鄒曉威+王娜+劉芬+夏蕾+王艷麗+洪澤源+徐沖力+鄭巖

摘要：提取玉米絲黑穗病與黑粉病發(fā)病葉片的RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，通過玉米抗病相關(guān)基因（登錄號分別為：AI881638、AW424529、CF028241、CO526016、CK371597、BM379188、AI649523、CF349132、BM074921、BM349111）的序列設(shè)計引物，對玉米抗病相關(guān)基因進行RT-PCR擴增，分析目標基因的表達差異。結(jié)果顯示，抗病基因病程相關(guān)蛋白（BM379188）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酸（AW424529）、無毒性蛋白（AI881638）、富含亮氨酸重復區(qū)域蛋白激酶（CF028241）在2種病害發(fā)生過程中均呈現(xiàn)上調(diào)表達，其他選取基因在侵染玉米葉片中均未檢測到其表達，所選取的抗病相關(guān)基因在對照玉米葉片中均未檢測到其表達。

關(guān)鍵詞：玉米；玉米絲黑穗病菌；玉米黑粉病菌；抗病基因；互作機制；基因表達

中圖分類號：Q786；S435.131.4文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0150-03

玉米絲黑穗病（Sphacelothecareiliana）和玉米黑粉?。║stilagomaydis）是2種經(jīng)常發(fā)生的玉米真菌性病害，傳統(tǒng)防治方法主要以種子包衣為主，但該方法會造成農(nóng)民生產(chǎn)成本提高，并對環(huán)境產(chǎn)生不良影響，選育和推廣抗病品種是控制玉米絲黑穗病與玉米黑粉病發(fā)生的有效措施[1]，因此有必要針對病原菌的侵染擴散機理對玉米抗病基因進行深入的研究。玉米絲黑穗病及玉米黑粉病的病原菌都屬于黑粉菌科，其親緣關(guān)系較近，在同一寄主上前者是系統(tǒng)性病害，后者是局部性病害。寄主植物在與病原菌互作的過程中，誘導表達的基因往往抑制或促進病原菌繁殖，這些基因的表達產(chǎn)物有直接攻擊病原菌的病程相關(guān)蛋白，如病程相關(guān)蛋白、幾丁質(zhì)酶[2-4]；有參與調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，如WRKY蛋白[5-6]；同時存在信號級聯(lián)放大的蛋白激酶，如絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶等[7-9]。本研究根據(jù)前人研究結(jié)果[10]，選取部分玉米抗病相關(guān)基因，分析其在玉米絲黑穗病菌及玉米黑粉病菌侵染過程中的表達變化，為進一步明確寄主植物玉米與2種病原菌互作過程中的抑制或促進病菌繁殖的機制及抗病育種提供新思路。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗所用的玉米絲黑穗病菌SR1、SR2菌株及玉米黑粉病菌SG200菌株均為玉米與真菌互作實驗室保存菌種。供試玉米品種為吉單209。

1.2試驗方法

1.2.1接種菌液的制備從凍存管內(nèi)取SR1、SR2菌株菌液至3mL的酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeastextractpeptonedextrosemedium，YPD），以及SG200菌株菌液至3mL的YEPS培養(yǎng)基內(nèi)，28℃振蕩培養(yǎng)進行菌株活化，再分別從活化的菌液內(nèi)取500μL菌液至100mLYPD、YEPS培養(yǎng)基內(nèi)，28℃振蕩培養(yǎng)12～16h，至菌液的D600nm值達到2.0。菌液離心后收集菌體，加適量滅菌純水溶解，SR1、SR2菌液進行混合后與SG200菌株菌液置于常溫下，用于下一步的接種試驗。

1.2.2玉米植株的準備挑選玉米品種吉單209的飽滿種子，用5%次氯酸鈉溶液表面消毒3～5min后，用無菌水沖洗3次，28℃下放置在無菌水中侵泡5h；濾紙經(jīng)過無菌純水浸泡后平鋪于無菌培養(yǎng)皿底部，將浸泡后的玉米種子轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中的濾紙上，然后將培養(yǎng)皿放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)，在28℃條件下進行暗培養(yǎng)直至種子出芽；將出芽的種子播種于15cm塑料花盆中，每盆5粒。播種后的花盆放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)，在28℃條件下進行培養(yǎng)。

1.2.3玉米植株的病菌侵染種子出土的2張葉片完全展開時，使用“1.2.1”節(jié)方法制備的玉米絲黑穗病菌菌液對玉米植株進行注射接種；待種子出土的3張葉完全展開，進行玉米黑粉病菌注射接種；預留未接種玉米植株作為對照。注射接種玉米絲黑穗病菌2～3d后，玉米葉片會出現(xiàn)明顯的褪綠病斑，取發(fā)病葉片于液氮中進行速凍后，置于-80℃冰箱中備用；注射接種玉米黑粉病菌3～5d后，玉米葉片出現(xiàn)明顯腫瘤，切取腫瘤組織于液氮中進行速凍后，置于-80℃冰箱中備用。同時割取對照植株葉片于液氮中進行速凍，置于-80℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.4玉米發(fā)病葉片RNA提取分別取保存于-80℃冰箱內(nèi)的發(fā)病葉片提取葉片組織中的RNA，操作方法如下：（1）收集1g發(fā)病玉米葉片在液氮中冷凍（冷凍后可放入-80℃冰箱長期保存）；（2）將葉片放入研缽中，加液氮后進行快速研磨2～3次，至葉片組織成粉末狀；（3）收集粉末，放入30mL離心管中，加10mLTrizol后渦旋混勻；（4）室溫下放置15min，再加入2mL氯仿，渦旋10s混勻；（5）室溫下放置3min后，于4℃、3500r/min離心15min；（6）收集上清液轉(zhuǎn)入到新離心管中，加入等體積的酚氯仿（苯酚和氯仿體積比為1∶1，pH值為8.0），渦旋10s混勻后，于4℃、3500r/min離心10min；（7）收集上清液轉(zhuǎn)入新離心管中，加入5mL的異丙醇，上下顛倒混勻，冰上靜置10min后，于4℃、9000r/min離心20min；（8）去除上清液后，加80μLRNAfreeH2O，放入-80℃冰箱保存待用。

1.2.5RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA首先用DNaseI、RNase-free酶消解RNA中的DNA，制備不含DNA的RNA。操作方法見使用說明書；然后選用全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行RNA反轉(zhuǎn)錄，形成cDNA；運用Nanodrop2000微量紫外分光光度計測定cDNA的濃度，將所有cDNA調(diào)至相同濃度。

1.2.6RT-PCR選取的抗病相關(guān)基因的登錄號分別為AI881638、AW424529、CF028241、CO526016、CK371597、BM379188、AI649523、CF349132、BM074921、BM349111、Actin（gi121211756）（表1），以基因登錄號代表相關(guān)基因。根據(jù)抗病相關(guān)基因片段設(shè)計上下游引物（表2）。

分別以玉米絲黑穗病發(fā)病植株葉片組織中的cDNA、玉米黑粉病發(fā)病植株葉片腫瘤中的cDNA、未發(fā)病對照植株葉片組織中的cDNA為模板，對目標基因進行RT-PCR擴增。采用梯度PCR設(shè)置不同的退火溫度，RT-PCR擴增條件為：95℃預變性5min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃10min。內(nèi)參對照為Actin基因。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測抗病基因的信號強度。

2結(jié)果與分析

2.1RNA檢測

樣品總RNA檢測結(jié)果表明，感染玉米絲黑穗病菌發(fā)病葉

片的RNA濃度為10525.3ng/μL，感染玉米黑粉病菌發(fā)病葉片的RNA濃度為9623.4ng/μL，純度均較高。利用電泳檢測RNA的完整性和質(zhì)量，結(jié)果顯示沒有明顯的拖尾現(xiàn)象（圖1），說明提取的RNA質(zhì)量較好，沒有發(fā)生降解，可以用于后續(xù)試驗。

2.2RT-PCR擴增檢測

RT-PCR擴增結(jié)果顯示，內(nèi)參在對照植株葉片及發(fā)病植株葉片中均能正常表達，結(jié)果可信。所選取的抗病相關(guān)基因在對照植株葉片中均未見表達，玉米絲黑穗病菌及玉米黑粉病菌發(fā)病葉片中抗病相關(guān)基因AI881638、AW424529、CF028241、BM379188均呈上調(diào)表達。而選取的其他抗病相關(guān)基因CO526016、CK371597、AI649523、CF349132、BM074921、BM349111在感染玉米絲黑穗病菌及玉米黑粉病菌發(fā)病葉片中均未見表達（圖2）。

3結(jié)論與討論

寄主植物與病原菌互作過程往往誘導許多基因的表達，其中包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、蛋白激酶及病程相關(guān)蛋白等[11]，這些基因的表達往往抑制或促進病原菌的繁殖。本研究結(jié)果顯示，玉米感病品種吉單209在受到玉米絲黑穗病菌及玉米黑粉病菌侵染后，病程相關(guān)蛋白BM379188（PR1）、AI881638（avirulence-responsiveprotein）均上調(diào)表達，其中病程相關(guān)蛋白是植物防衛(wèi)反應中的重要因子，在植物中廣泛存在，PR1與無毒性病菌誘導蛋白在植物系統(tǒng)獲得抗性中起到重要的作用，它們是植物受病原侵染或其他因子脅迫產(chǎn)生的誘導性蛋白，在抑制病原菌的繁殖過程中發(fā)揮作用[12-14]?；駽F028241、AW424529均上調(diào)表達，蛋白激酶通過氧化磷酸開啟信號的級聯(lián)放大作用，因此蛋白激酶結(jié)構(gòu)的蛋白在2種病菌互作的過程中起到重要的作用；而絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)在許多已經(jīng)克隆的抗病蛋白中存在，可能在抑制2種病菌繁殖的過程中發(fā)揮作用[7-9]。本試驗中選取的幾丁質(zhì)酶基因在接種與未接種玉米絲黑穗病病菌及黑粉病病菌的葉片中均未表達，說明該幾丁質(zhì)酶并未參與抑制2種病菌在玉米體內(nèi)的繁殖。研究中未檢測到WRKY蛋白的表達，說明WRKY蛋白并未參與促進2種病菌在玉米體內(nèi)的繁殖。試驗結(jié)果顯示玉米與玉米絲黑穗菌及玉米黑粉菌的互作機制有相似之處，誘導表達的基因抑制或促進菌絲生長的機制相近。

參考文獻：

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[9]MartinGB，BrommonschenkelSH，ChunwongseJ，etal.Map-basedcloningofaproteinkinasegeneconferringdiseaseresistanceintomato[J].Science，1993，262（5138）：1432-1436.

[10]袁廣勝.玉米抗穗粒腐病差異表達基因的分離及其功能分析[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學，2011：1-147.

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[14]HwangIS，ChoiDS，KimNH，etal.Pathogenesis-relatedprotein4binteractswithleucine-richrepeatprotein1tosuppressPR4b-triggeredcelldeathanddefenseresponseinpepper[J].ThePlantJournal，2014，77（4）：521-533.

[15]GabrilsSH，VossenJH，EkengrenSK，etal.AnNB-LRRproteinrequiredforHRsignallingmediatedbybothextra-andintracellularresistanceproteins[J].ThePlantJournal，2007，50（1）：14-28.

分別以玉米絲黑穗病發(fā)病植株葉片組織中的cDNA、玉米黑粉病發(fā)病植株葉片腫瘤中的cDNA、未發(fā)病對照植株葉片組織中的cDNA為模板，對目標基因進行RT-PCR擴增。采用梯度PCR設(shè)置不同的退火溫度，RT-PCR擴增條件為：95℃預變性5min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃10min。內(nèi)參對照為Actin基因。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測抗病基因的信號強度。

2結(jié)果與分析

2.1RNA檢測

樣品總RNA檢測結(jié)果表明，感染玉米絲黑穗病菌發(fā)病葉

片的RNA濃度為10525.3ng/μL，感染玉米黑粉病菌發(fā)病葉片的RNA濃度為9623.4ng/μL，純度均較高。利用電泳檢測RNA的完整性和質(zhì)量，結(jié)果顯示沒有明顯的拖尾現(xiàn)象（圖1），說明提取的RNA質(zhì)量較好，沒有發(fā)生降解，可以用于后續(xù)試驗。

2.2RT-PCR擴增檢測

RT-PCR擴增結(jié)果顯示，內(nèi)參在對照植株葉片及發(fā)病植株葉片中均能正常表達，結(jié)果可信。所選取的抗病相關(guān)基因在對照植株葉片中均未見表達，玉米絲黑穗病菌及玉米黑粉病菌發(fā)病葉片中抗病相關(guān)基因AI881638、AW424529、CF028241、BM379188均呈上調(diào)表達。而選取的其他抗病相關(guān)基因CO526016、CK371597、AI649523、CF349132、BM074921、BM349111在感染玉米絲黑穗病菌及玉米黑粉病菌發(fā)病葉片中均未見表達（圖2）。

3結(jié)論與討論

寄主植物與病原菌互作過程往往誘導許多基因的表達，其中包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、蛋白激酶及病程相關(guān)蛋白等[11]，這些基因的表達往往抑制或促進病原菌的繁殖。本研究結(jié)果顯示，玉米感病品種吉單209在受到玉米絲黑穗病菌及玉米黑粉病菌侵染后，病程相關(guān)蛋白BM379188（PR1）、AI881638（avirulence-responsiveprotein）均上調(diào)表達，其中病程相關(guān)蛋白是植物防衛(wèi)反應中的重要因子，在植物中廣泛存在，PR1與無毒性病菌誘導蛋白在植物系統(tǒng)獲得抗性中起到重要的作用，它們是植物受病原侵染或其他因子脅迫產(chǎn)生的誘導性蛋白，在抑制病原菌的繁殖過程中發(fā)揮作用[12-14]。基因CF028241、AW424529均上調(diào)表達，蛋白激酶通過氧化磷酸開啟信號的級聯(lián)放大作用，因此蛋白激酶結(jié)構(gòu)的蛋白在2種病菌互作的過程中起到重要的作用；而絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)在許多已經(jīng)克隆的抗病蛋白中存在，可能在抑制2種病菌繁殖的過程中發(fā)揮作用[7-9]。本試驗中選取的幾丁質(zhì)酶基因在接種與未接種玉米絲黑穗病病菌及黑粉病病菌的葉片中均未表達，說明該幾丁質(zhì)酶并未參與抑制2種病菌在玉米體內(nèi)的繁殖。研究中未檢測到WRKY蛋白的表達，說明WRKY蛋白并未參與促進2種病菌在玉米體內(nèi)的繁殖。試驗結(jié)果顯示玉米與玉米絲黑穗菌及玉米黑粉菌的互作機制有相似之處，誘導表達的基因抑制或促進菌絲生長的機制相近。

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[15]GabrilsSH，VossenJH，EkengrenSK，etal.AnNB-LRRproteinrequiredforHRsignallingmediatedbybothextra-andintracellularresistanceproteins[J].ThePlantJournal，2007，50（1）：14-28.

分別以玉米絲黑穗病發(fā)病植株葉片組織中的cDNA、玉米黑粉病發(fā)病植株葉片腫瘤中的cDNA、未發(fā)病對照植株葉片組織中的cDNA為模板，對目標基因進行RT-PCR擴增。采用梯度PCR設(shè)置不同的退火溫度，RT-PCR擴增條件為：95℃預變性5min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃10min。內(nèi)參對照為Actin基因。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測抗病基因的信號強度。

2結(jié)果與分析

2.1RNA檢測

樣品總RNA檢測結(jié)果表明，感染玉米絲黑穗病菌發(fā)病葉

片的RNA濃度為10525.3ng/μL，感染玉米黑粉病菌發(fā)病葉片的RNA濃度為9623.4ng/μL，純度均較高。利用電泳檢測RNA的完整性和質(zhì)量，結(jié)果顯示沒有明顯的拖尾現(xiàn)象（圖1），說明提取的RNA質(zhì)量較好，沒有發(fā)生降解，可以用于后續(xù)試驗。

2.2RT-PCR擴增檢測

RT-PCR擴增結(jié)果顯示，內(nèi)參在對照植株葉片及發(fā)病植株葉片中均能正常表達，結(jié)果可信。所選取的抗病相關(guān)基因在對照植株葉片中均未見表達，玉米絲黑穗病菌及玉米黑粉病菌發(fā)病葉片中抗病相關(guān)基因AI881638、AW424529、CF028241、BM379188均呈上調(diào)表達。而選取的其他抗病相關(guān)基因CO526016、CK371597、AI649523、CF349132、BM074921、BM349111在感染玉米絲黑穗病菌及玉米黑粉病菌發(fā)病葉片中均未見表達（圖2）。

3結(jié)論與討論

寄主植物與病原菌互作過程往往誘導許多基因的表達，其中包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、蛋白激酶及病程相關(guān)蛋白等[11]，這些基因的表達往往抑制或促進病原菌的繁殖。本研究結(jié)果顯示，玉米感病品種吉單209在受到玉米絲黑穗病菌及玉米黑粉病菌侵染后，病程相關(guān)蛋白BM379188（PR1）、AI881638（avirulence-responsiveprotein）均上調(diào)表達，其中病程相關(guān)蛋白是植物防衛(wèi)反應中的重要因子，在植物中廣泛存在，PR1與無毒性病菌誘導蛋白在植物系統(tǒng)獲得抗性中起到重要的作用，它們是植物受病原侵染或其他因子脅迫產(chǎn)生的誘導性蛋白，在抑制病原菌的繁殖過程中發(fā)揮作用[12-14]?；駽F028241、AW424529均上調(diào)表達，蛋白激酶通過氧化磷酸開啟信號的級聯(lián)放大作用，因此蛋白激酶結(jié)構(gòu)的蛋白在2種病菌互作的過程中起到重要的作用；而絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)在許多已經(jīng)克隆的抗病蛋白中存在，可能在抑制2種病菌繁殖的過程中發(fā)揮作用[7-9]。本試驗中選取的幾丁質(zhì)酶基因在接種與未接種玉米絲黑穗病病菌及黑粉病病菌的葉片中均未表達，說明該幾丁質(zhì)酶并未參與抑制2種病菌在玉米體內(nèi)的繁殖。研究中未檢測到WRKY蛋白的表達，說明WRKY蛋白并未參與促進2種病菌在玉米體內(nèi)的繁殖。試驗結(jié)果顯示玉米與玉米絲黑穗菌及玉米黑粉菌的互作機制有相似之處，誘導表達的基因抑制或促進菌絲生長的機制相近。

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