張又枝，黃 琦，任 平

(1.湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學院糖尿病及心腦血管病變湖北省重點實驗室)

人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)在醫(yī)藥學的基礎(chǔ)研究中應(yīng)用廣泛，主要是其比較易得到，而且又具有內(nèi)皮細胞的特征，對疾病的發(fā)病機制的研究極為重要。但是該細胞比較脆弱，極易損傷，在研究中不易得到活力比較好的細胞。Transwell 小室是一種嵌入細胞培養(yǎng)板，其小室底部含有聚碳酸酯膜的材料，亦稱為PET 膜，該膜根據(jù)孔徑不同將其分為不同種的小室，但是共有的特點是其具有通透性，使小室內(nèi)外培養(yǎng)液的成分相互影響，從而影響細胞的生長、運動等。由于其材料的通透性，主要應(yīng)用在共培養(yǎng)體系，趨化性實驗以及腫瘤細胞的遷移實驗中［1～3］。本研究是類似于共培養(yǎng)體系的一種培養(yǎng)方法，選用PET 膜孔徑為0.4μm 的小室，將HUVEC 細胞種于上室，細胞無法通過該孔徑，分泌的因子可以在下室的培養(yǎng)液中檢測出。

1 材料與方法

1.1 標本來源與采集 標本均來自于湖北省咸寧市中心醫(yī)院正常足月妊娠娩出新生兒的臍帶。新生兒娩出后于無菌條件下剪下臍帶(約30～40cm)迅速放入裝有無菌PBS 的容器中，放入冰盒中盡量在2h 內(nèi)移入實驗室，行人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的分離培養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器 ECM 培養(yǎng)基(Science cell);Transwell 培養(yǎng)板(Corning);乙二胺四乙酸(Sigma);胰蛋白酶(Sigma);明膠(Solarbio);青霉素，鏈霉素(Amresco);兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組織化學檢測試劑盒(武漢博士德生物工程公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。CO2細胞培養(yǎng)箱(廈門致微);超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司);倒置熒光顯微鏡(日本Nikon);高壓蒸汽滅菌鍋(廈門致微)。

1.3 方法

1.3.1 胰酶消化法原代培養(yǎng)HUVEC 具體步驟如下 將三通管插入臍靜脈內(nèi)，并予以固定，用注射器吸取PBS 液從三通管的一端注入到臍靜脈中，洗凈臍靜脈內(nèi)的血液，直到流出的液體接近于PBS 的顏色為止;夾閉臍帶另一端，不含EDTA 和含EDTA 的0.25%胰蛋白酶液體(體積比1∶1)沿三通管注入臍靜脈，充滿后關(guān)閉三通管，在超凈臺內(nèi)常溫消化30min;將止血鉗松開，在出口的另一端插入一無菌的塑料管，將注入臍靜脈內(nèi)的胰酶液體引流入已裝有10%FBS 的M199 培養(yǎng)基中，終止胰酶的消化作用;注入10%FBS 的M199 培養(yǎng)基，臍靜脈另一端引流出培養(yǎng)基放于試管中;將收集于試管中的培養(yǎng)基和胰酶液體，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心12min;吸棄上清液，用ECM 培養(yǎng)基(含內(nèi)皮細胞生長因子，ECGS)重懸細胞，種入培養(yǎng)瓶中，靜置培養(yǎng);第二天，用含ECM(含ECGS)的培養(yǎng)基換液，以去除殘余胰酶溶液及未貼壁細胞的影響。

1.3.2 HUVEC 的傳代培養(yǎng)步驟 待細胞融合后，兩瓶細胞分別用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)和0.25%胰蛋白酶(含EDTA)消化，制成單細胞懸液，根據(jù)細胞的多少來決定傳代比例，依細胞活力，將第2～10 代之間的細胞將其傳代到Transwell 小室中用來做進一步的實驗。

1.3.3 細胞免疫熒光技術(shù)對HUVEC 內(nèi)皮細胞標志物Ⅷ因子鑒定 先將細胞種在放有玻片的24孔板或六孔板中貼壁過夜，倒掉培養(yǎng)基，再用PBS溶液清洗細胞兩次，棄掉PBS，最后加4%多聚甲醛適量，固定10min;吸棄多聚甲醛，室溫下PBS洗3 次;吸棄PBS，加入0.125% Triton，室溫下破膜15min;PBS 洗5min ×3 次;5% BSA 或山羊血清封閉25min;加一抗(Ⅷ因子抗體，稀釋度為1∶500)，然后將有一抗的培養(yǎng)皿放于濕盒中，于4℃孵育過夜;加FITC 標記的熒光二抗，37℃下避光孵育1h;PBS 洗滌5min×3 次;加DAPI(染核試劑)室溫孵育2min;PBS 洗5min;熒光顯微鏡下觀察照相并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞鑒定 圖1 是采用細胞免疫熒光化學技術(shù)檢測內(nèi)皮細胞標志物Ⅷ因子，結(jié)果顯示:含有Ⅷ因子的細胞胞漿著綠色，胞核著藍色。該結(jié)果提示通過胰酶消化法所得原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞純度比較高。

圖1 人臍靜脈內(nèi)皮細胞鑒定

2.2 Transwell 小室中HUVEC 內(nèi)皮細胞 結(jié)果表明，用0.25%胰蛋白酶(含EDTA)消化HUVEC細胞成細胞懸液將其種入Transwell 小室中，第2d僅有少許細胞貼壁，細胞形態(tài)較差。時間(大約2min)和溫度(室溫)相同的條件下，用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)消化HUVEC 細胞后，將其種入Transwell 小室中，6h 左右細胞貼壁，至第2d 仍生長良好。

3 討論

人臍靜脈來源豐富，且由于其具有動脈的特性，對于研究血管類疾病例如動脈粥樣硬化等有其特有的優(yōu)勢，但是由于其比較嬌嫩，在一般的培養(yǎng)瓶以及孔板中難培養(yǎng)，其培養(yǎng)條件及方法報道甚多，但是對于特殊支撐材料的培養(yǎng)條件鮮有報道。

本研究首先用胰酶消化法取得原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞，其消化的胰酶的比例以及時間都是本實驗室通過摸索得來的條件。我們用過別人相同的胰酶在室溫下消化10min 但是得到的細胞很少;我們也用過別人的胰酶條件，即0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)或者是單純用0.25%胰蛋白酶(含EDTA)消化［4，5］，但是得到的細胞無論數(shù)量以及狀態(tài)都沒有本文中消化條件0.25%胰蛋白酶+EDTA 液體(1∶1)得到的細胞狀態(tài)和數(shù)量佳。

然后從鑒別方法進行比較，從結(jié)果中得知，用免疫熒光法鑒定內(nèi)皮細胞的標志物Ⅷ因子比用傳統(tǒng)的DAB 方法染色更清晰、明顯的標出陽性細胞(DAB 法結(jié)果未顯示)。DAB 染色的胞漿Ⅷ因子的棕色斑塊容易與背景混淆。綠色熒光在顯微鏡下很容易辨認，圖片對比度更高。最后在特殊材料Transwell 的PET 膜上種植HUVEC 的培養(yǎng)條件也值得借鑒。就本實驗結(jié)果得知，胰酶的選擇是最重要的一個因素，盡量選擇消化能力比較弱的胰酶即0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)，而含EDTA 的胰酶很容易將細胞消化過度，即使在顯微鏡下觀察一樣的時間，其消化過的細胞后來種在Transwell 小室內(nèi)也幾乎不能貼壁，最后死亡全漂浮起來。

總之，人HUVEC 用途廣，而且現(xiàn)階段對于利用特殊支撐材料進行的研究越來越多，本實驗實驗條件的摸索對于該細胞更廣泛的研究應(yīng)用有一定的借鑒意義。

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