潘玉，丁芹，王莉娜，宋正霞，顏學(xué)兵

徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染性疾病科,江蘇徐州 221006

BMP-7抑制H 22荷瘤小鼠腫瘤組織PCNA表達(dá)并上調(diào)E-cadherin的表達(dá)

潘玉，丁芹，王莉娜，宋正霞，顏學(xué)兵

徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染性疾病科,江蘇徐州 221006

目的 探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(bonemorphogenetic protein-7,BMP-7)對H22荷瘤小鼠的抑制作用。 方法 該實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2014年9月—2015年1月，選擇清潔級昆明小鼠建立H22荷瘤小鼠模型，隨機(jī)分成3組：生理鹽水組、環(huán)磷酰胺組、BMP-7組。HE染色觀察腫瘤組織病理學(xué)變化；免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織內(nèi)增殖細(xì)胞核抗原 (proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表達(dá)；逆轉(zhuǎn)錄-PCR檢測組織內(nèi)E-cadherin的表達(dá)。 結(jié)果 HE染色顯示BMP-7組有大片壞死，有明顯的核碎裂、核溶解；環(huán)磷酰胺組細(xì)胞排列疏松，核質(zhì)比例減小，瘤內(nèi)有大片壞死。免疫組化顯示BMP-7及環(huán)磷酰胺組PCNA的表達(dá)均低于生理鹽水組(F=34.78,P<0.05)。逆轉(zhuǎn)錄-PCR顯示環(huán)磷酰胺組E-cadherin的表達(dá)最高，其次是BMP-7組，生理鹽水組最低(F=7.63，P<0.05)。 結(jié)論BMP-7能下調(diào)H22荷瘤小鼠PCNA表達(dá)，并有上調(diào)E-cadherin表達(dá)的趨勢。

H 22細(xì)胞；肝癌模型；BMP-7；PCNA

骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(bonemorphogenetic protein-7，BMP-7)可通過拮抗轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)/ Smad信號通路發(fā)揮抗炎、抗纖維化作用，并有多項(xiàng)研究證實(shí)其抗腫瘤作用[1-3]。已有研究顯示[4-5]BMP-7可通過拮抗TGF-β信號通路抗肝纖維化，而肝纖維化是由慢性肝炎發(fā)展至肝硬化、肝細(xì)胞癌的中間過程，因此BMP-7可能通過拮抗TGF-β信號通路，發(fā)揮抗肝細(xì)胞癌的作用。該實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2014年9月—2015年1月。選擇清潔級昆明小鼠建立H22荷瘤小鼠模型，探討B(tài)MP-7對H22荷瘤小鼠的抑制作用,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 動物及瘤株 清潔級昆明小鼠，雄性，20～26 g，購自徐州醫(yī)學(xué)院動物中心。小鼠肝癌細(xì)胞株H22由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所腫瘤實(shí)驗(yàn)室惠贈。

1.1.2主要試劑 重組人BMP-7購自美國Pepro Tech公司，HE染色試劑盒購自江蘇碧云天公司，增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)一抗購自武漢三鷹生物工程有限公司，兔超敏二步法免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，TIAN Script cDNA第一鏈合成試劑盒和2×PCR Master MIX購自天根生物科技有限公司。環(huán)磷酰胺購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1建立腫瘤模型、分組、給藥 H22肝癌細(xì)胞采用小鼠腹水方式傳代培養(yǎng)。無菌操作取H22小鼠腹水，臺盼藍(lán)染色，光鏡下瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)，活瘤細(xì)胞>95%，調(diào)整細(xì)胞濃度為l×107細(xì)胞/mL，分別取0.2mL接種于小鼠右前肢外側(cè)皮下，制成實(shí)體型荷瘤小鼠模型。將24只小鼠隨機(jī)分成3組，分別是生理鹽水組、環(huán)磷酰胺組、BMP-7組。各組于造模第二天開始給藥。生理鹽水組：生理鹽水0.2 mL；環(huán)磷酰胺組：環(huán)磷酰胺25 mg/kg，約0.2 mL；BMP-7組：rhBMP-7 3 ng/kg，約0.2mL，分別尾靜脈注射，1次/d，連續(xù)14 d。

1.2.2 處死、取材 停藥第二天，頸椎脫臼處死小鼠，完整剝離瘤體。各組腫瘤標(biāo)本分別于4%多聚甲醛固定、RNA Store液處理。

1.2.3荷瘤小鼠移植瘤組織病理形態(tài)學(xué)觀察 肉眼觀察各組小鼠的移植瘤大體形態(tài)。然后，取部分荷瘤小鼠移植瘤組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制備4μm厚切片，HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察各組織的形態(tài)，以及腫瘤細(xì)胞生長、壞死及對周圍組織的浸潤情況。

1.2.4荷瘤小鼠移植瘤組織中增殖細(xì)胞核抗原 (PCNA)的表達(dá)操作按兔超敏二步法免疫組化染色試劑盒說明書進(jìn)行，一抗PCNA抗體用0.01 M磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffered saline，PBS)l:200稀釋后使用。陰性對照以PBS代替PCNA抗體。以細(xì)胞核染成棕黃色或棕褐色為陽性反應(yīng)，染色的強(qiáng)弱代表組織中PCNA蛋白表達(dá)水平的高低。每個(gè)標(biāo)本選取5個(gè)高倍視野(×400倍)，應(yīng)用Image-Pro Plus軟件分析，計(jì)算每個(gè)視野下陽性染色的積分光密度(IOD)值及平均光密度(IOD/area)。

1.2.5腫瘤組織總RNA提取及RT-PCR檢測 按Trizol說明書抽提總RNA，紫外分光光度計(jì)測吸光度值(A值)，吸光度比值(A260/ A280)1.8～2.0之間，RT-PCR按TIAN Script cDNA第一鏈合成試劑盒和2×PCR Master MIX說明書操作。采用Primer 5.0分析設(shè)計(jì)引物序列(表1)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下觀察電泳結(jié)果，并用凝膠成像系統(tǒng)掃描照相，Image J軟件對圖像進(jìn)行分析。

表1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；樣本方差齊性采用levene法檢驗(yàn)，方差齊時(shí)采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法；方差不齊時(shí)采用Kruskal-Wallis法檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 荷瘤小鼠的一般情況

在實(shí)驗(yàn)過程中，生理鹽水組荷瘤小鼠活動減少，步態(tài)不穩(wěn)，毛發(fā)稀疏，進(jìn)食、進(jìn)水量少，形體消瘦呈惡病質(zhì)，其中2只小鼠在用藥期間死亡，而環(huán)磷酰胺及BMP-7組小鼠病情相對于生理鹽水組較輕，用藥期間各有1只死亡。

2.2 荷瘤小鼠移植瘤組織病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

肉眼可見荷瘤小鼠H22移植瘤體呈結(jié)節(jié)狀，質(zhì)嫩，剖面呈魚肉狀。HE染色顯示腫瘤組織為未分化腺癌，生理鹽水組腫瘤細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞密度大，核質(zhì)比例大，核染色深且異型性明顯，可見較多瘤巨細(xì)胞，腫瘤實(shí)質(zhì)和間質(zhì)分界不清；環(huán)磷酰胺及BMP-7組腫瘤細(xì)胞排列疏松，有纖維組織包裹，瘤細(xì)胞大小不一，核質(zhì)比例減小，核呈圓形淡染，核仁小而不明顯，瘤內(nèi)出現(xiàn)片狀壞死，腫瘤細(xì)胞周圍可見淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(圖1)。

圖1 移植瘤組織的HE染色(400X)

2.3 BMP-7對腫瘤組織內(nèi)PCNA表達(dá)的影響

PCNA蛋白表達(dá)定位于腫瘤細(xì)胞核內(nèi)，呈棕黃色顆粒狀。各組腫瘤組織均有陽性表達(dá)，其中生理鹽水組PCNA表達(dá)最高，其次是環(huán)磷酰胺組，BMP-7組表達(dá)最低。環(huán)磷酰胺及BMP-7組PCNA的表達(dá)低于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 PCNA在移植瘤組織中的表達(dá)（±s）

表2 PCNA在移植瘤組織中的表達(dá)（±s）

注：F=34.78，P<0.05；與生理鹽水組比較，1)P<0.05。

分組平均光密度（IOD/area）生理鹽水環(huán)磷酰胺BMP-7 0.46±0.05（0.39±0.08）1)（0.38±0.04）1)

2.4 半定量RT-PCR檢測腫瘤組織內(nèi)E-cadherin的表達(dá)水平

分別抽提各組腫瘤組織的總RNA，半定量RT-PCR檢測E-cadherin的表達(dá)水平。結(jié)果使用Image J軟件進(jìn)行半定量分析，E-cadherin與β-actin的灰度值進(jìn)行對比，得到E-cadherin電泳條帶的相對灰度值。

圖2 移植瘤組織內(nèi)E-cadherin相對表達(dá)量

從圖2可以看出環(huán)磷酰胺組E-cadherin的表達(dá)最高，其次是BMP-7組，生理鹽水組最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.63，P< 0.05)，其中環(huán)磷酰胺組E-cadherin的表達(dá)與生理鹽水組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

肝癌的治療首選手術(shù)治療，也可采用放射介入治療，但是對于沒有條件進(jìn)行手術(shù)或者介入的患者沒有確切有效的全身化療方案。環(huán)磷酰胺雖然在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中有明顯的抑瘤作用，但在實(shí)際的臨床應(yīng)用中環(huán)磷酰胺對肝細(xì)胞癌的治療效果基本上是否定的，且能產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)，一般不用于肝細(xì)胞癌的治療，因此在該研究中環(huán)磷酰胺僅僅作為抗腫瘤藥物的陽性對照。

BMP-7的基因工程產(chǎn)品早在2004年被FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床脊柱融合手術(shù)，這說明rhBMP-7已進(jìn)入臨床應(yīng)用階段。已經(jīng)有研究證實(shí)BMP-7能夠通過拮抗TGF-β信號通路，發(fā)揮抗腫瘤作用[1-3]。同時(shí)，研究證實(shí)BMP-7可通過拮抗TGF-β信號通路抗肝纖維化[4-5]，而肝纖維化是由慢性肝炎發(fā)展至肝硬化、肝細(xì)胞癌的中間過程。有研究指出肝纖維化促進(jìn)了致癌作用是由于成纖維細(xì)胞分泌grem lin阻斷了BMP的功能，從而促進(jìn)干細(xì)胞活化和增殖，導(dǎo)致肝細(xì)胞癌進(jìn)展[6]。若能證實(shí)BMP-7拮抗肝細(xì)胞癌的作用，有廣泛臨床應(yīng)用前景。

PCNA作為一項(xiàng)評估細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)，與惡性腫瘤的增長活性、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有密切關(guān)系。檢測惡性腫瘤組織PCNA表達(dá)對判斷腫瘤的惡性程度、預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移趨勢、指導(dǎo)臨床的治療方案，以及改善患者預(yù)后均有重要意義。Lai JP等[7]研究顯示在134例肝細(xì)胞癌中103例 (77%)PCNA免疫組化染色為彌漫性強(qiáng)陽性，但是33例肝細(xì)胞腺瘤中僅2例(6%)陽性，而40例灶性結(jié)節(jié)性增生和77例大再生結(jié)節(jié)中，沒有1例有此表現(xiàn)，提示PCNA可作為鑒別肝細(xì)胞癌與良性肝結(jié)節(jié)性病變的現(xiàn)有標(biāo)志物的補(bǔ)充。還有研究[8]發(fā)現(xiàn)非編碼反義RNA PCNA-AS1通過形成RNA雜交增加PCNA RNA穩(wěn)定性，從而調(diào)節(jié)PCNA，進(jìn)而促進(jìn)肝細(xì)胞癌的腫瘤生長。該研究中BMP-7組H22荷瘤小鼠腫瘤組織中PCNA的表達(dá)明顯低于生理鹽水組，并低于環(huán)磷酰胺組，且實(shí)驗(yàn)過程中BMP-7組小鼠病情相對于生理鹽水組較輕，提示BMP-7可下調(diào)PCNA表達(dá)，并有抑制H22荷瘤小鼠移植瘤組織增長的趨勢。

臨床觀察發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)惡性腫瘤患者均死于腫瘤轉(zhuǎn)移，而上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)被認(rèn)為是上皮來源的惡性腫瘤發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的重要原因，其主要特征有細(xì)胞黏附分子，如E-cadherin表達(dá)的減少，同時(shí)上調(diào)肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物如波形蛋白、-SMA、纖連蛋白等。例如，宮頸癌患者[9]的腫瘤一旦轉(zhuǎn)移至身體其他部位，預(yù)后明顯變差，研究顯示癌基因AEG1、Sam-68、FTS及miR-361-5p誘導(dǎo)宮頸癌的EMT，而腫瘤抑制因子LMX-1、SFRP1、klotho及 miR-155抑制宮頸癌的EMT，從而影響患者預(yù)后。EMT對卵巢癌[10]的腹膜轉(zhuǎn)移以及無進(jìn)展生存期和總生存期有至關(guān)重要的影響。在膀胱癌，Shh信號可通過激活EMT促進(jìn)腫瘤發(fā)生。另外，EMT在乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等多種癌癥的原發(fā)性浸潤與繼發(fā)性轉(zhuǎn)移中也起著非常重要的作用。

Duangkumpha K研究指出，BMP-7可以通過拮抗TGF-β誘導(dǎo)的EMT過程，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移[1]。另有研究顯示，在膽管癌細(xì)胞中，BMP-7可以抑制N-cadherin的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin表達(dá)，抑制EMT過程，從而抑制膽管細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移[5]。Dorail T等[2]人發(fā)現(xiàn)姜黃素通過上調(diào)BMP-7的表達(dá)可以抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移。該研究結(jié)果顯示給予BMP-7后細(xì)胞黏附分子E-cadherin的表達(dá)略高于生理鹽水組，雖然差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是提示BMP-7有上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，進(jìn)一步提示BMP-7可能逆轉(zhuǎn)H22肝癌細(xì)胞的EMT過程，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

該研究者先前研究[11]指出BMP-7在癌周組織中呈彌漫性或灶性表達(dá)，但在癌結(jié)節(jié)中表達(dá)甚少，這提示BMP-7表達(dá)減少可能是肝細(xì)胞發(fā)生癌變的重要因素之一。另外，體外研究[12]顯示rhBMP-7可能通過磷酸化的Smad1/5/8信號通路明顯減弱肝癌細(xì)胞株Huh7的遷移能力。結(jié)合該研究結(jié)果，進(jìn)一步探討B(tài)MP-7在肝細(xì)胞癌中的作用及其機(jī)制，可能尋找到肝細(xì)胞癌預(yù)防和治療的新靶點(diǎn)。

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Effect of BMP-7 on the Inhibition of the Expression of PCNA and Up-regulation of the Expression of E-cadherin in H 22 Tumor-bearing Mice

PANYu,DINGQin,WANGLi-na,SONGZheng-xia,YANXue-bing
Department of Infectious Disease,Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College,Xuzhou,Jiangsu Province,221006 China

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of bonemorphogenetic protein-7(BMP-7)on H22 tumor-bearingmice. Methods The experiment time is from September 2014 to January 2015.H22 tumor bearingmicemodelwas established,and random ly divided into 3 groups:normal saline group,cyclophosphamide group and the BMP-7 group.The pathological histomorphology of transplanted tumor was observed under a lightmicroscope after hematoxylin-eosin(HE)staining.The expressions of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)were detected by immunohistochemistry.The expressions of alpha smooth muscle actin(alpha-SMA),E-cadherin were detected by reverse transcription-PCR.ResultsItwas found that BMP-7 group had large areas of necrosis and obvious karyorrhexis and karyolysis.The tumor cells of cyclophosphamide group arranged loosely,nucleo cytoplasmic ratio decreased,and the tumor tissue had large areas of necrosis.It was found that the expressions of PCNA in BMP-7 group and cyclophosphamide group were lower than those in normal saline group,the differenceswere statistically significant(F=34.78,P<0.05) by the immunohistochemistry.The expression of E-cadherin in the cyclophosphamide group was the highest,followed by the BMP-7 group,the normal saline group was the lowest(F=7.63,P<0.05).ConclusionBMP-7 can decrease the expression of PCNA in H22 tumor-bearingmice,with the trend of upregulating the expression of E-cadherin.

H22 cell;Hepatocellular carcinomamodel;BMP-7;PCNA

R285.5

A

1674-0742（2015）09（b）－0007-03

潘玉(1989-)，女，山東鄒城人，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：病毒性肝炎與肝臟信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

丁芹(1971-)，女，江蘇徐州人，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：病毒性肝炎與肝臟信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

2015-06-10）