王雷+崔震海+張立軍

摘要：以玉米自交系鄭58基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物，分別PCR擴(kuò)增玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）啟動(dòng)子及其全長(zhǎng)編碼序列，利用In-Fusion技術(shù)將兩者定向克隆到載體pCAMBIA-1391Z上，并對(duì)重組子進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果表明，該P(yáng)EPC啟動(dòng)子序列與GenBank中的玉米自交系B73的同源性為97.70%，片段長(zhǎng)1200bp；全長(zhǎng)編碼序列同源性為97.90%，片段長(zhǎng)6330bp。通過(guò)HindⅢ和EcoRⅠ酶切載體pCAMBIA-1391Z，利用In-Fusion技術(shù)將線性載體與之前獲得的2個(gè)PCR片段連接，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列一致，表明成功構(gòu)建了pCAMBIA-1391Z-PEPC植物表達(dá)載體。對(duì)克隆和載體構(gòu)建中存在的問(wèn)題進(jìn)行了討論，以期為該類型基因的高效克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建提供參考、為C4型PEPC基因功能研究和C3植物遺傳轉(zhuǎn)化提供可用的基因序列。

關(guān)鍵詞：玉米；PEPC；基因克??；序列分析；表達(dá)載體構(gòu)建

中圖分類號(hào)：Q786；S513.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0026-04

根據(jù)CO2固定初始產(chǎn)物的不同，可將高等植物分成C3、C4、CAM這3類。以三碳化合物3-磷酸甘油酸為最初光合產(chǎn)物的光合途徑為C3途徑（或卡爾文循環(huán)），以四碳化合物草酰乙酸為最初光合產(chǎn)物的光合途徑為C4途徑。C4途徑具有CO2濃縮機(jī)制，能高效利用大氣中的CO2，使植物保持較高的光合效率[1-3]，因此人們大量開(kāi)展了將C3植物轉(zhuǎn)化為C4植物的研究，但是許多這類轉(zhuǎn)化沒(méi)有達(dá)到預(yù)期目的[4]。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）存在于所有能進(jìn)行光合作用的有機(jī)體中，包括植物、綠藻和光合細(xì)菌等。根據(jù)其序列特征和功能結(jié)構(gòu)，PEPC基因可劃分為C4、C3-1、C3-23個(gè)亞族，其中C4型主要在葉肉細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)，并且受光照調(diào)控，C3-1型主要在黃色葉片、莖等部位表達(dá)，C3-2型主要在根部表達(dá)；C4型的PEPC基因由C3型PEPC基因進(jìn)化而來(lái)[5-7]。研究表明，將雜交玉米品種（GoldenCrossBantam）的C4型PEPC全長(zhǎng)基因（包括自身的啟動(dòng)子）轉(zhuǎn)入C3植物，PEPC酶活性提高了2～110倍，蘋果酸濃度也提高了，光合速率在強(qiáng)光條件下明顯提高。研究還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)玉米PEPC基因cDNA和水稻Cab啟動(dòng)子的嵌合基因的水稻僅能使光合作用效率提高數(shù)倍，而將完整的玉米PEPC基因（包括外顯子、內(nèi)含子及自身的啟動(dòng)子）轉(zhuǎn)入水稻中則能數(shù)十倍或更高地提高其光合效率[8-17]。這說(shuō)明以嵌合基因形式轉(zhuǎn)化C3植物，即cDNA和組成型啟動(dòng)子CaMV35S或光誘導(dǎo)型Cab啟動(dòng)子，或采用C4全長(zhǎng)基因和自身啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)化，對(duì)基因更好地表達(dá)和作用的發(fā)揮是十分必要的。

另外，C4關(guān)鍵酶基因由于序列較長(zhǎng)，即使成功克隆，也不容易連入表達(dá)載體。在傳統(tǒng)載體構(gòu)建方法中，需要將基因的2個(gè)末端經(jīng)過(guò)酶切修飾后插入載體，不僅要尋找合適的酶切位點(diǎn)，而且操作復(fù)雜，通常還需要構(gòu)建多個(gè)中間載體，并進(jìn)行多次酶切連接轉(zhuǎn)化，工作量較大而且構(gòu)建效率較低，尤其不適合構(gòu)建長(zhǎng)片段、多片段拼接的復(fù)雜載體。In-Fusion是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的高效率載體構(gòu)建技術(shù)，已應(yīng)用于多基因融合和長(zhǎng)片段克隆等方面[18]，運(yùn)用該技術(shù)進(jìn)行基因克隆和載體構(gòu)建時(shí)，不需要借助T4DNA連接酶和補(bǔ)平DNA片段末端等操作步驟，只是在PCR引物設(shè)計(jì)中分別引入載體酶切位點(diǎn)兩端的各15bp序列，在In-Fusion重組酶作用下將PCR產(chǎn)物和已經(jīng)線性化的載體連接起來(lái)，從而完成載體構(gòu)建。In-Fusion技術(shù)對(duì)目的片段和載體沒(méi)有特殊的要求，可以將任何目的基因連接到線性化載體上。

玉米的C4型PEPC基因序列較長(zhǎng)，同時(shí)還需要連入啟動(dòng)子，多片段連接表達(dá)載體存在困難。因此，本研究利用PCR技術(shù)擴(kuò)增玉米C4型PEPC全長(zhǎng)編碼序列及其啟動(dòng)子序列，結(jié)合In-Fusion技術(shù)一步成功構(gòu)建表達(dá)載體，并對(duì)克隆和載體構(gòu)建中存在的問(wèn)題進(jìn)行討論，以期為該類型基因的高效克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建提供參考，進(jìn)而為C4型PEPC基因功能的研究和C3植物的遺傳轉(zhuǎn)化提供可用的基因序列。

1材料與方法

1.1植物材料、菌株和載體

玉米（ZeamaysL.）自交系鄭58、pCAMBIA-1391Z植物表達(dá)載體（圖1）由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存，E.coliHST08Premium菌株購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2主要試劑

PrimeSTARGXLDNAPolymerase（CodeNo.R050Q）試劑盒、TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.3.0試劑盒（CodeNo.9762）、In-FusionHDCloningKit試劑盒、高效感受態(tài)細(xì)菌制備試劑盒E.coliCompetentCellsHST08Premium（CodeNo.9128）、各種限制性內(nèi)切酶、DNAmarker均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；植物基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（DP209）、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3引物設(shè)計(jì)

根據(jù)In-Fusion技術(shù)原理，利用NCBI上已經(jīng)發(fā)表的玉米C4光合關(guān)鍵酶PEPC基因全長(zhǎng)DNA序列（GenBank號(hào)：CM000785.3）和表達(dá)載體pCAMBIA-1391Z，設(shè)計(jì)并合成PEPC基因啟動(dòng)子及其全長(zhǎng)編碼序列的引物，詳見(jiàn)表1。

1.4玉米C4型PEPC啟動(dòng)子及其全長(zhǎng)編碼序列的PCR擴(kuò)增

采用以上引物和PrimeSTARGXLDNAPolymerase（CodeNo.R050Q）試劑盒，以玉米自交系鄭58基因組DNA為模板，對(duì)PEPC基因啟動(dòng)子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50μLPCR總反應(yīng)體系為：1μLDNA模板，10μL5×PrimeSTARGXLbuffer（Mg2+plus），4μLdNTPMixture（各2.5mmol/L），各0.5μL上下游引物（20pmol/μL），1μLPrimeSTARGXLDNAPolymerase（1.25U/μL），33μLddH2O。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃變性10s，60℃退火15s，68℃延伸1min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。同樣，對(duì)PEPC基因全長(zhǎng)編碼序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50μLPCR總反應(yīng)體系為：1μLDNA模板，10μL5×PrimeSTARGXLbuffer（含Mg2+），4μLdNTPMixture（各2.5mmol/L），各0.5μL上下游引物（20pmol/μL），1μLPrimeSTARGXLDNAPolymerase（1.25U/μL），33μLddH2O。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃變性10s，60℃退火15s，68℃延伸6min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后切下目的條帶，用膠回收試劑盒回收用于后續(xù)試驗(yàn)。同時(shí)取PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5植物表達(dá)載體的構(gòu)建

分別用HindⅢ、RcoRⅠ雙酶切植物表達(dá)載體pCAMBIA-1391Z。50μL酶切反應(yīng)體系為：5μLpCAMBIA-1391Z，5μL10×Mbuffer，1.5μLHindⅢ（10U/μL），1.5μLEcoRⅠ（10U/μL），37μLddH2O，37℃完全酶切16h。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并切膠回收目的片段，利用In-FusionHDCloningKit（ClontechCodeNo.639633）試劑盒將“1.4”節(jié)中經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證正確并回收的PEPC基因全長(zhǎng)編碼序列、PEPC基因啟動(dòng)子片段和線性載體pCAMBIA-1391Z片段連接，連接反應(yīng)體系為：1μLPEPC基因擴(kuò)增回收片段（約80ng/μL），1μLPEPC基因啟動(dòng)子擴(kuò)增回收片段（約80ng/μL），1μLpCAMBIA-1391Z酶切片段，2μL5×In-FusionHDEnzymePremix，5μLddH2O。取1μL連接產(chǎn)物，熱轉(zhuǎn)化至E.coliCompetentCellsHST08Premium中，涂布平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆、提質(zhì)粒、測(cè)序驗(yàn)證，所得載體命名為pCAMBIA-1391Z-PEPC。

2結(jié)果與分析

2.1玉米基因組DNA的提取

使用植物基因組DNA提取試劑盒提取的玉米基因組DNA，由圖2的0.8%瓊脂糖凝膠電泳與紫外檢測(cè)結(jié)果看出，D260nm/D280nm在1.8～2.0之間，表明模板質(zhì)量較高，符合后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.2玉米C4型PEPC啟動(dòng)子及其全長(zhǎng)編碼序列的克隆

2.2.1目的片段的獲得以玉米自交系鄭58葉片DNA為模板，通過(guò)PCR分別擴(kuò)增出2條大小約為1200bp（圖3）、6330bp的特異性條帶（圖4），利用瓊脂糖回收試劑盒（DP209）進(jìn)行膠回收并測(cè)序。

2.2.2PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果的比對(duì)通過(guò)BLAST將測(cè)序結(jié)果與玉米B73相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)，PEPC啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與玉米B73PEPC啟動(dòng)子的比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖5，經(jīng)分析相似度達(dá)到97.70%；PEPC基因全長(zhǎng)編碼序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與玉米B73PEPC基因的比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖6，經(jīng)分析相似度達(dá)到97.90%。

由以上結(jié)果可以看出，試驗(yàn)用的玉米自交系鄭58C4型PEPC基因及其啟動(dòng)子序列與已注冊(cè)的玉米B73的序列相似度都在90%以上，可以用作后續(xù)載體構(gòu)建。

2.2.3PEPC基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建采用In-Fusion克隆技術(shù)，將載體pCAMBIA-1391Z經(jīng)HindⅢ/RcoRⅠ雙酶切，獲得的片段檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7，可見(jiàn)片段大小為11000bp。線性化載體pCAMBIA-1391Z、PEPC基因全長(zhǎng)及其啟動(dòng)子在In-FusionHDEnzymePremix作用下重組，成功獲得重組質(zhì)粒pCAMBIA-1391Z-PEPC。將重組質(zhì)粒熱轉(zhuǎn)化至E.coliCompetentCellsHST08Premium中，挑陽(yáng)性克隆測(cè)序，結(jié)果表明，PEPC基因全長(zhǎng)及其啟動(dòng)子已經(jīng)成功插入到載體pCAMBIA-1391Z之中，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致（圖8），表明成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA-1391Z-PEPC。

3討論與結(jié)論

植物表達(dá)載體的構(gòu)建在植物基因工程研究中占據(jù)重要地位，直接關(guān)系到目的基因的表達(dá)效果，因此選擇方便與快捷的載體構(gòu)建方法具有重要的意義。目前，人們已經(jīng)發(fā)明了多種表達(dá)載體構(gòu)建的方法，例如傳統(tǒng)酶切連接方法、一步克隆法、Gateway技術(shù)等[19-20]。在構(gòu)建表達(dá)載體過(guò)程中，首先需要對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行選擇，常用的植物表達(dá)載體有pBI121、pBI221、pCAMBIA系列載體（載體的骨架是pUC18）。根據(jù)本試驗(yàn)克隆的PEPC基因全長(zhǎng)編碼序列及其啟動(dòng)子，筆者選擇了沒(méi)有

啟動(dòng)子序列的植物表達(dá)載體pCAMBIA-1391Z。多個(gè)目的片段插入植物表達(dá)載體常常受到酶切位點(diǎn)的限制，操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。與傳統(tǒng)的載體構(gòu)建方法相比，In-Fusion技術(shù)可以減少中間載體的構(gòu)建，減少連接、轉(zhuǎn)化次數(shù)，重組效率高；相對(duì)于Gateway技術(shù)來(lái)說(shuō)，In-Fusion技術(shù)更簡(jiǎn)單，更快速。本研究采用In-Fusion技術(shù)進(jìn)行目的片段克隆時(shí)，引物5′端設(shè)計(jì)與線性載體同源的15bp序列，通過(guò)PCR實(shí)現(xiàn)多目的片段與表達(dá)載體重組連接。試驗(yàn)中分別用HindⅢ/EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，利用In-Fusion酶將線性載體與之前獲得的2個(gè)PCR片段連接，成功構(gòu)建pCAMBIA-1391Z-PEPC植物表達(dá)載體，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列一致。

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