張士偉，李卉卉，周 江，楊小弟

(1.北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京 100871；2.南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210046)

近年來，關(guān)于G-四鏈體結(jié)構(gòu)與生物學(xué)相關(guān)性的研究越來越多[1]。在人類端粒[2]和很多癌基因啟動子區(qū)域[3-4]均含有能夠形成G-四鏈體的潛在富G序列。已有研究表明，G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成可能對基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)有影響[5-7]，因此，G-四鏈體結(jié)構(gòu)已成為眾多科學(xué)家研究的熱點，并有望作為癌癥治療的新型靶點[8]。

在Kras基因啟動子區(qū)域，有段富含鳥嘌呤G的核酸酶超敏感位點(NHPPE)[9-10]，它對基因的轉(zhuǎn)錄具有重大意義。Cogoi等[11]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)此序列形成基因G-四鏈體結(jié)構(gòu)后，核酸酶的活性受到影響，基因啟動表達(dá)發(fā)生了下調(diào)的現(xiàn)象，這將影響到P21蛋白的編碼與合成，進(jìn)一步抑制細(xì)胞的分裂。Kras基因G-四鏈體的形成可協(xié)助抑制腫瘤細(xì)胞增殖，因此，Kras基因G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成、穩(wěn)定性以及構(gòu)象特點的研究也成為腫瘤疾病治療的新重點。

本工作以原生型Kras基因啟動子區(qū)序列(KS1)及其4種突變體序列(KS2～KS5)為研究目標(biāo)，采用電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)和圓二色譜(CD)法[12-13]研究Kras基因G-四鏈體的形成與性質(zhì)，希望為研究G-四鏈體的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能提供更多信息，同時也為相關(guān)抗癌藥物的研制提供更廣闊的思路和方向。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

LCQ DECA XP plus電噴霧質(zhì)譜儀：美國Thermo Finnigan公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源(ESI)、Xcalibur1.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；J-810圓二色譜儀：日本JASCO公司產(chǎn)品；Mastercycler nexus PCR退火及控溫儀：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；Seven Multi型pH計：梅特勒-托利多上海儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

HPLC純化的寡核苷酸序列KS1～KS5：由上海生物工程技術(shù)有限公司提供，其序列與命名列于表1；DNA儲備液用Milli-Q超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)配制，其他實驗用水均為去離子水；實驗所用CH3OH、NH4OAc、KCl、NaCl均為分析純。

表1 實驗所用DNA序列及命名Table 1 Sequences and abbreviations of DNA used in this study

1.3 樣品處理

1.3.1質(zhì)譜溶液 用25%CH3OH水溶液配制濃度分別為10、25、50、100 mmol/L的NH4OAc溶液，再分別用這些溶液配制濃度為5 μmol/L的DNA樣品溶液，靜置2 h后，用質(zhì)譜采樣。

1.3.2CD條件 配制2.5 μmol/L的DNA樣品溶液，溶液中陽離子(NH4+、Na+和K+)濃度隨條件變化而改變。除NH4OAc溶液外，其他陽離子溶液中tris-HCl濃度均為30 mmol/L。將配好的樣品靜置30 min后，放入PCR儀中，于90 ℃加熱5 min，再以0.1 ℃/min緩慢降溫至4 ℃。

1.4 實驗條件

1.4.1質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，噴霧電壓-2.7 kV，毛細(xì)管溫度130 ℃，N2流速25 個單位，負(fù)離子掃描模式，質(zhì)量掃描范圍m/z1 000～2 000，進(jìn)樣速率2 μL/min。

1.4.2圓二色譜條件 掃描范圍320～220 nm，吸收池溫度20 ℃，掃描速度100 nm/min，每次進(jìn)樣前均采用背景溶液進(jìn)行基線校準(zhǔn)。變溫實驗采用固定波長溫度間隔模式掃描，吸收池溫度從20 ℃以2 ℃/min升至95 ℃。所得數(shù)據(jù)用Origin軟件處理，Boltzmann擬合得出Tm值。

2 結(jié)果與討論

2.1 G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成

5 μmol/L KS1在10、25 mmol/L NH4OAc溶液中(含25%CH3OH)的ESI-MS圖示于圖1。ESI-MS結(jié)果顯示，對于穩(wěn)定時間相同的溶液，KS1鏈在10 mmol/L NH4OAc溶液中，質(zhì)譜基峰是m/z1 412.71，經(jīng)計算，確認(rèn)其為單鏈DNA離子([KS1-5H+]5-)的峰，示于圖1a；而當(dāng)NH4OAc濃度增加到25 mmol/L時，質(zhì)譜圖中的[KS1-5H+]5-離子峰消失，出現(xiàn)的是KS1鏈加合2個NH4+的復(fù)合物離子峰m/z1 418.41([KS1+2NH4+-7H+]5-)，示于圖1b。這說明，太低濃度的NH4OAc溶液不利于G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成，而高于25 mmol/L NH4OAc溶液便可誘導(dǎo)KS1序列形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)。為了進(jìn)一步確定NH4+結(jié)合的特異性，逐步增加NH4OAc溶液的濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在升高NH4OAc濃度時，ESI-MS譜圖中基峰的位置保持不變，即仍是G-四鏈體離子峰[KS1+2NH4+-7H+]5-，并未檢測到DNA加合多個NH4+的復(fù)合物離子峰?？梢?，DNA加合NH4+的數(shù)目與NH4OAc的濃度無關(guān)，這在一定程度上說明NH4+與DNA的相互結(jié)合作用并非一般的非特異性吸附，而是一種選擇性的特異性結(jié)合方式，即NH4+已經(jīng)嵌入到G-四分體平面層間，形成了穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu)。根據(jù)加合的NH4+個數(shù)可判斷，KS1鏈在NH4OAc溶液中形成了三層G-四鏈體結(jié)構(gòu)[14]。

圖1 5 μmol/L KS1在10 mmol/L(a)和25 mmol/L(b) NH4OAc溶液中(含25%CH3OH)的ESI-MS圖Fig.1 ESI-MS spectra of 5 μmol/L KS1 in solution of 10 mmol/L (a) and 25 mmol/L (b) NH4OAc with 25% CH3OH

采用CD光譜研究了不同陽離子對G-四鏈體結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)和影響。根據(jù)文獻(xiàn)報道[15]，當(dāng)富G序列形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)時，其溶液的CD光譜將會出現(xiàn)特征吸收峰。若CD譜圖中有260 nm的正吸收和240 nm的負(fù)吸收，說明形成的G-四鏈體為平行構(gòu)象；若CD譜圖中有290 nm的正吸收和260 nm的負(fù)吸收，則說明形成的G-四鏈體為反平行構(gòu)象[15]。2.5 μmol/L的KS1鏈在NH4OAc、KCl、NaCl溶液中的CD光譜圖示于圖2。由圖2可見，CD譜圖在260 nm和 240 nm處均出現(xiàn)明顯的正、負(fù)吸收峰，說明該陽離子可以促進(jìn)Kras啟動子G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成；圖中特征吸收峰的強度隨著陽離子濃度的升高而增大，這說明提高陽離子濃度有利于G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成。在NH4OAc溶液中，當(dāng)NH4+濃度從100 mmol/L增加到150 mmol/L時，CD吸收值的變化不太明顯，可見NH4OAc濃度在100 mmol/L時，溶液中2.5 μmol/L KS1轉(zhuǎn)化成G-四鏈體結(jié)構(gòu)的過程已基本達(dá)到平衡狀態(tài)。而在KCl溶液中，CD吸收值隨著陽離子濃度的增加而平穩(wěn)升高。在NaCl溶液中，當(dāng)NaCl 濃度在25～100 mmol/L范圍內(nèi)，CD吸收值緩慢增加；但當(dāng)NaCl濃度升高到100～150 mmol/L時，CD吸收值增加幅度變大，這可能是因為高含量Na+條件有利于促進(jìn)平衡向KS1形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)的方向移動，因此可檢測到更強的CD吸收峰。值得一提的是，在K+條件下，CD圖在290 nm 處有微弱的正吸收，而在Na+溶液中，290 nm處的正吸收峰消失，伴隨著的是240 nm處的負(fù)吸收增強，這說明K+可促進(jìn)KS1形成平行構(gòu)象為主的混合構(gòu)象G-四鏈體，而Na+則誘導(dǎo)KS1形成平行G-四鏈體結(jié)構(gòu)。

2.2 G堿基突變對G-四鏈體結(jié)構(gòu)的影響

突變體KS2序列是由KS1序列中從5’端數(shù)起的第6個G堿基突變成T堿基得到的。在ESI-MS實驗中，KS2序列質(zhì)譜圖的基峰是DNA結(jié)合2個NH4+形成的離子峰m/z1 413.45([KS2+2NH4+-7H+]5-)，示于圖3a，這表明，在NH4OAc溶液中，KS2序列形成的G-四鏈體仍是三層結(jié)構(gòu)。KS1序列中的第13個G堿基突變成T堿基后得到KS3鏈，KS3序列在質(zhì)譜圖中顯示的基峰是m/z1 410.52處的DNA加合1個NH4+形成的5電荷復(fù)合物離子峰([KS3+NH4+-6H+]5-)，示于圖3b，這說明KS3序列G-四鏈體大部分已轉(zhuǎn)變?yōu)閮蓪咏Y(jié)構(gòu)。KS1序列中第18、19個G堿基突變成T堿基得到KS4鏈，對于突變體KS4鏈，ESI-MS譜圖中的基峰是m/z1 408.97處的DNA加合了2個NH4+的離子峰([KS4+2NH4+-7H+]5-) ，示于圖3c，可見，這兩個堿基突變后，對KS1鏈G-四鏈體的層數(shù)影響并不明顯。將上述幾種位置的堿基同時突變，即第6、13、18、19位的G堿基均突變?yōu)門堿基后，得到的序列KS5在質(zhì)譜圖中的基峰是DNA加合1個NH4+的5電荷離子峰([KS5+NH4+-6H+]5-) ，示于圖3d。由于KS5序列比KS1序列更加規(guī)整，同時排除了KS1序列中非連續(xù)鳥嘌呤G參與G-四鏈體形成的可能，因此，ESI-MS結(jié)果符合實驗預(yù)想，未檢測到加合2個NH4+的復(fù)合物離子峰。綜合比較原生型KS1序列和幾種突變體KS2～KS5序列的質(zhì)譜現(xiàn)象，可以得出，不同位置的堿基突變對G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成影響各不相同，其中以第13位的G堿基突變對G-四鏈體結(jié)構(gòu)層數(shù)的影響最為明顯。

注：1—25 mmol/L；2—50 mmol/L；3—100 mmol/L；4—150 mmol/L圖2 2.5 μmol/L KS1鏈在NH4OAc(a)、KCl(b)、NaCl(c)溶液中的CD光譜圖Fig.2 CD spectra of 2.5 μmol/L KS1 in NH4OAc (a), KCl (b) and NaCl (c) solution

圖3 5 μmol/L KS2～KS5(a～d)鏈在25% CH3OH、50 mmol/L NH4OAc溶液中的ESI-MS圖Fig.3 ESI-MS spectra of 5 μmol/L KS2-KS5 (a-d) in solution of 25% CH3OH and 50 mmol/L NH4OAc

通過CD光譜研究比較了KS1～KS5序列G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成構(gòu)象特點，2.5 μmol/L KS1～KS5鏈在NH4OAc、KCl、NaCl溶液中的光譜圖示于圖4。從圖4可以看出：突變體KS2及KS3序列形成的G-四鏈體構(gòu)象與KS1相近，均是平行構(gòu)象為主的混合G-四鏈體結(jié)構(gòu)；不同的是這3個序列在CD吸收強度上存在差異，KS2在260 nm處的正吸收強度與KS1相近，吸收峰發(fā)生明顯下降的是KS3序列，這可能與ESI-MS譜圖分析中KS3序列所形成的G-四鏈體層數(shù)減少有關(guān)。

注：1—KS1；2—KS2；3—KS3；4—KS4；5—KS5；圖4 2.5 μmol/L KS1～KS5鏈在NH4OAc(a)、KCl(b)、NaCl(c)溶液中的CD光譜圖Fig.4 CD spectra of 2.5 μmol/L KS1-KS5 in solution of NH4OAc (a), KCl (b) and NaCl (c)

KS4和KS5序列在3種陽離子條件下的CD光譜與KS1序列明顯不同，特別是KS4序列，盡管ESI-MS實驗表明其在NH4OAc溶液中形成的是三層G-四鏈體結(jié)構(gòu)，但CD譜圖卻表明此G-四鏈體的構(gòu)象已發(fā)生了明顯變化，具體表現(xiàn)為260 nm處的正吸收消失，而在290 nm處的正吸收出現(xiàn)微弱的增強，這意味著KS4序列G-四鏈體已部分轉(zhuǎn)變?yōu)榉雌叫袠?gòu)象；而KS5序列在這3種陽離子條件下，CD光譜比KS4鏈在240 nm和290 nm處的正吸收均明顯增強，且在260 nm處出現(xiàn)明顯的負(fù)吸收，這種變化在KCl和NaCl溶液中也表現(xiàn)出一致的趨勢，可見，KS5序列形成的構(gòu)象相對于KS1序列更加偏向反平行G-四鏈體結(jié)構(gòu)。

圖5 KS1～KS5在30 mmol/L KCl、30 mmol/L tris-HCl溶液中的CD升溫歸一化圖Fig.5 Normalized CD melting of KS1-KS5 in solution of 30 mmol/L KCl and 30 mmol/L tris-HCl

采用CD升溫法對G-四鏈體的穩(wěn)定性進(jìn)行評估。將所有富G序列(KS1～KS5)分別溶解在30 mmol/L KCl和30 mmol/Ltris-HCl中，使DNA的最終濃度為2.5 μmol/L，將溶液靜置30 min后，于95 ℃ PCR儀中加熱5 min，然后以0.1 ℃/min降溫至4 ℃。隨后采用CD光譜固定波長程序升溫掃描，將得到的結(jié)果歸一化后用Origin作圖，即得吸收值隨溫度的變化關(guān)系圖，示于圖5。對S曲線進(jìn)行Boltzmann擬合，得到的X0值即為反映各序列穩(wěn)定性的Tm值，列于表2。由表2可見，KS1～KS3序列的Tm值比較接近，均在75 ℃左右，說明這些序列的G-四鏈體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差別不大；而KS4和KS5序列的Tm值相對于KS1序列均降低約15 ℃，可見其形成的G-四鏈體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性相對于原生型序列明顯降低，這可能是因為原有穩(wěn)定的平行構(gòu)象發(fā)生了解鏈，新的反平行構(gòu)象不夠穩(wěn)定。

表2 KS1～KS5序列的CD升溫Tm值Table 2 Tm values of KS1-KS5

綜合分析ESI-MS和CD的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Kras原生型序列KS1可以形成比較穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，突變位點不同對Kras序列G-四鏈體的影響各不相同。KS2序列所形成的G-四鏈體層數(shù)、構(gòu)象和穩(wěn)定性均與KS1序列差別不大，可見KS1序列第6位的G堿基對其G-四鏈體結(jié)構(gòu)貢獻(xiàn)不大；雖然KS3序列形成的G-四鏈體構(gòu)象、穩(wěn)定性與KS1序列差別不大，但其所形成的G-四鏈體層數(shù)與KS1明顯不同，說明第13位G堿基對KS1序列G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成有一定的貢獻(xiàn)，有可能動態(tài)參與了G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成；KS4和KS5序列相對于KS1序列所形成的G-四鏈體變化最明顯，不但構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榉雌叫?，且穩(wěn)定性也明顯降低，說明KS1序列第18、19位的G堿基參與了G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成。

Neidle等[17]發(fā)現(xiàn)，癌基因C-kit啟動子區(qū)序列d(AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG)在K+溶液中可以形成一種特殊結(jié)構(gòu)的G-四鏈體，示于圖6a，序列中并非處于G堿基連續(xù)序列位置的G10也參與了G-四分體平面的形成。本研究根據(jù)KS2～KS5序列堿基變化特點以及實驗規(guī)律，分析KS1序列可能形成了多種結(jié)構(gòu)共存的G-四鏈體，有一種可能是類似于C-kit序列的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，示于6b，序列中的G13、G18和G19均參與了G-四分體平面的形成。

3 結(jié)論

本工作利用ESI-MS和CD法驗證了Kras啟動子區(qū)序列KS1的G-四鏈體形成，結(jié)果表明，在陽離子條件下，KS1序列形成的是平行構(gòu)象為主的混合構(gòu)象G-四鏈體?；蛲蛔儗嶒灡砻鳎贙S1序列中，第6位G堿基幾乎未參與G-四分體平面的形成，而第13、18、19位的G堿基則很有可能參與G-四分體平面的形成，從而形成一種特殊的G-四鏈體結(jié)構(gòu)。整體看來，突變后的序列形成G-四鏈體的能力整體比原生型序列弱，這在一定程度上表明，生物體內(nèi)一部分基因突變后所導(dǎo)致的癌癥可能與G-四鏈體結(jié)構(gòu)的破壞有關(guān)。

圖6 C-kit序列(a)[17]和KS1序列(b)可能形成的G-四鏈體結(jié)構(gòu)圖Fig.6 NMR structure of C-kit G-quadruplex (a)[17] and possible structure of KS1 G-quadruplex (b)

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