護(hù)效應(yīng)，將是廣大NSAID服用者的福音。

[1]Wallace J L.Prostag land ins,NSAIDs,and gastric mucosal p rotection:why doesn't the stomach digestitself[J].PhysiolRev,2008, 88(4):1547-1565.

[2]Darling R L,Romero J J,Dial E J,et al.The effects of aspirin on gastric mucosalinteg rity,surface hyd rophobicity,and p rostag lan -d inmetabolism in cyc looxygenase knockoutm ice[J].Gastroenterology,2004,127(1):94-104.

[3]Duggan JM.Gastrointestinalhaemorrhage gastric ulcer,and asp irin abuse[J].Gut,1969,10(1):77.

[4]Nakajima N,Matsuura Y.Purification and characterization ofkonjac g lucomannan deg rad ing enzyme from anaerobic hum an intestinalbac terium,Clostrid ium butyricum-Clostrid ium beijerinckii g roup[J].BiosciBiotechnolBiochem,1997,61(10):1739-1742.

[5]吳愷,王冰嫻,王興鵬.宮入菌對急性壞死性胰腺炎大鼠腸道細(xì)菌移居的作用[J].世界華人消化雜志,2000,8(8):883-886.

[6]朱曉慧,唐寶英,劉佳.酪酸菌對腸道有益菌的增殖作用和共生關(guān)系研究[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2005,16(4):193-194.

[7]丁順,王昕.生姜對阿司匹林誘發(fā)胃潰瘍大鼠的胃粘膜保護(hù)作用研究[J].中國民族民間醫(yī)藥,2012,21(21):22,24.

[8]Laine L,Takeuchi K,Tarnawski A.Gastric mucosal defense and cytop rotec tion:bench to bedside[J].Gastroenterology,2008,135 (1):41-60.

[9]Santucc iL,FiorucciS,DiM FM,etal.Role of tum ornecrosis factor alpha release and leukocyte margination in indomethacin-induced gastric injury in rats[J].Gastroenterology,1995,108(2): 393-401.

[10]Das S K,Roy C.The p rotec tive role of Aeg le m arm elos on asp irin-induced gastro-duodenalu lceration in albino ratmodel:a possib le involvement of antioxidants[J].Saud i J Gastroenterol, 2012,18(3):188-194.

[11]Astud illo L,Rod riguez J A,Schmeda-Hirschm ann G.Gastrop rotective activity ofoleanolic acid derivatives on experimentally induced gastric lesions in rats and m ice[J].JPharm Pharmacol, 2002,54(4):583-588.

[12]Endo H,Niioka M,KobayashiN,etal.Butyrate-p roduc ing p rob iotics reduce nonalcoholic fatty liver d isease p rog ression in rats:new insight into the p robiotics for the gut-liver axis[J]. PLoSOne,2013,8(5):e63388.

[13]張芝穎,王欣然,韓斌如.胃-肺感染途徑致呼吸機相關(guān)性肺炎研究進(jìn)展[J].中華護(hù)理雜志,2005,(8):625-628

[14]TakahashiM,TaguchiH,YamaguchiH,et al.Stud ies of the effect of Clostrid ium butyricum on Helicobacter pylori in several testmodels inc lud ing gnotobiotic m ice[J].J Med Microbiol, 2000,49(7):635-642.

[15]Ohira H,Fujioka Y,Katag iriC,et al.Butyrate attenuates inflamm ation and lipo lysis generated by the interaction of ad ipocytes andm acrophages[J].JAtherosc lerThromb,2013,20(5):425-442.

[16]Buchholz BM,KaczorowskiD J,Sugimoto R,eta l.Hyd rogen inhalation ameliorates oxidative stress in transp lantation induced intestinalg ra ftin jury[J].Am JTransp lant,2008,8(10):2015-2024.

Clostridium butyricum prevents gastric ulcer induced by aspirin in mice

SHEN Shurong,ZHU Jing,ZHANG Hao,et al.Department of Oncology,Wenzhou Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine,Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the effectof Clostridium butyricum(C.butyricum)in p revention ofgastric ulcer(GU) induced by asp irin in m ice.Methods Thirty ICRm ice were random ly d ivided intomodelg roup,bacteria g roup andomep razole g roup(n=10/g roup).After starvation for 48h,m ice were given orally w ith 250mg/kg asp irin to estab lish GU model.Mice in bacteria g roup were orally p retreated w ith C.butyricum 6×108c fu for 4d before starvation,while m ice in model g roup and omep razole g roupwere given the samevolume ofsterile culturemedium.Mice in omep razole g roup were intraperitoneally injec ted w ith 13mg/kg omep razole 30m in p riorto asp irin treatment.Modeling for 4 h,gastric tissue was to harvest formeasuring the ac tivity of SOD and CAT,the contentofMDA,Bc l-2 and Bax,HE staining and PAS staining were performed.Results In modelg roup,the activity of SOD,CAT were significantly reduced while the content of MDA was significantly increased.The activity of SOD,CAT were increased while the contentofMDA was reduced in bacteria g roup(P＜0.01),there was no significantd ifference between bacteria and omep razole g roup.The Bc l-2 exp ression increased and Bax exp ression reduced in bacteria g roup.PAS stainning showed that themucus secretion was increased in bacteria g roup and HE staining showed that themucosa injury was attenuated in bacteria gorup.Conclusion C.butyricum can effectively p rotect the gastricmucosa againstdamages caused by asp irin inm ice.

Clostrid ium butyricum Aspirin Gastric ulcer Oxidative stress

2014-12-18）

（本文編輯：沈昱平）

溫州市科技局項目（Y20130215，Y20110136）；浙江省新苗計劃項目（2014R 413032）

325000溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤科（沈淑蓉）；溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院（朱靜、張浩、曾靜靜、付瑤陽、王雅琪）；溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病生教研室，溫州市中山醫(yī)院內(nèi)科（王方巖）

王方巖，E-mail：w zyxyw fy@126.com