鄭艷冰+叢永柱+吳瓊+沙偉

摘要：利用改良CTAB法提取10種金發(fā)蘚科（Polytrichales）植物基因組DNA，利用RAPD和分子標記技術對其進行遺傳多樣性研究。結(jié)果表明，在供試材料中篩選到具有多態(tài)性的RAPD引物12個，這些RAPD引物共擴增出68條帶，多態(tài)性帶42條，多態(tài)性條帶比率（PPB）為61.76%；采用UPGMA聚類分析，供試材料分為2大類群，細葉擬金發(fā)蘚單獨聚為1類，其余9種植物聚為1類。RAPD和分子標記技術可用于金發(fā)蘚科植物系統(tǒng)學研究。

關鍵詞：金發(fā)蘚科；RAPD；系統(tǒng)學；遺傳多樣性

中圖分類號：Q75文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0058-03

金發(fā)蘚科（Polytrichales）為金發(fā)蘚目中唯一的1個科，全世界共有19個屬，其中，Eopolytrichum為1個化石屬[1]。Schofield保守估計認為金發(fā)蘚目大約有370種[2]，但新近判斷認為，該目實際上的種數(shù)不超過200種[3]。對金發(fā)蘚科一些屬種的分類地位，不同學者有不同的認識[4-8]。吳鵬程等將穗發(fā)蘚屬的主要種類及擬仙鶴蘚屬和新金發(fā)蘚屬歸并入小金發(fā)蘚屬；將金發(fā)蘚屬中孢蒴口部蓋膜呈肉質(zhì)的種劃入擬金發(fā)蘚屬[9]。Zouhair等利用隨機擴增引物對金發(fā)蘚屬6種植物進行RAPD分析，共獲得166條多態(tài)性DNA片段，根據(jù)RAPD分子標記結(jié)果，將6種植物分為2大類群，即金發(fā)蘚、擬金發(fā)蘚和P.c.var.perigoniale為1類，檜葉金發(fā)蘚、毛尖金發(fā)[LL]蘚和P.strictum為1類，第1大類中金發(fā)蘚與擬大金發(fā)蘚之間的親緣關系更近一些[10]。金發(fā)蘚科的許多植物在經(jīng)典分類學上分類地位不清，且一些分子標記的試驗結(jié)果與經(jīng)典分類學結(jié)論相悖，這為金發(fā)蘚科系統(tǒng)學研究提供了更廣闊的空間。本研究采用RAPD分析方法，對金發(fā)蘚科10種蘚類植物進行遺傳聚類分析，以期為更好地研究蘚類植物的分類地位奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為自然風干的標本及2012年采集的新鮮標本，材料種名、采集地等信息見表1。

1.2儀器及藥品

1.2.1儀器美國產(chǎn)PE-9600型PCR儀；北京六一儀器廠產(chǎn)DY-3型電泳儀和DYCP-33A型水平板電泳槽；日本產(chǎn)7A0-0012型GeneSpecl、SANYO制冰機和NUALR-6382E型超低溫冰箱；河北省黃驊航天儀器廠產(chǎn)DZKW-D型水浴鍋；德國產(chǎn)高速冷凍離心機HERMLEZ323K；1mL和20、200、100μL微量加樣器；UVPGDS-8000型紫外凝膠成像系統(tǒng)；Barnstead純水儀；PHS-25型酸度計；北京賽多利斯天平有限公司產(chǎn)電子天平。

1.2.2藥品Tris、HCl、EDTA、NaOH、溴化乙錠（EB）、乙酸鈉、冰乙酸、TE、CTAB、NaCl、TBE、乙醇、氯仿、異戊醇、溴酚藍、蔗糖、抗壞血酸鈉、PVP和3%β-巰基乙醇等，均為分析純（AR）；4種dNTP、TaqDNA聚合酶及A、B、C、D、H、Y組引物，均為上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品；DGL2000Marker，為大連寶生物公司產(chǎn)品。

1.3試驗方法

1.3.1DNA提純、保存及檢測采用改良CTAB法提取試材DNA；放入-20℃冰箱儲存或放入4℃冰箱待用；利用核酸檢測儀通過紫外吸收法對DNA樣品進行定量分析和純度檢測，并用瓊脂糖電泳檢測DNA。

1.3.2RAPD擴增

1.3.2.1擴增反應體系RAPD擴增體系總體積為25μL，其中，10×buffer、25mmol/LMg2+、10mmol/LeachdNTP、25g/LTemplateDNA、5000U/mLTaqpolymerase和10mmol/LPrimer等組分體積分別為2.5、2.0、1.0、1.0、0.3、0.8μL，用無菌ddH2O補足。

1.3.2.2擴增反應程序94℃2min；94℃1min，36℃1min，72℃2min，43個循環(huán)；72℃5min，1個循環(huán)。

1.3.2.3RAPD反應體系的優(yōu)化RAPD反應體系為25μL，擴增引物為A11。針對反應體系中模板DNA、dNTP、引物和Taq酶濃度等4個組分，L16（54）正交試驗基礎上進一步進行L9（43）正交設計（表2、表3），以尋求最優(yōu)方案。

1.3.4擴增產(chǎn)物的檢測擴增結(jié)束，在反應混合物中加入5mL/L上樣緩沖液，混勻；取15μL點入1.5%瓊脂糖凝膠中，用0.5×TBE電泳緩沖液在3V/cm（84V）電場下電泳2～3h，經(jīng)0.25mg/L溴化乙錠染色30min，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察照相和分析。

1.3.5引物篩選正式擴增前，任意選取系統(tǒng)進化差異較大的2個不同品種DNA，以這2個品種均能擴增出清晰條帶、重復性和多態(tài)性好的為引物選擇依據(jù)，對上海生工生產(chǎn)的A、B、C、D、H、Y組共6組隨機引物進行篩選。

1.3.6數(shù)據(jù)處理在篩選出的引物中，選取擴增清晰、穩(wěn)定、重復性好的引物進行條帶統(tǒng)計。電泳獲得基因組擴增圖譜的每1條帶（DNA片段）均為1個分子標記，并代表引物的1個結(jié)合位點；根據(jù)各分子標記在相同電泳遷移率的有無，統(tǒng)計得到所有位點的二元矩陣，有DNA擴增帶（顯性）記為“1”，無帶記為“0”，強帶或可分辨的弱帶賦值均為“1”；用NTSYS-PC軟件處理RAPD數(shù)據(jù)，依據(jù)NEI-LI法計算各品種間的遺傳相似度，按照類平均法（UPGMA）建立親緣關系樹狀圖。

2結(jié)果與分析

2.1RAPD反應體系優(yōu)化

在L9（43）正交試驗設計中，組合1、3擴增出2條帶，組合2擴增出4條帶，組合5擴增出1條帶，其余組合未擴增出條帶；組合2的多態(tài)性及清晰度最好，最佳RAPD擴增反應條件為反應總體積25μL、dNTP為0.4mmol/L、引物為0.4mmol/L、基因組DNA為15ng、Taq酶2.0U，其他成分為無菌ddH2O。

2.2引物篩選

利用優(yōu)化反應體系對上海生工生物工程股份有限公司生產(chǎn)的A、B、C、D、H、Y組120條引物進行篩選，共篩選出12條多態(tài)性好的引物（表4），用于全部供試樣品DNA的擴增。

2.3擴增結(jié)果

選用重復性和多態(tài)性較好、譜帶清晰的12條引物對4屬10種金發(fā)蘚科植物樣品進行RAPD擴增，結(jié)果由圖1、圖2、圖3和表5可見，每個引物的擴增片段在2～9條之間；12個隨機引物共獲得68條譜帶，即共檢測到68個位點，平均每個引物檢測到5.67個位點，其中，多態(tài)性條帶為42條，多態(tài)百分率為61.76%。

2.4聚類分析

基于RAPD擴增結(jié)果，用UPGAM法進行聚類分析，得到供試材料相似性系數(shù)表和10種金發(fā)蘚科植物系統(tǒng)學關系樹狀圖。由表6和圖4可見，10種金發(fā)蘚科植物的遺傳相似性系數(shù)在0.02～0.96之間，說明這10種植物親緣關系較近；細葉擬金發(fā)蘚與其他種遺傳距離較遠，自為1類，其余9種聚為1類；其他9種植物的遺傳相似性系數(shù)在0.64處又可分2兩類，即硬葉小金發(fā)蘚和細疣小金發(fā)蘚聚為1類，其余7種聚為

1類；這7種植物在遺傳相似性系數(shù)0.78處又可聚為2類，即小仙鶴蘚和小胞仙鶴蘚聚為1類，臺灣擬金發(fā)蘚、擬金發(fā)蘚、多形擬金發(fā)蘚、毛尖金發(fā)蘚和檜葉金發(fā)蘚聚為1類。這說明10種金發(fā)蘚科植物遺傳相似性極高，與形態(tài)解剖學及其形態(tài)分類學地位表現(xiàn)出高度的一致性，這也與

參考文獻：

[1]KonopkaAS，HerendeenPS，MerrillGL，etal.Sporophytesandgametophytesofpolytrichaceaefromthecampanian（latecretaceous）ofGeorgia，USA[J].InternationalJournalofPlantSciences，1997，158（4）：489-499.

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[11]HyvnenJ，KoskinenS，MerrillGL，etal.Phylogenyofthepolytrichales（bryophyta）basedonsimultaneousanalysisofmolecularandmorphologicaldata[J].MolecularPhylogeneticsandEvolution，2004，31（3）：915-928.

2.2引物篩選

利用優(yōu)化反應體系對上海生工生物工程股份有限公司生產(chǎn)的A、B、C、D、H、Y組120條引物進行篩選，共篩選出12條多態(tài)性好的引物（表4），用于全部供試樣品DNA的擴增。

2.3擴增結(jié)果

選用重復性和多態(tài)性較好、譜帶清晰的12條引物對4屬10種金發(fā)蘚科植物樣品進行RAPD擴增，結(jié)果由圖1、圖2、圖3和表5可見，每個引物的擴增片段在2～9條之間；12個隨機引物共獲得68條譜帶，即共檢測到68個位點，平均每個引物檢測到5.67個位點，其中，多態(tài)性條帶為42條，多態(tài)百分率為61.76%。

2.4聚類分析

基于RAPD擴增結(jié)果，用UPGAM法進行聚類分析，得到供試材料相似性系數(shù)表和10種金發(fā)蘚科植物系統(tǒng)學關系樹狀圖。由表6和圖4可見，10種金發(fā)蘚科植物的遺傳相似性系數(shù)在0.02～0.96之間，說明這10種植物親緣關系較近；細葉擬金發(fā)蘚與其他種遺傳距離較遠，自為1類，其余9種聚為1類；其他9種植物的遺傳相似性系數(shù)在0.64處又可分2兩類，即硬葉小金發(fā)蘚和細疣小金發(fā)蘚聚為1類，其余7種聚為

1類；這7種植物在遺傳相似性系數(shù)0.78處又可聚為2類，即小仙鶴蘚和小胞仙鶴蘚聚為1類，臺灣擬金發(fā)蘚、擬金發(fā)蘚、多形擬金發(fā)蘚、毛尖金發(fā)蘚和檜葉金發(fā)蘚聚為1類。這說明10種金發(fā)蘚科植物遺傳相似性極高，與形態(tài)解剖學及其形態(tài)分類學地位表現(xiàn)出高度的一致性，這也與

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[11]HyvnenJ，KoskinenS，MerrillGL，etal.Phylogenyofthepolytrichales（bryophyta）basedonsimultaneousanalysisofmolecularandmorphologicaldata[J].MolecularPhylogeneticsandEvolution，2004，31（3）：915-928.

2.2引物篩選

利用優(yōu)化反應體系對上海生工生物工程股份有限公司生產(chǎn)的A、B、C、D、H、Y組120條引物進行篩選，共篩選出12條多態(tài)性好的引物（表4），用于全部供試樣品DNA的擴增。

2.3擴增結(jié)果

選用重復性和多態(tài)性較好、譜帶清晰的12條引物對4屬10種金發(fā)蘚科植物樣品進行RAPD擴增，結(jié)果由圖1、圖2、圖3和表5可見，每個引物的擴增片段在2～9條之間；12個隨機引物共獲得68條譜帶，即共檢測到68個位點，平均每個引物檢測到5.67個位點，其中，多態(tài)性條帶為42條，多態(tài)百分率為61.76%。

2.4聚類分析

基于RAPD擴增結(jié)果，用UPGAM法進行聚類分析，得到供試材料相似性系數(shù)表和10種金發(fā)蘚科植物系統(tǒng)學關系樹狀圖。由表6和圖4可見，10種金發(fā)蘚科植物的遺傳相似性系數(shù)在0.02～0.96之間，說明這10種植物親緣關系較近；細葉擬金發(fā)蘚與其他種遺傳距離較遠，自為1類，其余9種聚為1類；其他9種植物的遺傳相似性系數(shù)在0.64處又可分2兩類，即硬葉小金發(fā)蘚和細疣小金發(fā)蘚聚為1類，其余7種聚為

1類；這7種植物在遺傳相似性系數(shù)0.78處又可聚為2類，即小仙鶴蘚和小胞仙鶴蘚聚為1類，臺灣擬金發(fā)蘚、擬金發(fā)蘚、多形擬金發(fā)蘚、毛尖金發(fā)蘚和檜葉金發(fā)蘚聚為1類。這說明10種金發(fā)蘚科植物遺傳相似性極高，與形態(tài)解剖學及其形態(tài)分類學地位表現(xiàn)出高度的一致性，這也與

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[8]SmithMGL.NotesonNorthAmericanPolytrichaceae：Polytrichastrum[J].TheBryologist，1992，95（3）：270-273.

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[11]HyvnenJ，KoskinenS，MerrillGL，etal.Phylogenyofthepolytrichales（bryophyta）basedonsimultaneousanalysisofmolecularandmorphologicaldata[J].MolecularPhylogeneticsandEvolution，2004，31（3）：915-928.