韓光杰+孫俊+李傳明+劉琴+徐健

摘要：研究蘇云金芽孢桿菌原生質(zhì)體制備與再生的最佳條件，為進(jìn)一步提高原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化率打下基礎(chǔ)。通過(guò)酶解法對(duì)蘇云金芽孢桿菌庫(kù)斯塔克亞種工業(yè)生產(chǎn)菌株（Bacillusthuringiensisssp.kurstaki）2671原生質(zhì)體的制備及再生條件進(jìn)行了研究，考察了菌體生長(zhǎng)狀態(tài)、溶菌酶濃度、處理時(shí)間等影響因素，采用PEG法對(duì)大質(zhì)粒進(jìn)行原生質(zhì)轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期的菌體（培養(yǎng)3h），以SMML作滲透壓穩(wěn)定劑，溶菌酶濃度7mg/mL，40℃下酶解40min，原生質(zhì)體生成量可達(dá)5.7×107個(gè)/mL，再生率可達(dá)14.1%。在此條件下，采用PEG法可將大質(zhì)粒pLTV1-ep成功轉(zhuǎn)化宿主菌，轉(zhuǎn)化率為0.3CFU/μg。

關(guān)鍵詞：蘇云金芽孢桿菌；原生質(zhì)體；制備；轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)：S482.3+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0037-03

蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt）是使用最為廣泛的生物農(nóng)藥[1]。目前，已經(jīng)從Bt的不同亞種中分離了超過(guò)100種殺蟲(chóng)晶體蛋白[2-3]，但每個(gè)亞種的致病力又極其有限。插入外源基因構(gòu)建工程菌是提高其殺蟲(chóng)效果的有效方法之一。Bourgouin等將球形芽孢桿菌的毒素基因成功轉(zhuǎn)入Bt并表達(dá)[4]。Barboza-Corona等將幾丁質(zhì)酶基因?qū)隑t中，并分析了工程菌孢子及殺蟲(chóng)晶體的形成情況[5]。

目前，工程菌的構(gòu)建主要采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)化。Yu等通過(guò)電轉(zhuǎn)化將cyt1Aa和cry11Aa導(dǎo)入Bt中產(chǎn)生工程菌TnX，并將Bt菌株S184-Tet與TnX進(jìn)行原生質(zhì)融合，形成了新的重組菌TnY[6]。Akamatsu等利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒pC194、pUB110、pCB1、pAC32R2成功導(dǎo)入枯草芽孢桿菌[7]。然而在構(gòu)建Bt工程菌時(shí)多采用電轉(zhuǎn)化[8-10]，對(duì)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的研究則相對(duì)較少，與電轉(zhuǎn)化相比，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化相對(duì)溫和，不需轉(zhuǎn)化設(shè)備，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的概率較大，在試驗(yàn)條件不足、感受態(tài)形成受阻或大質(zhì)粒轉(zhuǎn)化時(shí)，原生質(zhì)轉(zhuǎn)化顯得尤其重要。

不同Bt菌株的理化性質(zhì)、毒素基因的遺傳定位都不盡相同[11]，這就決定了每個(gè)菌株的原生質(zhì)形成條件是不同的。研究表明，菌齡、溶菌酶的濃度、處理時(shí)間等對(duì)原生質(zhì)體的形成有很大影響[12]，原生質(zhì)體的形成率與再生率也影響著原生質(zhì)轉(zhuǎn)化效率[13]。本研究通過(guò)對(duì)蘇云金芽孢桿菌庫(kù)斯塔克亞種原生質(zhì)體形成的影響因素、再生率及大質(zhì)粒原生質(zhì)轉(zhuǎn)化的分析，建立起一套完整的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，為基因工程改良奠定了技術(shù)基礎(chǔ)，也為不同菌株原生質(zhì)轉(zhuǎn)化提供了一種模式。

1材料與方法

1.1菌株和質(zhì)粒

蘇云金芽孢桿菌庫(kù)斯塔克亞種（B.thuringiensisssp.kurstaki2671）為實(shí)驗(yàn)室野外分離菌株，具有高效殺蟲(chóng)活性，已工業(yè)化生產(chǎn)。質(zhì)粒pLTV1-ep為筆者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建含增效蛋白基因的Tn917轉(zhuǎn)座子載體，其大小為23.3kb。

1.2試劑及培養(yǎng)基

溶菌酶購(gòu)于碧云天生物公司，PEG6000購(gòu)于上海生工。2×SMM：0.1mol/L順丁烯二酸，0.5mol/L蔗糖，0.02mol/LMgCl2·6H2O。SMML：由2×SMM和4×LB等體積混合而成。

DM3再生培養(yǎng)基：每100mL含1.6g瓊脂粉，50mL1mol/L琥珀酸鈉（pH值7.3），2g酪蛋白氨基酸水解物，1g酵母膏，0.7gK2HPO4、0.3gKH2PO4、0.234gNaCl、3mL20%葡萄糖、500μL2%牛血清白蛋白。

1.3原生質(zhì)體的制備和再生

參考Bianca等的方法[12，14]，并進(jìn)行優(yōu)化。從新鮮平板上挑一單菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基中，30℃、250r/min培養(yǎng)過(guò)夜后以1%接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的25mLLB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)3h。離心收集菌體，用4mLSMML重懸，加200mg/mL溶菌酶至終濃度為7mg/mL，40℃、100r/min培養(yǎng)50min至85%的細(xì)胞變?yōu)樵|(zhì)體。將原生質(zhì)體離心去掉酶液，懸于SMML中，經(jīng)稀釋后涂布于DM3再生培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2～3d，計(jì)算原生質(zhì)體的形成率及再生率。計(jì)算方法為：

形成率=（A-B）/A×100%；

再生率=（C-B）/（A-B）×100%。

式中：A、B分別為溶菌酶處理前后在LB培養(yǎng)基上的菌落數(shù)；C為溶菌酶處理后在高滲培養(yǎng)基上的菌落數(shù)。

1.4原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化

根據(jù)Chang等的方法進(jìn)行優(yōu)化[15]。培養(yǎng)2d后，計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

1.5轉(zhuǎn)化子的檢測(cè)

挑取抗性平板的單菌落，接種于紅霉素（15μg/mL）抗性LB培養(yǎng)基中，30℃、250r/min培養(yǎng)過(guò)夜后，提取質(zhì)粒，PCR檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1菌體生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)原生質(zhì)體形成的影響

細(xì)胞的菌體生長(zhǎng)狀態(tài)是決定蘇云金芽孢桿菌原生質(zhì)體形成的重要因素。在轉(zhuǎn)接培養(yǎng)時(shí)，分別取對(duì)數(shù)前、中、后、穩(wěn)定期的菌體制備原生質(zhì)體，研究菌體生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)原生質(zhì)體形成的影響，使用5mg/mL的溶菌酶處理菌體，42℃水浴1h后鏡檢。從圖1中可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)數(shù)早期，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)3h的菌體能形成大量的原生質(zhì)體，培養(yǎng)4h后原生質(zhì)體形成減少，且有很多桿狀菌體存在。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體的形成量逐漸降低，對(duì)數(shù)后期和穩(wěn)定期基本不形成原生質(zhì)。

2.2溶菌酶濃度對(duì)原生質(zhì)體形成的影響

收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)前期3h的菌體，用SMML重懸，分別以1、2、3、4、5、6、7、8、9mg/mL9個(gè)不同濃度的溶菌酶在42℃，100r/min下酶解1h，結(jié)果見(jiàn)圖2。原生質(zhì)體形成時(shí)酶濃度對(duì)其有極大影響。當(dāng)溶菌酶濃度為1mg/mL時(shí)，原生質(zhì)體的形成率最小，為53.1%；隨著溶菌酶濃度的提高，原生質(zhì)體形成率越來(lái)越大，當(dāng)溶菌酶濃度為9mg/mL時(shí)，原生質(zhì)體的形成率達(dá)到95%，但溶菌酶濃度越高，原生質(zhì)體形成率就越低。原生質(zhì)體形成率達(dá)到85%以上基本能滿足試驗(yàn)要求，此時(shí)溶菌酶濃度為7mg/mL。

2.3酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體形成的影響

溫度對(duì)酶解作用有雙重影響，溫度升高，酶解作用加快，溫度降低，酶解時(shí)間延長(zhǎng)，原生質(zhì)體被毒害作用增加。分別以32、35、37、40、42℃5個(gè)溫度酶解1h進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。隨著溫度升高，原生質(zhì)體的形成率變大，42℃酶解1h，原生質(zhì)體形成率能達(dá)到94.4%，但原生質(zhì)體的形成量很低。在40℃時(shí)，原生質(zhì)體的生成量相對(duì)較高，形成率達(dá)到87.9%。

2.4酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成的影響

溶菌酶對(duì)細(xì)菌的質(zhì)膜會(huì)有一定的破壞，因此酶解時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)嚴(yán)重影響原生質(zhì)體的再生。將菌體分別酶解30、40、50、55、60min后稀釋涂布再生培養(yǎng)基，結(jié)果見(jiàn)表1。酶解溫度40℃時(shí)，隨著酶解時(shí)間的增長(zhǎng)，原生質(zhì)體的形成率逐漸增大，原生質(zhì)體的形成量在酶解50min時(shí)達(dá)到最大，為7.4×107CFU/mL，但原生質(zhì)體再生率在酶解40min達(dá)到最大值，為14.1%，酶解60min后，原生質(zhì)體基本上不能再生。

2.5原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化與檢測(cè)

使用帶有紅霉素抗性的質(zhì)粒pLTV1-ep轉(zhuǎn)化B.thuringiensisssp.kurstaki2671，轉(zhuǎn)化率為0.3CFU/μg。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)菌落PCR擴(kuò)增，結(jié)果有2.7kb左右大小的目的條帶，與預(yù)期大小一致，表明得到的轉(zhuǎn)化子為陽(yáng)性（圖4）。

3討論

蘇云金芽孢桿菌作為微生物殺蟲(chóng)劑，在中國(guó)被廣泛應(yīng)用，基因工程殺蟲(chóng)菌的研究為提高殺蟲(chóng)活性和殺蟲(chóng)譜提供了重要方向。前人在構(gòu)建工程菌的時(shí)候多采用電轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)化理論上的轉(zhuǎn)化效率較高，但質(zhì)粒較大時(shí)就很難轉(zhuǎn)化，且緩沖液配方的選擇是形成感受態(tài)的關(guān)鍵因素。相關(guān)方面前人已有較多研究[9-10，16-18]，制作不同的電擊緩沖液，并摸索了電擊轉(zhuǎn)化條件等影響因素，質(zhì)粒pLTV1-ep均不能被轉(zhuǎn)化。可能由于該質(zhì)粒大于15kb，電擊轉(zhuǎn)化相對(duì)較難，且該菌株不易形成感受態(tài)。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化則從理論上來(lái)講，所有菌株都應(yīng)該可以被成功轉(zhuǎn)化的，除非有限制修飾系統(tǒng)。然而在形成原生質(zhì)體的時(shí)候，會(huì)受到各個(gè)因素的影響，比如菌體培養(yǎng)時(shí)間、溶菌酶濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間等。本研究從上述因素分析了B.thurtingiensisssp.kurstaki2671菌株原生質(zhì)體的形成條件、再生率及轉(zhuǎn)化。

蘇云金芽孢桿菌為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，細(xì)胞壁較壁中肽聚糖層厚，原生質(zhì)體較難制備。菌齡過(guò)大，細(xì)胞壁致密，對(duì)酶有抗性，原生質(zhì)體形成較難；菌齡較小，制備的原生質(zhì)體大小不均，量小且易破裂不易再生。本研究采用1%接種量培養(yǎng)3h后，獲得穩(wěn)定性好、形成率高的原生質(zhì)體。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在培養(yǎng)時(shí)添加甘氨酸，可以直接形成原生質(zhì)體，本研究按此方法，在轉(zhuǎn)接時(shí)添加4%的甘氨酸培養(yǎng)4h后，形成了原生質(zhì)體，但原生質(zhì)體的形成量極低，且菌液黏稠，不適宜用于原生質(zhì)轉(zhuǎn)化。

不同的細(xì)菌還需要調(diào)整原生質(zhì)體制備液各組分的含量和pH值。相關(guān)研究表明，增加馬來(lái)酸的含量可以提高原生質(zhì)體的形成率，本研究在使用含0.02mol/L馬來(lái)酸的制備液時(shí)，原生質(zhì)體很難形成，但含量增加到0.1mol/L時(shí)，原生質(zhì)體形成就相當(dāng)穩(wěn)定。細(xì)胞酶解的pH值也隨著酶和菌種的特性而定。韓璞等在pH值為8.0的溶液中制備了羅伊氏乳桿菌原生質(zhì)體[19]；Boixet等在pH值7.0的溶液中制備保加利亞乳桿菌的原生質(zhì)體[20]；莫靜燕等在pH值6.5的溶液中制備了地衣芽孢桿菌的原生質(zhì)體。本研究選用溶菌酶最適的pH值6.5的條件下制備了原生質(zhì)體，研究結(jié)果表明，只有當(dāng)菌齡很低的時(shí)候，才能形成原生質(zhì)體，菌齡超過(guò)3h后，原生質(zhì)體形成率就很低，可能由于菌齡增大，細(xì)胞壁厚度增加，不利于溶菌酶的作用。在后期的研究中發(fā)現(xiàn)，提高pH值至8.0時(shí)，原生質(zhì)的形成不受菌齡的影響，但再生率下降。

本研究對(duì)B.thurtingiensisssp.kurstaki2671原生質(zhì)體的研究主要集中在制備、再生方面，但原生質(zhì)體最終目的是用于DNA轉(zhuǎn)化。在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的研究中，主要參考Chang等的方法[15]，選用40%PEG6000介導(dǎo)，成功獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。在保證原生質(zhì)體感受狀態(tài)的條件下，原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率還與質(zhì)粒的構(gòu)型、選擇標(biāo)記相關(guān)。本研究在電轉(zhuǎn)化無(wú)法進(jìn)行的情況下，利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化成功獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，但轉(zhuǎn)化效率還很低，原生質(zhì)體的形成和轉(zhuǎn)化還有待繼續(xù)優(yōu)化。

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