吉莉莉，汪開毓*，羅曉波，趙 玲，黃小麗，周 燕

1 四川農(nóng)業(yè)大 學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物疫病與人健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安 625014;2四川省自然資源科學(xué)研究院，成都 610015

辣木(Morniga oleifera Lam.)為辣木科、辣木屬植物，起源于印度北部的亞喜馬拉雅山地帶。印度和非洲國家常用于治療糖尿病、高血壓、心血管病、肥胖癥等疾?。?，2］。近年來，辣木在我國廣東、云南、海南等都有引種栽培。2012 年辣木葉被中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)批準(zhǔn)為新資源食品。目前國內(nèi)外對(duì)辣木葉提取物的研究，證明了辣木葉黃酮類化合物有降低糖耐量、降血糖、降血脂等作用［3-6］。

已報(bào)道的辣木葉黃酮提取有乙醇為溶劑的回流提取法，耗時(shí)長，效率較低，且僅采用正交法優(yōu)化提取工藝［7，8］。微波萃取法用于黃酮類化合物提取時(shí)，具有選擇性高、節(jié)省時(shí)間、溶劑用量少，對(duì)環(huán)境安全無害，提取效率高等優(yōu)點(diǎn)［9］。響應(yīng)面法與正交法相比，能研究幾種因素的交互作用，越來越廣泛地運(yùn)用在解決多變量問題［10］。為此，本文以響應(yīng)面法優(yōu)化辣木葉總黃酮提取工藝，并觀察回流提取與微波萃取總黃酮的體外降糖效果差異，為辣木葉資源開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣木葉粉，購自云南景洪云南省熱帶作物科學(xué)研究所，石油醚8 h 索氏回流去脂;蘆丁，購自中國生物制品檢定所;DMEM 高糖培養(yǎng)基，購自Thermo生物化學(xué)制品(北京)有限公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)，購自Sigma 公司;胎牛血清，購自Thermo 生物化學(xué)制品(北京)有限公司;葡萄糖試劑盒，購自南京建成生物工程研究所有限公司;HepG2 細(xì)胞株，中國科學(xué)院成都生物研究所天然產(chǎn)物中心惠贈(zèng)。

電腦微波超聲波紫外光組合催化合成儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司XH-300UL 型;紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司，UV-1100 型;酶標(biāo)儀，BIO-RAD680 型;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國IKA RV05 型。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按照陳瑞嬌［7］的方法建立蘆丁對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 回流提取辣木葉總黃酮及含量測(cè)定

按上法，準(zhǔn)確稱取樣品30 g，加入70%乙醇，液料比20∶1，60 ℃回流提取3 次，每次1h。提取液濾過，合并濾液，即得回流提取總黃酮(Flavones extract by Reflux Extraction，F(xiàn)RE)。冷卻至室溫后，取濾液1 mL，測(cè)定總黃酮濃度。

1.2.3 微波萃取辣木葉總黃酮及含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取樣品，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件加入溶劑，置微波提取儀中，儀器設(shè)定為微波功率恒定模式，磁力攪拌。反應(yīng)完成后濾過，即得微波萃取總黃酮(Flavones extract by Microwave Extraction，F(xiàn)ME)。冷卻至室溫后取濾液1 mL，按上法測(cè)定總黃酮濃度。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、微波功率、提取時(shí)間、液料比等因素為考察變量，以總黃酮得率F 為響應(yīng)值，應(yīng)用Design-Expert8.0.6 軟件，優(yōu)化微波提取辣木葉總黃酮的工藝條件。響應(yīng)面分析因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素水平Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.5 辣木葉總黃酮體外降糖實(shí)驗(yàn)［11］

1.2.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HepG2 細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10%熱滅活胎牛血清、100 U/mL 青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)液，置37C、5% CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 d 更換1 次培養(yǎng)液，3 d后傳代，傳代數(shù)1∶4。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.5.2 FRE 和FME 對(duì)HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗作用及MTT 毒性試驗(yàn)

將冷凍干燥的FRE 和FME 粉末配制成高濃度水溶液，微孔濾膜濾過后，用無血清DMEM 培養(yǎng)液稀釋至所需濃度待用。將處于良好生長狀態(tài)的HepG2 細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶液消化后，以1×105個(gè)/mL 細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，換無血清培養(yǎng)液饑餓12 h 后，加入含樣或不含樣的高糖培養(yǎng)液。將96 孔培養(yǎng)板中細(xì)胞分為空白對(duì)照組、樣品組，每個(gè)組重復(fù)6 孔，孵育24 h 后用葡萄糖試劑盒(氧化酶法)測(cè)定各孔培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度，采用式(2)計(jì)算葡萄糖的消耗量。

式(2)中，GC:葡萄糖的消耗量，mmol/L;G0:0 h培養(yǎng)液中葡萄糖濃度，mmol/L;G24:24 h 培養(yǎng)液中葡萄糖濃度，mmol/L;

同時(shí)進(jìn)行MTT 毒性試驗(yàn)，在葡萄糖消耗試驗(yàn)孵育結(jié)束，按文獻(xiàn)［11］方法測(cè)定細(xì)胞存活性與數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以SPSS19.0 軟件分析，各組間差異采用LSD 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)各濃度蘆丁對(duì)應(yīng)的吸光值，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線C=0.0817A+0.0018，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。

2.2 回流提取辣木葉黃酮得率

回流后的提取液濾過，總黃酮得率為2.05%，與陳瑞嬌的結(jié)果3.59%差異較大，可能因種植地點(diǎn)、采摘時(shí)間、烘干方式不同等因素造成。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 乙醇濃度的影響

稱取5 份辣木葉粉，每份1g，于微波萃取儀中提取。分別加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇，微波功率200 W，提取時(shí)間6 min，液料比50∶1，結(jié)果見圖1a。由圖1a 可見，乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%時(shí)，提取率最大，而乙醇濃度增加，提取率降低，這是因?yàn)辄S酮糖苷是由甙元成分和糖組成，甙元成分不易溶于水，而糖又易溶于水，乙醇與水達(dá)到最佳比例時(shí)，提取量最大。所以選擇體積分?jǐn)?shù)為60%。

2.3.2 提取時(shí)間的影響

稱取5 份辣木葉粉，每份1 g，加入60%乙醇，微波功率200 W，液料比50∶1，分別按提取時(shí)間6、8、10、12、14 min。結(jié)果見圖1b。由圖1b 可見，隨時(shí)間延長，總黃酮得率升高，當(dāng)提取時(shí)間為8 min 時(shí)，達(dá)到最高，低于8 min 時(shí)，提取不完全，而高于8 min時(shí)，由于溫度隨時(shí)間升高，部分黃酮類化合物可能被破壞，而導(dǎo)致得率下降。因此，選擇提取時(shí)間為8 min。

2.3.3 微波功率的影響

稱取5 份辣木葉粉，每份1 g，加入60%乙醇，液料比50∶1，分別于微波功率100、200、300、400、500 W，提取8 min。結(jié)果見圖1c。由圖1c 可見，隨著提取功率增加，總黃酮得率增加，功率達(dá)到400 W時(shí)最高，高于400 W 時(shí)則下降。這可能是過高功率對(duì)黃酮類化合物活性成分產(chǎn)生破壞導(dǎo)致得率下降。因此，選擇提取功率為400 W。

圖1 乙醇濃度(a)、提取時(shí)間(b)、微波功率(c)及液料比(d)對(duì)總黃酮得率的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration(a)，extraction time(b)，microwave power(c)and liquid-to-solid ratio(d)on the extraction yield of flavones

2.3.4 液料比的影響

稱取5 份辣木葉粉，每份1 g，分別按照30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 加入60%乙醇，微波功率400 W，提取8 min，結(jié)果見圖1d。由圖1d 可見，當(dāng)液料比為60∶1 時(shí)，總黃酮得率最高。因?yàn)橐毫媳炔蛔銜r(shí)，微波加熱速度快，溫度過高，破壞黃酮類化合物;過高時(shí)，微波加熱時(shí)間增長，未達(dá)到提取最佳溫度或保持時(shí)間不足使提取不完全。因此選擇液料比為60∶1。

2.4 響應(yīng)面法對(duì)辣木葉總黃酮微波提取工藝參數(shù)的優(yōu)化

試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2

將所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到辣木葉黃酮得率Y 與微波提取各因素變量的二次回歸方程模型為:

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis

各因素按影響大小排序?yàn)槲⒉üβ蔢2＞醇濃度X1＞提取時(shí)間X3＞液料比X4。為了檢驗(yàn)方程的有效性，對(duì)微波提取總黃酮的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析，并對(duì)各因子的偏向回歸系數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

由表3 可見，該模型極顯著(P＜0.0001);方程一次項(xiàng)中醇濃度X1為影響極顯著(P＜0.001)，提取時(shí)間X3為影響高度顯著(P＜0.01)，其余為不顯著(P＞0.05);方程二次項(xiàng)因素均為影響極顯著(P＜0.001);交互項(xiàng)X1X2、X1X4為影響顯著(P＜0.05)，X2X3、X2X4為影響高度顯著(P＜0.01)，X1X3、X3X4為不顯著。模型失擬項(xiàng)(P=0.1049)表示模型選擇合適。同時(shí)回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9852，說明模型相關(guān)度很好。所以，可以使用該模型來分析響應(yīng)值的真實(shí)變化，可以用其確定最佳提取工藝條件。

表3 回歸模型參數(shù)檢驗(yàn)Table 3 Parameter estimate of regression model

為了進(jìn)一步研究相關(guān)變量交互作用以及確定最優(yōu)點(diǎn)，通過Design Expert8.0.6 軟件繪制響應(yīng)面曲線圖進(jìn)行可視化分析。結(jié)果見圖2。由響應(yīng)面立體圖可知，響應(yīng)值存在最大值，經(jīng)軟件分析計(jì)算，得到辣木葉總黃酮的最佳提取條件:醇濃度58.45%，微波功率397.15 W，提取時(shí)間8.13 min，液料比59∶1，理論提取率為3.49%。對(duì)該條件下進(jìn)行5 次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，總黃酮平均得率為3.45%，試驗(yàn)結(jié)果與模型基本相符，說明該模型能較好地模擬和預(yù)測(cè)辣木葉總黃酮得率。微波萃取與回流提取相比，總黃酮得率由2.05%升至3.45%，增加了68.3%;提取時(shí)間由3 h 縮短至8 min，僅為回流提取的4.44%。主要是因?yàn)槲⒉ㄝ腿∈抢梦⒉ㄊ辜?xì)胞內(nèi)部的溫度迅速升高，壓力增高使細(xì)胞破裂，藥材內(nèi)有效成分流出，并在較低的溫度下溶于萃取液，使提取時(shí)間更短，提取率更高［12］。

2.5 辣木葉總黃酮體外降糖試驗(yàn)

2.5.1 FRE 和FME 對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的影響

以空白對(duì)照為100%計(jì)算，細(xì)胞存活率如圖3所示。MTT 毒性試驗(yàn)表明，F(xiàn)ME 與FRE 濃度在0.125 mg/mL 時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖有一定影響，存活率分別為99.47%及99.90%，其余濃度細(xì)胞存活率均大于100%，表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞增殖。提取物凍干粉末相同質(zhì)量濃度下，F(xiàn)RE 組細(xì)胞存活率均高于FME 組。

圖2 不同變量交互作用對(duì)總黃酮得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.2 Response surface plot and contour line of factors interaction on extraction yield of total flavones

圖3 FME 及FRE 的細(xì)胞毒性Fig.3 Toxicity of FME and FRE

表4 FRE 和FME 對(duì)HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗作用Table 4 The effect of FRE and FME on the glucose consumption of HepG2 cell

2.5.2 FRE 和FME 對(duì)HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗的作用

由表4 可見，三個(gè)濃度的辣木葉黃酮提取物均有增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗作用，并且與空白對(duì)照組相比，用藥組的葡萄糖消耗量顯著增加(P＜0.05)。用MTT 校正，扣除細(xì)胞增殖抑制對(duì)培養(yǎng)液中葡萄糖消耗的影響后，均顯著增加單位細(xì)胞的葡萄糖消耗量。相同質(zhì)量濃度時(shí)，由FME 比FRE 表現(xiàn)出更強(qiáng)的降糖活性，說明了微波萃取方法可能提取的降糖有效成分含量更高。

3 結(jié)論

本研究采用微波萃取法提取辣木葉總黃酮，對(duì)提高辣木葉總黃酮的綜合利用以及黃酮類化合物的產(chǎn)業(yè)化具有理論指導(dǎo)意義。通過響應(yīng)面分析對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，微波萃取的最優(yōu)提取工藝為:乙醇濃度58%，微波功率397 W，提取時(shí)間8 min，液料比59∶1(mL/g)。在此條件下，辣木葉總黃酮得率為3.45%。該方法傳統(tǒng)的回流提取相比，具有耗時(shí)短，提取率高的優(yōu)勢(shì)。

辣木葉黃酮能促進(jìn)HepG2 細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗，與空白組相比具有明顯降糖效果，而微波萃取得到的總黃酮比回流提取得到的總黃酮表現(xiàn)出更強(qiáng)的降糖活性。提示微波萃取法能不僅縮短提取時(shí)間，且能提高辣木葉中降糖活性成分的提取率。

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