賴穎+趙錦慧+楊同文+潘明君

摘要：以海藻酸鈉和聚乙烯醇作為包埋劑對(duì)發(fā)酵性結(jié)合酵母菌進(jìn)行固定化，采用單一變量法研究溶液的pH值、金屬離子初始濃度、菌體濃度、吸附時(shí)間、吸附溫度5種因素對(duì)固定化酵母菌吸附Pb2+和Zn2+離子的影響。結(jié)果表明，發(fā)酵性結(jié)合酵母菌對(duì)Pb2+、Zn2+吸附的最佳條件是：pH值4.0，金屬離子初始濃度0.25μg/mL，酵母菌濃度2.0g/L，吸附時(shí)間15min，吸附溫度30℃。發(fā)酵性結(jié)合酵母菌對(duì)Pb2+和Zn2+有較好的吸附能力，是良好的生物吸附劑。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵性結(jié)合酵母菌；吸附；重金屬；Pb2+；Zn2+

中圖分類號(hào)：X703文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0398-03

重金屬是造成水體污染的一類有毒物質(zhì)[1]。由于含重金屬的工業(yè)廢水的排放量不斷增加，這些廢水被排入水體和土壤中，會(huì)對(duì)環(huán)境和人類的健康造成極大的威脅，因此，必須處理后再進(jìn)行排放[2]。生物吸附法有利于解決這一難題，利用微生物吸附廢水中的重金屬在投資、運(yùn)行、操作管理和重金屬回收、水回用等方面優(yōu)越于傳統(tǒng)的治理方法[3]。目前，能夠作為生物吸附劑的微生物有細(xì)菌，真菌，藻類[4]，由于酵母菌廣泛應(yīng)用于食品飲料工業(yè)，廉價(jià)易得且安全，有利于生物吸附的工業(yè)化應(yīng)用[5]，所以酵母菌是生物吸附劑的首選。但有關(guān)發(fā)酵性結(jié)合酵母菌對(duì)重金屬吸收能力的研究未見報(bào)道。本試驗(yàn)以從宋河酒曲中篩選出來的發(fā)酵性結(jié)合酵母菌為試驗(yàn)菌種，研究固定化發(fā)酵性結(jié)合酵母菌對(duì)Pb2+、Zn2+離子吸附的最佳條件，為利用該吸附工業(yè)廢水中重金屬菌種的開發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種發(fā)酵性結(jié)合酵母菌菌種A27，周口師范學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2主要儀器

恒溫振蕩器HZQ-X300，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；型電熱鼓風(fēng)干燥箱101-1，北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品；電子天平AL204，梅特勒托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；pH值計(jì)EL20，梅特勒托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；系列生化培養(yǎng)箱THZ-98AB，昆山一恒儀器有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)JJ2010-04-108，蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；紫外可見分光光度計(jì)UV-5100，上海元析儀器有限公司。

1.1.3主要試劑硝酸鉛、氯化鋅、氯化鈣、硼酸、海藻酸鈉、聚乙烯醇（PVA）、雙硫腙、四氯化碳、硫代硫酸鈉、甲基紅、氨水、乙酸、四氯化碳、酚紅、三氯甲烷均為分析純。

1.1.4溶液的配制鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取0.2092g氯化鋅移入100mL的容量瓶，加水稀釋至刻度，每1mL相當(dāng)于1mgZn2+。

鋅標(biāo)準(zhǔn)使用液[6]：取1.0mL的鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液于100mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，每1mL溶液相當(dāng)于10μgZn2+。

鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取0.1598g硝酸鉛移入100mL的容量瓶，加水稀釋至刻度，每1mL相當(dāng)于1mgPb2+。

鉛標(biāo)準(zhǔn)使用液：取1.0mL的鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液于100mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，每1mL溶液相當(dāng)于10μgPb2+。

25%硫代硫酸鈉：稱取25g硫代硫酸鈉，溶解于100mL蒸餾水中。

0.1%甲基紅：稱取0.1g甲基紅，用60mL95%乙醇溶解，加蒸餾水定容至100mL。

乙酸溶液：取10mL冰乙酸溶于70mL蒸餾水中。

0.1%雙硫腙四氯化碳溶液：稱取0.10g雙硫腙，用四氯化碳溶解至100mL，倒入棕色瓶，置于冰箱中保存。臨用前，吸取適量雙硫腙四氯化碳溶液，加四氯化碳稀釋30倍，即可使用。

雙硫腙三氯甲烷溶液：稱取100mg雙硫腙，溶于1000mL三氯甲烷中，此溶液每1mL含100μg雙硫腙，保存于冰箱備用。臨用前取適量上述雙硫腙三氯甲烷溶液，置50mL容量瓶中，用三氯甲烷稀釋定容。

0.1%酚紅指示劑：取酚紅0.1g，加入氫氧化鈉溶液2.82mL使其溶解，再加入蒸餾水至100mL。

乙酸-乙酸鈉緩沖溶液：稱取68g乙酸鈉，用蒸餾水溶解至250mL。冰乙酸取31mL，加蒸餾水至250mL，以上二者混合。

1.1.5培養(yǎng)基

馬鈴薯培養(yǎng)基[7]：將馬鈴薯洗凈去皮，切塊，稱取600g于干凈的大燒杯中，加入1000mL蒸餾水煮30min，經(jīng)8～12層紗布過濾，取馬鈴薯過濾液，加入60g葡萄糖，溶解后用蒸餾水稀釋至1200mL，分裝于250mL三角瓶中，在121℃條件下滅菌20min，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1酵母菌干粉的制備

在無(wú)菌操作臺(tái)中，挑取3環(huán)平板培養(yǎng)基中的發(fā)酵性結(jié)合酵母菌A10，接種到滅菌的馬鈴薯培養(yǎng)基中，在振蕩培養(yǎng)箱中溫度為28℃、轉(zhuǎn)速為150r/min條件下振蕩培養(yǎng)24h。將該培養(yǎng)液作為種子液，放入冰箱保存，備用。在無(wú)菌操作臺(tái)中，移取種子液15mL，加入到已滅菌的馬鈴薯培養(yǎng)基中，在溫度為28℃、轉(zhuǎn)速為150r/min的條件下，在振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)20h。將培養(yǎng)液在離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速為4000r/min離心5min，收集菌體，在鼓風(fēng)干燥箱中以50℃下烘干，用研缽研磨成粉末狀，干燥保存。

1.2.2酵母菌的固定化方法

海藻酸鈉-聚乙烯醇包埋法：稱取1g海藻酸鈉和2g聚乙烯醇于干凈無(wú)菌的小燒杯中，加入少許的蒸餾水，調(diào)成糊狀，再加水至20mL，將小燒杯在電爐上加熱溶解，然后冷卻至室溫，再加入一定量的酵母菌干粉混合均勻，用20mL醫(yī)用注射器吸取混合物，以恒定的速度滴到4%的氯化鈣飽和硼酸溶液中，浸泡約4h后，將固定化的酵母菌小球移入三角瓶中，用無(wú)菌去離子水洗滌4次后，加入已配制好的溶液中[8]。

1.2.3金屬離子濃度的測(cè)定endprint

鉛測(cè)定方法[9]：取待測(cè)溶液1mL于60mL的分液漏斗中，各加蒸餾水稀釋至10mL。各加2滴酚紅指示劑，用1∶1氨水調(diào)至紅色，加10mL雙硫腙三氯甲烷溶液，振蕩，靜置分層后將三氯甲烷層經(jīng)脫脂棉濾入1cm比色杯中，以三氯甲烷調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于波長(zhǎng)510nm處測(cè)得吸光度。

鋅測(cè)定方法[10]：取1mL待測(cè)溶液置于60mL分液漏斗中，各加蒸餾水稀釋至10mL，滴加甲基紅，搖勻，用1∶1氨水調(diào)至剛顯黃色，再滴加乙酸至紅色，再向分液漏斗中加5mL四氯化碳，振搖萃取甲基紅，棄去下層的有機(jī)相。向各分液漏斗中加入5mL乙酸鈉緩沖溶液及l(fā)mL硫代硫酸鈉溶液，混勻后再加10mL雙硫腙四氯化碳溶液，振搖4min，靜置分層后，將四氯化碳層通過少許潔凈脫脂棉過濾入比色皿中，在535nm的最大吸光波長(zhǎng)處測(cè)量溶液的吸光度。

1.2.4Pb2+、Zn2+的吸附

將固定化小球分別加入需要進(jìn)行吸附的Pb2+和Zn2+溶液中，用1mol/LHCl和1mol/LNaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值[11]，于室溫下吸附一定的時(shí)間，然后取上清液，用雙硫腙可見分光光度法測(cè)定上清液中的Pb2+和Zn2+的濃度，計(jì)算吸附率：

吸附率=吸附量/總量×100%=（總量-吸附后的量）/總量×100%。

1.2.5pH值對(duì)吸附率的影響

分別取Pb2+、Zn2+離子溶液100mL，濃度均為0.30μg/mL（分別取3.0mL鋅標(biāo)準(zhǔn)使用液和鉛標(biāo)準(zhǔn)使用液于容量瓶中，加蒸餾水定容到100mL），用1mol/LHCl和1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，再分別加入菌體濃度為1.0g/L的固定化酵母菌小球，室溫下吸附20min，取上清液，用可見分光光度計(jì)測(cè)吸光度，計(jì)算吸附率[12]。

1.2.6金屬離子初始濃度對(duì)吸附率的影響

將固定化酵母菌置于不同濃度的Pb2+、Zn2+離子溶液中。其中，Pb2+、Zn2+離子濃度各自分別為0.1，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35μg/mL。調(diào)節(jié)pH值為4.0，各加入菌體濃度為1.0g/L固定化酵母菌小球，室溫下吸附20min，取上清液，用可見分光光度計(jì)測(cè)吸光度，計(jì)算吸附率。

1.2.7菌體濃度對(duì)吸附率的影響

Pb2+、Zn2+離子初始濃度均為0.25μg/mL溶液（分別取2.5mL鋅標(biāo)準(zhǔn)使用液和鉛標(biāo)準(zhǔn)使用液于容量瓶中，加蒸餾水定容到100mL），pH值為4.0，菌體濃度分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0g/L，室溫下，吸附20min，吸附后取上清液，用可見分光光度法測(cè)吸光度，計(jì)算吸附率。

1.2.8吸附時(shí)間對(duì)吸附率的影響

取Pb2+、Zn2+離子初始濃度均為0.25μg/mL溶液（分別取2.5mL鋅標(biāo)準(zhǔn)使用液和鉛標(biāo)準(zhǔn)使用液于容量瓶中，加蒸餾水定容到100mL），pH值為4.0，加入菌體濃度2.0g/L固定化酵母菌小球，在室溫下，分別吸附5、10、15、20、30、40min，取上清液用可見分光光度計(jì)測(cè)吸光度，計(jì)算吸附率。

1.2.9溫度對(duì)吸附率的影響

取Pb2+、Zn2+離子初始濃度均為0.25μg/mL溶液（分別取2.5mL鋅標(biāo)準(zhǔn)使用液和鉛標(biāo)準(zhǔn)使用液于容量瓶中，加蒸餾水定容到100mL），pH值為4.0，加入菌體濃度2.0g/L固定化酵母菌小球，分別在20、25、30、35、40、45℃下吸附15min，吸附后取上清液，用可見分光光度法測(cè)吸光度，計(jì)算吸附率。

2結(jié)果與分析

2.1pH值對(duì)發(fā)酵性結(jié)合酵母菌吸附重金屬能力的影響

由圖1可知，在pH值3.0～5.5，固定化酵母菌對(duì)Pb2+、Zn2+的吸附率都超過了80%。隨著溶液pH值增大，吸附率呈先升高后降低的趨勢(shì)。固定化酵母菌對(duì)Pb2+的吸附：當(dāng)pH值<4.0時(shí)，固定化酵母菌對(duì)Pb2+的吸附率隨pH值升高而升高，當(dāng)pH值為4.0時(shí)，達(dá)到最大吸附率（86.5%），當(dāng)pH值大于4.0時(shí)，固定化酵母菌的吸附率隨pH值的升高而降低；固定化酵母菌對(duì)Zn2+的吸附：當(dāng)pH值從3.0升至5.5時(shí)，固定化酵母菌對(duì)Zn2+的吸附率隨pH值增大而先增大后減小，在pH值為4.0時(shí)，吸附率達(dá)到最大（85.7%）。其原因有可能是pH值低時(shí)，細(xì)胞表面基團(tuán)被H3O+占據(jù)，阻礙了金屬離子對(duì)細(xì)胞的靠近和活性基團(tuán)的解離，致使吸附率低；在高pH值條件下，H+濃度降低，使細(xì)胞表面暴露更多的吸附位點(diǎn)，但重金屬離子會(huì)以不溶解的氧化物、氫氧化物微粒的形式存在，從而使吸附過程無(wú)法進(jìn)行。由此可見，酵母菌對(duì)重金屬離子吸附的最佳pH值為4.0。

2.2重金屬離子初始濃度對(duì)發(fā)酵性結(jié)合酵母菌吸附性能的影響

由圖2看出，當(dāng)菌體濃度一定時(shí)，固定化酵母菌對(duì)重金屬離子的吸附率總體上是隨著初始濃度的升高呈先升高后降低的趨勢(shì)，其原因有可能是當(dāng)重金屬離子達(dá)到一定濃度時(shí)，菌體上的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)已被飽和，固定化酵母菌對(duì)金屬離子的吸附量就不再增加，同時(shí)當(dāng)重金屬離子達(dá)到一定濃度時(shí)，重金屬對(duì)酵母菌有毒害作用。

Pb2+的初始濃度在0.10～0.25μg/mL時(shí)吸附率隨著濃度的升高而升高，當(dāng)初始濃度大于0.25μg/mL時(shí)，吸附率緩慢降低；但Zn2+初始濃度由0.1μg/mL增加到0.25μg/mL時(shí)，酵母菌對(duì)Zn2+的吸附率變化不大，當(dāng)初始濃度大于0.25μg/mL時(shí)，吸附率降低幅度較大。

2.3菌體濃度對(duì)發(fā)酵性結(jié)合酵母菌吸附性能的影響

在重金屬離子初始濃度一定的條件下，隨著菌體濃度的增加，酵母菌對(duì)重金屬離子Pb2+、Zn2+的吸附率先增大然后減小，當(dāng)菌體濃度為2.0g/L時(shí)吸附率最大（圖3）。其原因可能是在一定范圍內(nèi)增加生物量，可以使吸附位點(diǎn)增加，從而使吸附率增加；當(dāng)生物量超過一定值時(shí)，導(dǎo)致了吸附位點(diǎn)間的相互作用，從而減少了一部分有效的吸附位點(diǎn)。endprint

2.4時(shí)間對(duì)發(fā)酵性結(jié)合酵母菌吸附性能的影響

結(jié)果（圖4）表明，隨著吸附時(shí)間的增加，酵母菌菌體對(duì)Zn2+、Pb2+離子的吸附率逐漸增加，當(dāng)吸附時(shí)間大于15min時(shí)，菌體對(duì)重金屬離子的吸附率趨于穩(wěn)定。這可能因?yàn)殡S著時(shí)間的增加，菌體上的重金屬離子吸附位點(diǎn)逐漸飽和。

2.5溫度對(duì)發(fā)酵性結(jié)合酵母菌吸附性能的影響

結(jié)果（圖5）表明，隨著溫度的升高，固定化酵母菌對(duì)Pb2+的吸附率并無(wú)明顯規(guī)律，但當(dāng)溫度在30℃左右時(shí)，固定化酵母菌對(duì)Pb2+的吸附效果比較好，而固定化酵母菌對(duì)Zn2+的吸附率在20～30℃時(shí)隨著溫度的升高而上升。這是由于生物吸附Zn2+的過程是個(gè)放熱的過程。

3結(jié)論

以海藻酸鈉和聚乙烯醇作為包埋劑固定化的發(fā)酵性結(jié)合酵母菌A27對(duì)Pb2+和Zn2+重金屬離子具有較強(qiáng)的吸附能力。在相同的條件下，固定化發(fā)酵性結(jié)合酵母菌A27對(duì)Zn2+的吸附率比對(duì)Pb2+的吸附率大。發(fā)酵性結(jié)合酵母菌對(duì)Pb2+和Zn2+重金屬離子的吸附率受溶液pH值、菌體濃度和重金屬離子的初始濃度這3個(gè)因素影響較大。本試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵性結(jié)合酵母菌對(duì)重金屬的最佳吸附條件是：pH值4.0，Pb2+、Zn2+離子的初始濃度均為0.25μg/mL，酵母菌濃度2.0g/L，吸附時(shí)間15min，吸附溫度30℃。

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2.4時(shí)間對(duì)發(fā)酵性結(jié)合酵母菌吸附性能的影響

結(jié)果（圖4）表明，隨著吸附時(shí)間的增加，酵母菌菌體對(duì)Zn2+、Pb2+離子的吸附率逐漸增加，當(dāng)吸附時(shí)間大于15min時(shí)，菌體對(duì)重金屬離子的吸附率趨于穩(wěn)定。這可能因?yàn)殡S著時(shí)間的增加，菌體上的重金屬離子吸附位點(diǎn)逐漸飽和。

2.5溫度對(duì)發(fā)酵性結(jié)合酵母菌吸附性能的影響

結(jié)果（圖5）表明，隨著溫度的升高，固定化酵母菌對(duì)Pb2+的吸附率并無(wú)明顯規(guī)律，但當(dāng)溫度在30℃左右時(shí)，固定化酵母菌對(duì)Pb2+的吸附效果比較好，而固定化酵母菌對(duì)Zn2+的吸附率在20～30℃時(shí)隨著溫度的升高而上升。這是由于生物吸附Zn2+的過程是個(gè)放熱的過程。

3結(jié)論

以海藻酸鈉和聚乙烯醇作為包埋劑固定化的發(fā)酵性結(jié)合酵母菌A27對(duì)Pb2+和Zn2+重金屬離子具有較強(qiáng)的吸附能力。在相同的條件下，固定化發(fā)酵性結(jié)合酵母菌A27對(duì)Zn2+的吸附率比對(duì)Pb2+的吸附率大。發(fā)酵性結(jié)合酵母菌對(duì)Pb2+和Zn2+重金屬離子的吸附率受溶液pH值、菌體濃度和重金屬離子的初始濃度這3個(gè)因素影響較大。本試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵性結(jié)合酵母菌對(duì)重金屬的最佳吸附條件是：pH值4.0，Pb2+、Zn2+離子的初始濃度均為0.25μg/mL，酵母菌濃度2.0g/L，吸附時(shí)間15min，吸附溫度30℃。

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2.4時(shí)間對(duì)發(fā)酵性結(jié)合酵母菌吸附性能的影響

結(jié)果（圖4）表明，隨著吸附時(shí)間的增加，酵母菌菌體對(duì)Zn2+、Pb2+離子的吸附率逐漸增加，當(dāng)吸附時(shí)間大于15min時(shí)，菌體對(duì)重金屬離子的吸附率趨于穩(wěn)定。這可能因?yàn)殡S著時(shí)間的增加，菌體上的重金屬離子吸附位點(diǎn)逐漸飽和。

2.5溫度對(duì)發(fā)酵性結(jié)合酵母菌吸附性能的影響

結(jié)果（圖5）表明，隨著溫度的升高，固定化酵母菌對(duì)Pb2+的吸附率并無(wú)明顯規(guī)律，但當(dāng)溫度在30℃左右時(shí)，固定化酵母菌對(duì)Pb2+的吸附效果比較好，而固定化酵母菌對(duì)Zn2+的吸附率在20～30℃時(shí)隨著溫度的升高而上升。這是由于生物吸附Zn2+的過程是個(gè)放熱的過程。

3結(jié)論

以海藻酸鈉和聚乙烯醇作為包埋劑固定化的發(fā)酵性結(jié)合酵母菌A27對(duì)Pb2+和Zn2+重金屬離子具有較強(qiáng)的吸附能力。在相同的條件下，固定化發(fā)酵性結(jié)合酵母菌A27對(duì)Zn2+的吸附率比對(duì)Pb2+的吸附率大。發(fā)酵性結(jié)合酵母菌對(duì)Pb2+和Zn2+重金屬離子的吸附率受溶液pH值、菌體濃度和重金屬離子的初始濃度這3個(gè)因素影響較大。本試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵性結(jié)合酵母菌對(duì)重金屬的最佳吸附條件是：pH值4.0，Pb2+、Zn2+離子的初始濃度均為0.25μg/mL，酵母菌濃度2.0g/L，吸附時(shí)間15min，吸附溫度30℃。

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