丑佳文 趙立宏 董 佳 王希勤

(南華大學電氣工程學院,湖南 衡陽 421001)

金標免疫層析測定是一種快速診斷技術，是利用抗原、抗體特異性規(guī)律和膠體金顯色原理工作的[1]。因其具有簡單、快速、可靠及價格低廉等優(yōu)點，廣泛應用于臨床診斷、食品安全檢測及環(huán)境檢測等領域。但在其應用過程中也暴露出了一些不足，如待測樣品抗原與試條測試線上抗體的特異性結合和膠體金顯色屬動態(tài)過程，終止反應時間長且背景易受水、膠體金及滲透不均勻等的干擾，這些因素均制約了膠體金免疫層析試條的進一步發(fā)展。近幾年，隨著電子信息技術和生物技術的發(fā)展，可用于對金標試條進行半定量、全定量檢測的定量檢測儀引起了國內外相關研究人員的重視，并且一些定量檢測儀也相應出現(xiàn)。

目前，定量檢測儀主要采用的方法有光纖掃描法、線陣CCD掃描法和圖像測量法。光纖掃描法需要有機械掃描裝置帶動光纖傳感器掃描，缺點是儀器體積大而笨重；且在較低濃度下，由于反射光強度變化很弱，導致測量結果穩(wěn)定性差。線陣CCD掃描法只是用冷陰極熒光燈和線陣CCD傳感器代替光纖掃描法中的發(fā)光二極管和光纖傳感器，沒有去掉機械掃描裝置，體積仍然大且笨重。基于圖像測量法設計的金標試條檢測儀能夠利用圖像處理技術直接處理掉采集圖像中的瑕疵和毛刺，并且不會受到水分引起的動態(tài)干擾的影響，不需要步進電機，可以通過計算機實現(xiàn)高速處理，能夠短時間、高質量地完成大量試條的定量測量。圖像測量法信號檢測速度快，圖像處理效果好，對外界環(huán)境因素依賴小，可搭配微處理器設計，適合便攜式金標試條分析儀的設計。目前出現(xiàn)的便攜式金標試條檢測儀主要基于FPGA、ARM、單片機及DSP等嵌入式系統(tǒng)[2～4]，雖然體積小，但還沒有達到方便手持的程度，而且軟件開發(fā)依賴于硬件。

綜合考慮成本、體積、重量及硬件依賴度等方面，筆者提出了一種基于Android系統(tǒng)和圖像處理相結合的手持式金標試條定量分析儀，該分析儀既不受硬件更新?lián)Q代過快的影響，又使體積和重量得以減小、減輕，還能節(jié)約成本，縮短研發(fā)周期，為金標試條定量檢測儀的廣泛應用提供了可能。

1 金標試條定量分析思路①

1.1 特征值的選取

圖像特征值的選取需要滿足如下要求[5]：精確地描述試條顏色特征；對條紋出現(xiàn)位置不敏感；能減少或消除不同試條的圖像條紋強度差異等。

當光源采用純綠色平行光照射試條的檢測區(qū)時，根據(jù)朗伯-比爾定律A=α·L·C，可推導出試條控制線和測試線積分光密度(IOD)[6]：

(1)

式中I(i)和G(i)——像素i的輸出電流和灰度級；

I0和G0——背景的輸出電流和灰度級；

N——像素總數(shù)；

OD——光密度；

Φ——反射光強度。

IOD的絕對值依賴于試條的物理特性和用于檢測的圖像采集系統(tǒng)，由不同實驗得到的數(shù)據(jù)不能通過其來進行比較。不同的試條在相同濃度下會由于纖維特性差異、濕度影響及存儲條件不同等因素而表現(xiàn)出顯色差別。而且在實際測量中，由于直線傳播和散射的存在會降低反射光密度，再加上水、血液及膠體金的非均勻滲透等都會使試條上白色區(qū)域只能夠反射部分入射光。然而，所有這些影響控制線和測試線的因素是相同的[7]，因此可以采用控制線積分光密度與測試線積分光密度的相對值作為特征值，即有：

(2)

其中，下標t、c分別代表測試線和控制線；Gt(i)和Gc(i)分別為測試線和控制線上像素i的灰度級；G0為背景的灰度級(由背景的平均灰度值表示)。

由式(1)、(2)可知，要得到積分光密度值，需要提取的直接量就是控制線、測試線和白色區(qū)域的灰度值。

1.2 圖像處理

由于獲取的圖像除了試條以外還包括大量無關部分，為了剔除無關信息、減少運算量，必須對圖像進行縮放，并初步提取檢測窗口。同時由于受光線及圖像采集設備等的影響，圖像中會存在一些毛刺和瑕疵，需要對圖像進行濾波。為了獲得試條各部分的灰度信息，除了將圖像轉換為灰度圖外，還需要對圖像進行分割處理。

目前，用于金標試條圖像分割的算法主要有模糊C均值聚類算法、遺傳算法、基于遺傳算法的快速模糊C均值聚類算法(FCM)、細胞神經(jīng)網(wǎng)絡算法及其優(yōu)化算法[8]等。其中C均值聚類算法及其優(yōu)化算法的應用比較廣泛，而筆者采用的是圖像分割效果較好的基于遺傳算法的FCM聚類算法。

FCM聚類算法的目標函數(shù)、聚類中心和隸屬度函數(shù)分別如下：

(3)

(4)

(5)

其中，uik∈[0,1]，為向量xj對聚類i的隸屬度；c為聚類數(shù)；‖k-vi‖為第i個聚類中心到第j個數(shù)據(jù)點之間的距離，通常為歐氏距離；U=[uij]c×n為模糊C分割矩陣；V={vi}為聚類中心矩陣；k的取值為0,1，…，Lmax-1；Lmax為k的級數(shù)；h(k)為k的直方圖。

遺傳算法作為一種演化計算，能有效地搜索到全局最優(yōu)解，彌補了FCM算法容易陷入局部最優(yōu)的缺陷。

遺傳FCM分割算法流程如下：

a. 設定種群數(shù)，初始化種群。初始化的值包括種群大小、突變概率、交叉概率和遺傳代數(shù)，再加上每個個體(染色體)的基因編碼在設定區(qū)間內的隨機初始化；適應度設為零。

b. 用式(5)計算每個個體的分割矩陣，并對每個個體做適應性評價，即用公式fm=1/(1+fm)計算每個個體的適應度。

c. 由父代種群進化出子代種群，對當前代(父代)進行選擇、交叉和突變操作得到子代種群。

d. 用式(5)計算每個個體的新分割矩陣；再將新分割矩陣代入式(4)中，計算新的聚類中心(即染色體)；計算新、舊聚類中心的距離。

e. 如果滿足結束條件，即聚類中心距離小于設定值或循環(huán)次數(shù)達到更新代數(shù)值，則停止循環(huán)并計算適應度和選擇最佳個體，返回分割矩陣；如果不滿足，重復步驟b～d，直到滿足結束條件為止。

算法中的聚類數(shù)選為3，遺傳代數(shù)100，種群大小30，突變概率和交叉概率分別選為0.02和0.60，選擇操作采用的是輪盤賭選擇算法。

2 檢測儀的設計

2.1 硬件部分

考慮到檢測儀的性價比和體積，筆者采用U880F1手機和自制外殼搭建硬件平臺，用手機自帶的CMOS攝像頭和微距攝像頭采集圖像(縮小空間)。自制外殼是以實際測量尺寸為依據(jù)，利用CAD軟件構建外殼模型，然后用3D打印技術進行打印而得到的。頂部到中間的區(qū)域放置微距攝像頭，中間到底部之間的距離在焦距范圍內，底部有一個用于放置試條的槽，由于不同試條的寬度有差別，所以槽的寬度設有一定的余量。用于照明的兩個LED光源放在試條槽上方一定距離處，且位置相對。

2.2 軟件部分

2.2.1人機交互程序

人機交互程序模塊主要在Android系統(tǒng)中設計用戶界面、接收用戶操作指令并做出相應的動作。Java程序調用手機攝像頭，獲取并存儲試條圖像，然后提取圖像通過jni進行本地調用傳給OpenCV的C/C++程序進行分析處理，處理結果回傳至Java主程序進行顯示。主要實現(xiàn)內容為：調用攝像頭拍攝試條圖像并保存，調用所采集的圖片傳給圖像處理程序進行處理，接收處理結果并進行顯示。此部分用Java語言在Eclipse中編寫實現(xiàn)。人機交互程序流程如圖1所示。

圖1 人機交互程序流程

2.2.2圖像處理程序

圖像處理程序使用C++編寫OpenCV程序，編譯環(huán)境為Visual Studio，圖像處理程序流程如圖2所示。載入所得試條圖像后對其進行縮放，提取感興趣區(qū)域。然后對所得圖像進行濾波，將其轉換為灰度圖。對所得灰度圖進行閾值化、形態(tài)學操作，提取輪廓。再次提取感興趣區(qū)域生成新圖片，然后用遺傳FCM聚類算法進行聚類，得到控制線、測試線和背景區(qū)的灰度值(特征值)，計算RIOD，代入設計好的關系函數(shù)中得到相應的濃度值。

圖2 圖像處理程序流程

3 實驗數(shù)據(jù)與分析

為了得到相對積分光密度-濃度關系曲線，以人絨毛膜促性腺激素HCG試條為例。將HCG溶液分別稀釋成10、35、75、100、150、200、300、400、500mIU/mL不同等級濃度的試液。然后將等量的以上試液分別滴定到相同數(shù)量、相同批次的HCG試條上，并嚴格控制試液用量。反應5min后，用自制檢測儀測量它們的積分光密度值，測試數(shù)據(jù)見表1。

表1 HCG試條的測試數(shù)據(jù)

用曲線擬合方法對檢測結果進行分析，可得到相對積分光密度值與濃度之間的關系式為：

RIOD=0.0023C+0.1165

(6)

以濃度為橫坐標，以RIOD為縱坐標繪制關系曲線如圖3所示。

圖3 RIOD與HCG濃度之間的關系曲線

由圖3可以看出，檢測結果對HCG濃度有較好的區(qū)分等級。將RIOD與濃度的關系模型存入程序中，實際測試時，程序自動將RIOD值轉換成濃度值并顯示在儀器界面上。

4 結束語

以手機及其自帶攝像頭搭建了金標試條定量檢測儀，該儀器外觀小巧，方便手持的同時操作簡單、成本低廉。采用基于遺傳算法的快速模糊C均值聚類算法對預處理后的金標試條圖像進行分割，能夠精確提取試條的測試線和控制線，通過計算試條測試線和控制線的相對積分光密度值來確定待測液樣本的濃度值，從而實現(xiàn)金標免疫層析試條的定量檢測。實際HCG檢測結果表明，采用該檢測儀得出的RIOD與濃度之間的關系是一一對應的，對被測液濃度有較好的區(qū)分等級。該檢測儀用于定量檢測金標試條具有可行性。

[1] 陳曦,馮璐,劉帥,等.膠體金層析試條測試儀的設計研究[J].河北工業(yè)大學學報,2009,38(4)：66～69.

[2] 李洪梅.基于ARM的便攜式試紙分析儀的研究[D].長春:吉林大學,2011.

[3] 王洋.高精度金標試紙讀數(shù)儀的設計與開發(fā)[D].杭州:浙江大學,2013.

[4] 程華,王樹志,陳晨,等.新型膠體金免疫層析試紙條定量分析儀的研制[J].分析儀器,2013,(1)：7～11.

[5] 李偉.基于模糊C均值聚類的圖像分割算法研究[D].哈爾濱:哈爾濱工程大學,2013.

[6] 曾念寅,李玉榕,杜民.FCM聚類算法實現(xiàn)金免疫層析試條定量檢測的研究[C].2010振動與噪聲測試峰會論文集.北京:儀器儀表學報雜志社,2010:221～225.

[7] Li Y R,Zeng N Y,Du M.A Novel Image Methodology for Interpretation of Gold Immunochromatographic Strip[J].Journal of Computer,2011,6(3):540～547.

[8] Zeng N Y,Wang Z D,Zineddin B,et al.Image-Based Quantitative Analysis of Gold Immunochromatographic Strip via Cellular Neural Network Approach[J].IEEE Transactions on Medical Imaging,2014,33(5):1129～1136.