仉 旭，吳子健，呂瑜峰

天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134

雞卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(hen Ovotransferrin，hOTF)，又稱(chēng)卵伴白蛋白［1］，是一種非結(jié)晶單亞基糖蛋白，存在于雞蛋卵清中，約占蛋清總蛋白含量的12%～13%，分子量為76Ku，pI 6.0，含有686 個(gè)氨基酸殘基［2］。hOTF 是轉(zhuǎn)鐵蛋白家族中一個(gè)重要的成員［3］，與Fe3+離子有高度親和力，并具有抗菌［4］、抗病毒［5，6］、抗氧化［7］、抗腫瘤［8］以及免疫調(diào)節(jié)等多種活性［9］。本文回顧并總結(jié)了前人的研究成果，從分子組成以及空間結(jié)構(gòu)等方面分析討論該蛋白及其水解產(chǎn)物具有這些生理活性的內(nèi)在原因。

1 結(jié)構(gòu)與抗菌活性

hOTF 可抑制許多革蘭氏陽(yáng)性或陰性菌的生長(zhǎng)，諸如屬于革蘭氏陽(yáng)性菌的變形鏈球菌和蠟樣芽孢桿菌，以及屬于革蘭氏陰性菌的假單胞菌和大腸桿菌;但也有些細(xì)菌對(duì)hOTF 具有一定的抗性，如革蘭氏陰性菌的變形桿菌和克雷伯桿菌等［12，13］。目前對(duì)于hOTF 抗菌性原因的研究較為深入，有多方面的解釋。

圖1 雞卵轉(zhuǎn)鐵蛋白空間結(jié)構(gòu)［10，11］Fig.1 Spacial structure of hOTF

研究者最早提出該蛋白的抗菌機(jī)理在于其能夠螯合Fe3+離子的分子結(jié)構(gòu)。如圖1 所示，天然狀態(tài)的hOTF 由兩個(gè)結(jié)構(gòu)相似的球形端瓣(即N 端瓣與C 端瓣)組成，每個(gè)端瓣又可分為兩個(gè)大小相似的子域(N 端瓣含N1 和N2 子域;C 端瓣含C1 和C2 子域)，且N1 和N2 子域之間以及C1 和C2 子域之間各形成一個(gè)能配位結(jié)合Fe3+離子的縫隙(cleft)。未結(jié)合Fe3+離子時(shí)，裂縫呈開(kāi)放狀;但若在堿性條件下且環(huán)境中存在(或)時(shí)，位于裂縫處的4 個(gè)氨基酸殘基(N 端瓣為Asp60、Tyr92、Tyr191和His250;C 端 瓣 為Asp395、Tyr524、Tyr431 和His592)便與(或)共同作用，可緊密地結(jié)合Fe3+離子(如圖2 所示)，形成空間上呈八面體結(jié)構(gòu)的OTF--Fe3+三元復(fù)合體［14，15］。天然雞卵清的pH 值大于7.0，且hOTF 大多為脫輔基狀態(tài)(即未結(jié)合Fe3+離子的狀態(tài))，因此具有相當(dāng)強(qiáng)的螯合Fe3+離子能力，且一旦結(jié)合則會(huì)使Fe3+離子難以逃逸。1978 年Bullen 等人［16］指出hOTF 等轉(zhuǎn)鐵蛋白螯合金屬離子的作用導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)環(huán)境中的Fe3+離子濃度降低而無(wú)法滿(mǎn)足菌體生長(zhǎng)需要，特別是對(duì)于那些必須有Fe3+離子才能生長(zhǎng)的細(xì)菌;而1981 年Valenti 等人［9］發(fā)現(xiàn)離子能夠有助于hOTF 對(duì)于表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌等微生物的抑制作用，可能也是源于該蛋白螯合Fe3+的原因。

后來(lái)隨著研究的不斷深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)［4，13］hOTF 的抗菌性能也并非僅僅因?yàn)槠洳东@并消除微生物生長(zhǎng)環(huán)境中的Fe3+離子，如:1982 年Valenti 等人［4］的研究表明hOTF 抑制菌株Escherichia coli W1485(E.coli W1485)生長(zhǎng)的活性并不只是由于其剝奪了培養(yǎng)基中的Fe3+離子，hOTF 與E.coli W1485菌體細(xì)胞直接接觸并相互作用也是發(fā)揮其抑菌作用的必要條件，且相互接觸時(shí)間越長(zhǎng)，抑制生長(zhǎng)的效果也越加明顯。1985 年Valenti 等人［17］發(fā)現(xiàn)失去結(jié)合Fe3+能力的hOTF 全蛋白(即每分子結(jié)合兩個(gè)Fe3+離子的hOTF)比脫輔基的hOTF(即未結(jié)合Fe3+離子的hOTF)顯示出更強(qiáng)的抗白色念珠菌(C.albicans 3153 serotype A 和C.albicans 3156 serotype B)的性能，且即使培養(yǎng)基中含有游離的Fe3+離子也無(wú)法促進(jìn)C.albicans 的生長(zhǎng)。綜上，人們認(rèn)為hOTF 的抗菌活性可能源于更為復(fù)雜的機(jī)制，還有其它內(nèi)在原因，如下文所示。

圖2 雞卵轉(zhuǎn)鐵蛋白N 端瓣鐵離子結(jié)合部位結(jié)構(gòu)示意［18］Fig.2 Schematic diagram of the iron-binding site in hOTF N-lobe

hOTF 另一種可能的抗菌機(jī)制在于該蛋白含有抗菌殘基序列。1998 年Ibrahim 等人［19］報(bào)導(dǎo)指出hOTF 對(duì)金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、大腸桿菌等具有抗菌活性，且指出蛋白N 端瓣中的109 位至200 位間的92 個(gè)氨基酸殘基序列(又稱(chēng)為OTAP-92，Ovotransferrin antimicrobial peptide-92)［9］是其所含的抗菌序列，如圖3 所示。

圖3 OTAP-92 氨基酸殘基序列Fig.3 Amino acid residues sequence of OTAP-92

第三種可能的機(jī)制在于:hOTF 可滲透過(guò)細(xì)菌細(xì)胞外膜到達(dá)細(xì)胞內(nèi)膜，并引起細(xì)胞內(nèi)膜對(duì)各種離子滲透選擇性的改變。2003 年Aguilera 等人［20］研究發(fā)現(xiàn)，透過(guò)大腸桿菌細(xì)胞外膜的hOTF 可到達(dá)細(xì)胞內(nèi)膜并導(dǎo)致內(nèi)膜選擇性地透過(guò)K+離子，而對(duì)Na+和H+離子沒(méi)有作用，結(jié)果在未顯著改變pH 梯度的情況下，細(xì)胞內(nèi)膜電位顯著降低(化學(xué)電勢(shì)從-198mV 下降到-56mV)，使原本由電子傳遞鏈與氧化呼吸產(chǎn)能的過(guò)程解偶聯(lián)，這種情況雖未直接殺死細(xì)菌細(xì)胞，但卻使細(xì)菌停止繁殖。

人們?cè)谘芯科淇咕盍Υ笮r(shí)還發(fā)現(xiàn):結(jié)合不同金屬離子的三元復(fù)合物(OTF--金屬離子)具有的抗菌活性大小不同。1987 年Valenti 等人［21］指出螯合Zn2+的hOTF 比螯合其他金屬或脫輔基狀態(tài)的hOTF 具有更強(qiáng)的抗菌活性，可能是由于Zn2+-OTF 復(fù)合物具有特殊活性，但該種特殊活性的深層次原因仍有待進(jìn)一步研究。

2 結(jié)構(gòu)與抗病毒活性

源于雞蛋卵清的hOTF 及其水解肽段具有抗病毒活性，而該活性與蛋白或肽段的結(jié)構(gòu)以及氨基酸序列、序列的位置具有某種特殊的聯(lián)系。

首先hOTF 所具有的結(jié)構(gòu)可能對(duì)其抗病毒活性具有十分重要的作用。hOTF 與乳鐵蛋白(Lactoferrin，Lf)具有49%的同源性［22］以及相似的空間結(jié)構(gòu)(如圖1 和圖4 所示)，Lf 也是由兩個(gè)類(lèi)似的端瓣(N 端瓣和C 端瓣)組成，每個(gè)端瓣也折疊形成兩個(gè)大小相近的子域(N 端瓣含N1 和N2 子域;C 端瓣含C1 和C2 子域)，且子域間各形成一個(gè)Fe3+離子結(jié)合位點(diǎn)。人們很早就發(fā)現(xiàn)Lf 具有抗病毒活性［23，24］，如其可抗單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)1 型和2 型、人類(lèi)巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus)以及艾滋病毒(human immunodeficiency virus)的性能。后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)hOTF 也同樣具有抗病毒的活性，如:2002 年Giansanti 等人［5］的研究顯示hOTF 可抗一種禽類(lèi)皰疹病毒-馬雷克病皰疹病毒(Marek＇s disease virus，MDV)，且活性?xún)?yōu)于牛乳鐵蛋白(Bovine Lactoferrin，BLf)和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白(Serum Transferrin，Trf)，同時(shí)指出其抗病毒效力與該蛋白本身結(jié)合Fe3+離子的程度無(wú)關(guān);并推測(cè)hOTF 抗MDV 病毒的作用是基于蛋白分子可抑制病毒顆粒對(duì)細(xì)胞的吸附作用，進(jìn)而降低細(xì)胞的感染率，阻礙病毒繁殖與復(fù)制，這種推斷與1996 年Marchetti 等人［25］提出的BLf 和人乳鐵蛋白(Human Lactoferrin，HLf)抑制HSV-Ⅰ的機(jī)理十分相似。

圖4 人乳鐵蛋白空間結(jié)構(gòu)［10］Fig.4 Spacial structure of human lactoferrin

其次，該蛋白含有具抗病毒活性的肽段。2005年Giansanti 等人［6］研究發(fā)現(xiàn)源于hOTF 的兩種肽段(如表1 所示)可有效防止MDV 病毒對(duì)雞胚胎纖維母細(xì)胞(chicken embryo fibroblasts)的侵染，并分別與源于BLf 的兩種抗病毒活性肽段(如表1 所示)具有序列同源性，其中hOTF 219-227 與BLf 222-230都含9 個(gè)氨基酸殘基，且有6 個(gè)氨基酸殘基是相同的(即Asp-Gln-Tyr-Glu-Leu-Leu);而hOTF 269-301、hOTF 633-638 與BLf 264-269 都含6 個(gè)氨基酸殘基，且Asp-Leu 和Lys 所在位置相同。對(duì)比后發(fā)現(xiàn)hOTF 219-227、hOTF 269-301 和hOTF 633-638 的抗病毒能力是BLf 222-230 和BLf 264-269 的兩倍，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這些肽段都分布在各自源蛋白分子的表面，但目前這些肽段所含有的帶正電荷氨基酸殘基、疏水性氨基酸殘基以及肽段長(zhǎng)度對(duì)于hOTF 和BLf 蛋白的空間構(gòu)象以及它們所具有的抗病毒活性(包括多肽的抗病毒活性)的作用仍有待進(jìn)一步研究。

表1 牛乳鐵蛋白與雞卵轉(zhuǎn)鐵蛋白抗病毒活性肽段的比較［6］Table 1 Comparison of antiviral activity fragments of bovine lactoferrin and hen ovotransferrin

3 結(jié)構(gòu)與清除自由基、抗氧化活性

hOTF 所具有的清除自由基以及抗氧化性能體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:首先，天然狀態(tài)下hOTF 維持著雞胚發(fā)育早期階段的氧化還原平衡［7，26］，并且2007年Ibrahim 等［7］發(fā)現(xiàn)hOTF 清除氧自由基的能力和超氧化物歧化酶(SOD)相似，且優(yōu)于抗壞血酸或血清白蛋白等目前已知的抗氧化劑;其次，Ibrahim等［7］還發(fā)現(xiàn)結(jié)合了金屬離子的hOTF 比脫輔基的hOTF 本身具有更強(qiáng)的清除自由基的能力，其中結(jié)合了Cu2+離子的hOTF 清除能力最高，其它依次為Mn2+、Fe3+以及Zn2+;第三，hOTF 兩個(gè)端瓣(即N-端瓣和C-端瓣)的清除自由基性能也高于完整的hOTF，特別是N 端瓣的作用，可能原因在于其分子內(nèi)二硫鍵被還原后所引起的hOTF 結(jié)構(gòu)改變［7］，hOTF 是一種對(duì)氧化還原環(huán)境非常敏感的蛋白，還原條件下(如在二硫蘇糖醇等還原劑存在下)會(huì)在不同位點(diǎn)自行裂解，并且還原作用會(huì)導(dǎo)致蛋白內(nèi)部產(chǎn)生一些具還原性的自由巰基(甚至引起蛋白內(nèi)二硫鍵的重排)，這些自由巰基具有極強(qiáng)的清除自由基功能［27］;最后，酶解hOTF 得到的產(chǎn)物清除自由基的能力高于hOTF 本身，2013 年Moon 等［28］研究表明經(jīng)復(fù)合蛋白酶(芽孢桿菌蛋白酶復(fù)合體)、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶或木瓜蛋白酶各自水解得到的OTF 酶解產(chǎn)物所具有的清除超氧陰離子活性比完整的hOTF 高出3.2 至13.5倍。

4 結(jié)構(gòu)與抗腫瘤活性

hOTF 及其水解物具有一定的抗腫瘤活性。2009 年Ibrahim 等人研究表明［8］hOTF 在三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽(tris (2-carboxyethyl)phosphine)還原作用下，肽鏈上特定的位點(diǎn)(如圖5 中箭頭所指的位點(diǎn))發(fā)生巰基關(guān)聯(lián)的自我裂解(thiol-linked autocleavage)，所產(chǎn)生的肽段能抑制人源乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(ATCC HTB-22)和人源結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116(ATCC CCL-247)的生長(zhǎng)，且呈劑量依賴(lài)關(guān)系，但對(duì)正常人源乳腺上皮細(xì)胞(normal human mammary epithelial cells)無(wú)毒害作用。2013 年Moon等人［28］研究發(fā)現(xiàn)hOTF 及其酶解產(chǎn)物(Ovotransferrin enzyme hydrolysates，OTH)可抑制人源肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549(ATCC CCL-185)、人源胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS(ATCC CRL-1739)，人源乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(ATCC HTB-22)、人源肺癌細(xì)胞系SK-MES-1(ATCC HTB-58)、人源喉癌細(xì)胞系Hep-2(ATCC CCL-23)、人源宮頸癌細(xì)胞系HeLa(ATCC CCL-2)以及人源肝母細(xì)胞瘤HepG2(ATCC HB-8065)的生長(zhǎng)，而且存在劑量依賴(lài)關(guān)系，特別是40mg/ml 劑量的hOTF 顯示出對(duì)腫瘤細(xì)胞更高的細(xì)胞毒性。

圖5 雞卵轉(zhuǎn)鐵蛋白N 端瓣與C 端瓣自動(dòng)裂解區(qū)域氨基酸序列［26］Fig.5 Amino acid sequences of autocleavage regions in the N-and C-lobes of hOTF

hOTF 中有四個(gè)較為特殊的三肽模體［26］，分別為N-端瓣的CHT(hOTF 115-117)和HTT(hOTF 210-212)，以及C-端瓣的HST(hOTF 542-544)和CHT(hOTF 454-456)，如圖5 所示。2006 年Ibrahim等人［26］研究表明在硫氧還蛋白系統(tǒng)或二硫蘇糖醇等還原劑的條件下，hOTF 中這四個(gè)三肽模體會(huì)發(fā)生自動(dòng)裂解。其中肽段hOTF 115-211 和肽段hOTF 454-544 所含的半胱氨酸殘基相對(duì)保守，可穩(wěn)定生成兩個(gè)典型的Kringle 結(jié)構(gòu)域，即Kringle N 和Kringle C，如圖6 所示。而hOTF 及其裂解物抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性可能正是源于其結(jié)構(gòu)中的Kringle 結(jié)構(gòu)域(Kringle domain)。Kringle 結(jié)構(gòu)域也稱(chēng)為環(huán)狀結(jié)構(gòu)域，是由3 個(gè)二硫鍵組成的穩(wěn)定的雙環(huán)狀結(jié)構(gòu)域［29］。同時(shí)hOTF 通過(guò)自動(dòng)裂解形成Kringle 結(jié)構(gòu)域的方式與此前已知的纖溶酶原類(lèi)似，源于牛乳的纖溶酶原在癌細(xì)胞分泌的還原酶或其它還原條件下可使自身二硫鍵還原并自動(dòng)裂解形成血管生成抑制因子［30］，血管生成抑制因子由纖溶酶原的Kringle 1-4 和Kringle 5 結(jié)構(gòu)域組成，早先的研究［31，32］證明，血管生成抑制因子中的這些Kringle 結(jié)構(gòu)域［33，34］可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，因?yàn)槠淇赏ㄟ^(guò)與內(nèi)皮細(xì)胞的受體結(jié)合抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而抑制腫瘤新生血管的生成，發(fā)揮抗腫瘤活性［35］。

圖6 雞卵轉(zhuǎn)鐵蛋白中兩個(gè)Kringle 結(jié)構(gòu)域示意圖Fig.6 Schematic diagram of two Kringle domains from hOTF

5 機(jī)構(gòu)與免疫調(diào)節(jié)活性

雞卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(hen egg-white ovotransferrin，hOTF)與雞血清轉(zhuǎn)鐵蛋白(hen serum transferrin，hST)是雞機(jī)體內(nèi)不同合成場(chǎng)所形成的兩種蛋白(hST 在肝臟中合成［5］;hOTF 在輸卵管中合成［36］)，但都是由相同基因編碼得到的氨基酸序列相同的蛋白，同樣具有兩個(gè)可以結(jié)合Fe3+離子的端瓣以及相似的整體構(gòu)象，只是蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)中糖基化修飾有所差異(hST 糖基位點(diǎn)為Asn52［37］;hOTF 糖基位點(diǎn)為Asn473［15］)，并且糖基化的差異可能造成了蛋白中兩個(gè)端瓣的相對(duì)取向的不同。在禽類(lèi)和哺乳類(lèi)動(dòng)物還未分化前的侏羅紀(jì)時(shí)代，轉(zhuǎn)鐵蛋白家族成員同時(shí)要肩負(fù)著Fe3+離子運(yùn)輸和機(jī)體防御功能，如今作為進(jìn)化較先進(jìn)的哺乳動(dòng)物，這兩種功能分別由Trf與Lf 來(lái)承接［5，6］，而禽類(lèi)動(dòng)物中仍然由hOTF 同時(shí)承擔(dān)。

hST 屬于急性期蛋白(acute phase protein，APP)。通常急性期蛋白是一種在炎癥、細(xì)胞損傷等條件下，由促炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)的在肝臟中合成的一類(lèi)參與急性期反應(yīng)的蛋白質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)以及修復(fù)生理平衡等作用［38，39］。hST 與其他轉(zhuǎn)鐵蛋白家族成員同屬于先天免疫系統(tǒng)的組成部分，其表達(dá)水平會(huì)在炎癥或疾病期間有所提升，并通過(guò)免疫調(diào)節(jié)作用平衡生物內(nèi)穩(wěn)態(tài)［9］。2002 年Xie 等人［40］指出，在Escherichia coli(E.coli)、禽痘病毒、呼腸孤病毒、傳染性法氏囊病毒以及傳染性喉氣管炎病毒介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)期間，雞機(jī)體內(nèi)的hST 含量明顯提高。同年Xie 等人［41］又利用hST 分別刺激雞的巨噬細(xì)胞(HD-11 細(xì)胞)和異嗜性白細(xì)胞，均產(chǎn)生了白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)，并增強(qiáng)了呼吸爆發(fā)活性，引發(fā)了異嗜性白細(xì)胞的脫顆?，F(xiàn)象，表明hST 具有介導(dǎo)補(bǔ)體啟動(dòng)、促進(jìn)吞噬作用、產(chǎn)生細(xì)胞因子、并清除炎癥刺激以及恢復(fù)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用。1997 年Otani等人［42］研究發(fā)現(xiàn)hST 可以抑制由細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和植物凝集素(phytohemagglutinin，PHA)誘導(dǎo)的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖，并推測(cè)這種抑制增殖的作用與Fe3+飽和度無(wú)關(guān)，也并非是因?yàn)長(zhǎng)PS 或PHA 等有絲分裂原的失活，而是淋巴細(xì)胞或其輔助細(xì)胞與蛋白分子相互作用的結(jié)果。Rath 等人［43］2009 年的報(bào)導(dǎo)中指出，hST 在雞血清中的波動(dòng)水平與炎癥以及微生物的應(yīng)激相關(guān)，因此hST 可作為一種生物學(xué)標(biāo)記用于診斷小雞機(jī)體發(fā)生的炎癥性疾病。

6 總結(jié)與展望

目前研究者對(duì)于雞卵轉(zhuǎn)鐵蛋白天然存在的結(jié)構(gòu)與其抗菌性能、抗病毒性能等的關(guān)系已有較深入的研究，但對(duì)于其結(jié)構(gòu)與所具有的抗氧化、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)活性的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究，同時(shí)卵轉(zhuǎn)鐵蛋白作為食源性蛋白，在被人類(lèi)食用之前要經(jīng)過(guò)一系列加工過(guò)程，不同加工方法所引起的結(jié)構(gòu)變化與其功能的關(guān)系鮮有報(bào)道，也有待深入探討。

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