郭 健，李銘剛，董 媛，徐 偉，李 艷*

1吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 132013;2 云南大學(xué)云南省微生物研究所，昆明 650091

特殊環(huán)境下生長(zhǎng)的微生物與環(huán)境經(jīng)長(zhǎng)期的相互作用，可能產(chǎn)生具有特殊結(jié)構(gòu)和生理意義的次生代謝產(chǎn)物。特殊生境微生物一直是近年來微生物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。特殊生境微生物的天然產(chǎn)物為新藥的篩選和新型先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供了大量的研究材料。菌株P(guān)-20 分離自云南省錫業(yè)股份有限公司下的錫尾礦土樣，該礦壩土壤樣品經(jīng)電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP-AES)測(cè)定，其金屬質(zhì)量分?jǐn)?shù)為:鐵14.64% ﹑錫0.29% ﹑鉛0.044% ﹑砷0.18%、銅0.12%，pH 值8.64，是重金屬污染的弱堿性環(huán)境，同時(shí)也是“人造”特殊環(huán)境［1］。P-20 的液體發(fā)酵提取物在薄層層析(TLC)板上呈現(xiàn)出較豐富的化學(xué)條帶。本實(shí)驗(yàn)從其發(fā)酵提取物中分離出14個(gè)化合物。根據(jù)理化性質(zhì)和波譜分析，分別鑒定為:司他弗林(1)、布雷非德菌素E (2)、布雷非德菌素H (3)、布雷非德菌素D(4)、(2S，3S)-3，5-二羥基-2-((Z)-4-(羥 甲 基)-8-甲 基-3，7-二 烯-1-基)-2-甲基-3，4，8，9-四氫吡喃并［2，3-e］異吲哚-7(2H)-酮(5)、5-((1R，2R，5R，6R)-2，5-二羥基-7-氧雜二環(huán)［4.1.0］庚烷-2-基)-3-((1S，2S，4aR，6S，8aS)-2，6-二甲基-1，2，4a，5，6，7，8，8a-八氫萘-1-羰基)-4-羥基吡啶-2(1H)-酮(6)、(3s)-6，8 -二羥基-3 -甲基-3，4 -二氫-1H-苯并吡喃-1 -酮(7)、腺苷(8)、4 -羥基苯甲醛(9)、5-氨基-2-羥基苯乙酸甲酯(10)、尿嘧啶核苷(11)、乙酰司他弗林(12)、尼克酰胺(13)、(S)-7-苯甲基-6-甲基-6，7-二氫苯并［6，7］［1，4］二氮雜卓［2，1-b］喹唑啉-5，13-二酮(14)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，化合物2、3 和4 為Brevicompanine 類二酮哌嗪類生物堿，2［2］和3［3］具有抗炎作用和免疫活性;化合物1 和12 具有抗流感病毒作用［4，6］。本實(shí)驗(yàn)采用MTT 法檢測(cè)顯示化合物5 具有一定的抗腫瘤活性，其對(duì)HT-29、A-549 和MCF-7 三種細(xì)胞的ED50分別為21.59、23.45 μg/mL 和37.36 μg/mL。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

質(zhì)譜儀(VG Auto Spec-3000，英國);核磁共振儀(Bruker AV.DRX500，瑞士);高效液相色譜儀(Waters515-2996，美國);真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI，瑞士);柱層析用凝膠(Sephadex LH-20，安瑪西亞生物技術(shù)上海有限公司);柱層析用硅膠(G200～300目，青島海洋化學(xué)工業(yè)制品廠);薄層層析用硅膠GF254(青島海洋化學(xué)工業(yè)制品廠);試劑均為分析純或色譜純。

1.2 菌株來源

菌株于2011年5月分離自云南個(gè)舊大屯錫尾礦礦土，初步鑒定為真菌。微生物樣品保留于云南大學(xué)云南省微生物研究所，由李銘剛老師實(shí)驗(yàn)室提供。菌株編號(hào)為P-20。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

從已活化的菌株斜面上挑取一定量的菌絲，轉(zhuǎn)接到200 mL PDA 液體培養(yǎng)基內(nèi)(500 mL 瓶中);28℃，180 rpm 搖床培養(yǎng)2～3 d，得到種子液。菌體從種子瓶接種到200 mL PDA 液體培養(yǎng)基內(nèi)(500 mL瓶中)，每瓶接種量約20 mL;28 ℃，180 rpm 搖床培養(yǎng)4～5 d。配制培養(yǎng)基均用土壤浸出液(200 g 礦土，1000 mL 水，浸泡3 d 后取上清液)。發(fā)酵總量為100 L。

1.4 提取分離

用濾袋過濾發(fā)酵液，將菌絲體和上清液分開。上清液用乙酸乙酯反復(fù)萃取三次，之后將萃取液在40 ℃條件下濃縮蒸干，得到上清液粗提物。菌絲體則用丙酮浸泡2 d，期間用超聲儀超聲三次，每次超聲持續(xù)時(shí)間為30 min。過濾丙酮浸泡物，保留丙酮浸汁液并加熱濃縮至水溶液;水溶液同樣由乙酸乙酯反復(fù)萃取三次后濃縮蒸干，得到菌絲體胞內(nèi)產(chǎn)物粗提物。經(jīng)TLC 點(diǎn)板分析后，將上清液粗提物和菌絲體粗提物合并，得到總發(fā)酵提取物94 g。采用正相硅膠柱，氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)40∶1、9∶1、和1∶1(v/v)進(jìn)行梯度洗脫。對(duì)9 ∶1(v/v)組分進(jìn)行凝膠柱(Sephadex LH-20)層析后，分成7 組。組分2 經(jīng)硅膠柱層析，氯仿-甲醇(20∶1，v/v)洗脫，高效液相制備色譜進(jìn)行制備，得化合物1(11 mg)和2(15 mg)。組分3 組分經(jīng)硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯(4∶1)洗脫，高效液相制備色譜進(jìn)行制備，得化合物3(12 mg)，化合物4(13 mg)以及5(14 mg)。組分4 經(jīng)硅膠柱層析，石油醚-丙酮(7∶3)洗脫，重結(jié)晶后得化合物7(10 mg)，高效液相制備色譜進(jìn)行制備得化合物6(8 mg)和8(13 mg)。組分5 經(jīng)氯仿-甲醇(9∶1)洗脫，高效液相制備色譜進(jìn)行制備，得化合物9(10 mg)，化合物10(6 mg)以及化合物11(9 mg)。組分6 經(jīng)石油醚-丙酮(65∶35)洗脫，高效液相制備色譜進(jìn)行制備得化合物12(10 mg)和化合物13(13 mg)。組分7 經(jīng)石油醚-乙酸乙酯(6∶4)洗脫，得到三個(gè)組分G7S1～G7S3。G7S3再經(jīng)硅膠柱層析，氯仿-甲醇(20∶1)，高效液相制備色譜進(jìn)行制備得化合物14(10 mg)。

1.5 MTT 法檢測(cè)分離化合物的抗腫瘤活性

利用MTT 法考察部分化合物的抗腫瘤活性。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞HT-29，A-549 和MCF-7 接種于96 孔板(空白組加入等體積的DMEM 培養(yǎng)液)，2 ×104個(gè)/孔，37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。實(shí)驗(yàn)組分別加入100 μL 以無血清培養(yǎng)基配制的不同濃度的樣品溶液至終濃度分別為6.25、12.5、25、50、100 μg/mL;初次活性篩選的化合物終濃度為25 μg/mL。對(duì)照組加入等體積的無血清DMEM 培養(yǎng)液，每組6 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。棄上清，每孔加入0.5 mg/mL 的MTT 100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清，再加入150 μL DMSO，振蕩10 min，測(cè)定OD490，按如下公式計(jì)算抑制率%，并使用Origin 8.0 計(jì)算

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色固體(甲醇);分子式為C23H31NO4;ESI-MSm/z:408［M +Na］+;1H NMR (DMSOd6，500 MHz)δ:1.59～1.23 (2H，m，H-1)，2.36～1.55 (2H，m，H-2)，3.36 (1H，t，J=7.0 Hz，H-3)，1.47(1H，dd，J=13.1，3.2 Hz，H-5)，2.14～1.66(2H，m，H-6)，1.99～1.27 (2H，m，H-7)，1.75(1H，m，H-8)，3.09～2.10 (2H，d，J=17.8 Hz，H-11)，0.93(3H，s，H-12)，0.89 (3H，s，H-13)，1.10(3H，d，J=7.2 Hz，H-14)，0.84 (3H，s，H-15)，6.63(1H，s，H-5')，4.17-4.08 (2H，d，J=16.9 Hz，H-8')，4.48(1H，br s，3-OH)，9.76 (1H，br s，6'-OH)，8.28 (1H，br s，NH);13C NMR (DMSO-d6，125 MHz)δ:23.6(C-1)，25.7(C-2)，72.3(C-3)，37.5(C-4)，44.3(C-5)，23.5(C-6)，27.6(C-7)，39.2(C-8)，37.1(C-9)，83.1(C-10)，32.0(C-11)，30.1(C-12)，26.8(C-13)，16.9(C-14)，20.1(C-15)，112.0(C-1')，147.2(C-2')，120.6 (C-3')，131.7(C-4')，99.1 (C-5')，156.0(C-6')，170.6(C-7')，42.6 (C-8')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致［6］，故確定該化合物為Stachyflin(司他弗林)。

化合物2 白色固體(甲醇，氯仿);分子式為C25H33N3O3;ESI-MSm/z:456 ［M +Na］+;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:3.94 (1H，dd，J=10.0，3.0 Hz，H-3)，6.08(1H，s，H-5a)，8.01(1H，d，J=7.3 Hz，H-7)，7.29(1H，dd，J=7.3，7.3 Hz，H-8)，7.14(1H，dd，J=7.6，7.3 Hz，H-9)，7.26(1H，d，J=7.6 Hz，H-10)，2.61～2.37 (2H，dd，J=12.7，5.7-11.3 Hz，H-12)，3.83(1H，dd，J=11.3，5.7 Hz，H-11a)，2.01-1.55 (2H，dd，14.1，8.9-9.7，H-12)，1.71 (1H，m，H-13)，0.97(3H，d，J=6.6 Hz，H-14)，0.91(3H，d，J=6.6 Hz，H-15)，5.81(1H，dd，J=17.2，10.9 Hz，H-17)，5.12-5.10 (2H，dd，J=10.9-17.2，5.3 Hz，H-18)，0.96(3H，s，H-19)，1.15(3H，s，H-20)，3.53-2.57 (2H，m，H-22)，1.21(3H，t，J=7.4，H-23)，6.16(1H，br s，2-NH);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:169.1(C-1)，108.1(C-3)，179.7(C-4)，116.2(C-5)，139.8(C-6)，211.2(C-7)，54.1(C-8)，37.6(C-9)，31.2(C-10)，36.4(C-11)，34.7(C-12)，43.0(C-13)，43.4(C-14)，131.5(C-15)，132.7(C-16)，32.4(C-17)，18.1(C-18)，23.3(C-19)，70.7(C-1')，60.3(C-2')，57.5(C-3')，67.4(C-4')，25.6(C-5')，31.5(C-6')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致［7］，故確定該化合物為Brevicompanine E。

化合物3 黃綠色固體(甲醇，氯仿);分子式為C24H31N3O3;ESI-MSm/z:432 ［M+Na］+;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:3.94 (1H，d，J=4.1 Hz，H-3)，6.22(1H，s，H-5a)，8.06(1H，d，J=7.3 Hz，H-7)，7.31(1H，dd，J=7.3，7.3 Hz，H-8)，7.12(1H，dd，J=7.6，7.3 Hz，H-9)，7.28(1H，d，J=7.6 Hz，H-10)，2.60～2.28 (2H，dd，J=12.6，5.7-11.6 Hz，H-11)，3.82(1H，dd，J=11.6，5.7 Hz，H-11a)，2.65(1H，m，H-12)，1.05 (3H，d，J=6.8 Hz，H-13)，0.92(3H，d，J=6.8 Hz，H-14)，5.78(3H，dd，J=16.8，11.1 Hz，H-16)，5.14-5.12 (2H，dd，J=16.8，6.0 Hz，H-17)，0.98(3H，s，H-18)，1.16(3H，s，H-19)，3.40-2.63(2H，m，H-21)，1.23(3H，t，J=7.2，H-22)，6.06 (1H，br s，2-NH);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:168.2(C-1)，60.1(C-3)，164.2(C-4)，78.4(C-5a)，143.7 (C-6a)，118.5 (C-7)，129.3(C-8)，124.3(C-9)，124.8(C-10)，132.0(C-10a)，61.1(C-10b)，38.1(C-11)，58.8(C-11a)，29.4(C-12)，19.1(C-13)，16.0(C-14)，40.8(C-15)，143.3(C-16)，114.9(C-17)，23.5(C-18)，33.2(C-19)，173.9(C-20)，28.5(C-21)，9.1(C-22)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致［7］，故確定該化合物為Brevicompanine H。

化合物4 淡黃色油狀(甲醇，氯仿);分子式為C24H33N3O3;ESI-MSm/z:434 ［M+Na］+;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:4.07 (1H，dd，J=8.3，3.6 Hz，H-3)，5.91(1H，s，H-5a)，6.60(1H，d，J=7.8 Hz，H-7)，7.16(1H，dd，J=7.8，7.7 Hz，H-8)，6.78(1H，dd，J=7.7，7.2 Hz，H-9)，7.18(1H，d，J=7.2 Hz，H-10)，2.53～2.35(2H，dd，J=12.5，6.0～11.4Hz，H-11)，4.03(1H，dd，J=11.4，6.0 Hz，H-11a)，1.97～1.66 (2H，dd，J=11.4～14.1，6.0-9.0 Hz，H-12)，1.73 (1H，m，H-13)，0.98(3H，d，J=6.7 Hz，H-14)，0.93(3H，d，J=6.7 Hz，H-15)，5.92(1H，dd，J=16.9，11.0 Hz，H-17)，5.13～5.08(2H，dd，J=16.9，5.6 Hz，H-18)，1.01(3H，s，H-19)，1.10(3H，s，H-20)，4.97～4.86(2H，d，J=10.2，H-21)，3.33(3H，s，H-21)，6.16(1H，br s，2-NH);13C NMR (CDCl3，125 MHz)δ:168.7(C-1)，53.4(C-3)，165.1(C-4)，80.4(C-5a)，149.6(C-6a)，107.0(C-7)，129.2(C-8)，118.7(C-9)，125.4(C-10)，129.8(C-10a)，60.4(C-10b)，38.8(C-11)，58.3(C-11a)，28.4(C-12)，24.2(C-13)，23.3(C-14)，21.3(C-15)，41.3(C-16)，143.2(C-17)，114.6(C-18)，23.1(C-19)，22.6(C-20)，78.5(C-21)，55.7(C-22)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致［7］，故確定該化合物為Brevicompanine D。

化合物5 無色固體(甲醇，氯仿);分子式為C23H31NO5;ESI-MSm/z:424 ［M+Na］+;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:6.78 (1H，s，H-4)，3.01～2.64 (2H，dd，J=17.7，5.7～7.3 Hz，H-7)，3.90(1H，dd，J=7.3，5.7 Hz，H-8)，4.28(2H，br s，H-13)，1.74(2H，m，H-14)，2.30(1H，m，H-15)，5.33(1H，dd，J=7.5，7.5 Hz，H-16)，2.08(2H，m，H-18)，2.06(1H，m，H-19)，5.09 (1H，dd，J=1.3，1.3 Hz，H-20)，1.65(3H，s，H-22)，1.57(3H，s，H-23)，4.11～4.07(2H，d，J=12.4 Hz，H-24)，1.28(3H，s，H-25);13C NMR (CDCl3，125 MHz)δ:174.5(C-2)，132.4(C-3)，101.3(C-4)，158.6(C-5)，113.8(C-6)，27.6(C-7)，68.6(C-8)，80.3(C-9)，150.3(C-11)，124.1(C-12)，44.3(C-13)，39.1(C-14)，22.3(C-15)，129.0(C-16)，139.9(C-17)，36.2(C-18)，27.8(C-19)，125.6(C-20)，132.2(C-21)，25.7(C-22)，17.9(C-23)，60.1(C-24)，18.6(C-25)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致［8］，故確定該化合物為Stachybotrin A{(2S，3S)-3，5-二羥基-2-((Z)-4-(羥甲基)-8-甲基-3，7-二烯-1-基)-2-甲基-3，4，8，9-四氫吡喃并［2，3-e］異吲哚-7(2H)-酮}。

化合物6 白色固體(氯仿);分子式為C24H31NO6;ESI-MSm/z:452［M+Na］+;1H NMR (CDCl3，500 MHz)δ:7.51(1H，d，J=2.8 Hz，H-6)，4.35(1H，dd，J=10.8，6.0 Hz，H-8)，1.50(1H，dd，J=10.8，2.8 Hz，H-9)，1.86～0.78(2H，m，H-10)，1.66～0.97(2H，m，H-11)，1.45(1H，m，H-12)，1.69～0.72(1H，m，H-13)，1.75(1H，m，H-14)，5.30(1H，m，H-15)，5.33 (1H，m，H-16)，2.80(1H，m，H-17)，0.75(3H，d，J=7.3 Hz，H-18)，0.84(3H，d，J=6.3 Hz，H-19)，3.52(1H，d，J=3.3 Hz，H-2')，3.33(1H，dd，J=3.3，2.9 Hz，H-3')，4.06(1H，m，H-4')，1.80～1.31(2H，m，H-5')，2.14～1.68(2H，m，H-6');13C NMR (CDCl3，125 MHz)δ:169.1(C-2)，108.1(C-3)，179.7(C-4)，116.2(C-5)，139.8(C-6)，211.2(C-7)，54.1(C-8)，37.6(C-9)，31.2(C-10)，36.4(C-11)，34.7(C-12)，43.0(C-13)，43.4(C-14)，131.5(C-15)，132.7(C-16)，32.4(C-17)，18.1(C-18)，23.3(C-19)，70.7(C-1')，60.3(C-2')，57.5(C-3')，67.4(C-4')，25.6(C-5')，31.5(C-6')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致［9］，故確定該化合物為Apiosporamide{5-((1R，2R，5R，6R)-2，5-二羥基-7-氧雜二環(huán)［4.1.0］庚烷-2-基)-3-((1S，2S，4aR，6S，8aS)-2，6-二甲基-1，2，4a，5，6，7，8，8a-八氫萘-1-羰基)-4-羥基吡啶-2(1H)-酮}。

化合物7 黃色固體(甲醇，氯仿);分子式為C10H10O4;ESI-MSm/z:217 ［M+Na］+;1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:4.68 (1H，m，H-3)，2.91～2.80(1H，dd，J=11.6，2.8 Hz，H-4)，6.23(1H，s，H-5)，6.18 (1H，s，H-7)，1.38 (3H，d，J=6.3 Hz，H-9);13C NMR (DMSO-d6，125 MHz)δ:169.5(C-1)，75.4(C-3)，33.8(C-4)，142.3 (C-4a)，106.9(C-5)，164.6(C-6)，100.9(C-7)，163.4(C-8)，100.0 (C-8a)，20.3(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致［10］，故確定該化合物為(3s)-6，8 -二羥基-3 -甲基-3，4 -二氫-1H-異色原-1-酮。

化合物8 黃色固體(甲醇);分子式為C10H13N5O4;ESI-MSm/z:290 ［M +Na］+;1H NMR (DMSO-d6，500 MHz)δ:8.12 (1H，s，H-2)，8.34(1H，s，H-8)，5.86 (1H，d，J=6.2 Hz，H-1')，4.59(1H，t，J=5.3 × (2)Hz，H-2')，4.13(1H，m，H-3')，3.95(1H，q，J=3.5 ×(3)Hz，H-4')，3.66-3.55(2H，m，H-5')，7.34(2H，br s，6-NH2);13C NMR (DMSO-d6，125 MHz)δ:152.3(C-2)，149.1(C-4)，119.4(C-5)，156.1(C-6)，139.8(C-8)，87.9(C-1')，73.5(C-2')，70.6(C-3')，85.5(C-4')，61.6(C-5')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致［11］，故確定該化合物為腺苷。

化合物9 淡黃色固體(甲醇，氯仿);分子式為C7H6O2;ESI-MSm/z:155 ［M+Na］+;1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:8.40 (1H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，7.56(1H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)，10.42(1H，s，H-7);13C NMR (DMSO-d6，125 MHz)δ:127.9(C-1)，132.2(C-2，6)，116.1(C-3，5)，164.3(C-4)，190.8 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致［12］，故確定該化合物為對(duì)-羥基苯甲醛。

化合物10 淺黃色油狀(甲醇，氯仿);分子式為C9H11NO3;ESI-MSm/z:204［M+Na］+;1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:3.47 (2H，s，H-2)，6.47(1H，dd，J=8.4，2.7 Hz，H-3')，6.59 (1H，dd，J=8.4，2.7 Hz，H-4')，6.53(1H，d，J=2.7 Hz，H-6')，3.57(3H，s，H-7');13C NMR (DMSO-d6，125 MHz)δ:171.8(C-1)，35.2(C-2)，121.7(C-1')，149.6(C-2')，117.6 (C-3')，115.4 (C-4')，147.8 (C-5')，114.3(C-6')，51.5(C-7')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致［13］，故確定該化合物為5-氨基-2-羥基苯乙酸甲酯。

化合物11 無色油狀(甲醇，氯仿);分子式為C9H12N2O6;ESI-MSm/z:267 ［M+Na］+;1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:5.64 (1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，7.88 (1H，d，J=8.4 Hz，H-6)，5.77 (1H，d，J=5.4 Hz，H-2')，4.01 (1H，m，H-3')，3.95 (1H，m，H-4')，3.83 (1H，m，H-5')，3.57 (2H，m，H-6');13C NMR (DMSO-d6，125 MHz)δ:150.7 (C-2)，163.1(C-4)，101.6 (C-5)，140.6 (C-6)，87.7 (C-2')，73.5 (C-3')，69.8 (C-4')，84.8 (C-5')，60.8 (C-6')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致［14］，故確定該化合物為尿嘧啶核苷。

化合物12 白色固體(甲醇，氯仿);分子式為C25H33NO5;ESI-MSm/z:450 ［M+Na］+;1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:2.09～1.70(2H，m，H-3)，2.39-1.61(2H，m，H-2)，4.67(1H，t，J=7.3 Hz，H-3)，1.57(1H，m，H-5)，1.95-1.74(2H，m，H-6)，2.05-1.34(2H，m，H-7)，1.79(1H，m，H-8)，3.11-2.15(2H，d，J=17.6 Hz，H-11)，1.04(3H，s，H-12)，0.80 (3H，s，H-13)，1.12(3H，d，J=7.3 Hz，H-14)，0.85(3H，s，H-15)，2.07(3H，s，H-17)，6.65(1H，s，H-5')，4.16-4.10(2H，d，J=17.1，H-8')，9.76(1H，br s，6'-OH)，8.28(1H，br s，NH);13C NMR (DMSO-d6，125 MHz)δ:24.1(C-1)，22.7(C-2)，75.1(C-3)，36.4(C-4)，43.5(C-5)，23.0(C-6)，27.2(C-7)，39.0(C-8)，37.2(C-9)，82.6(C-10)，31.8(C-11)，29.7(C-12)，26.1(C-13)，17.0(C-14)，19.8(C-15)，169.8(C-16)，20.8(C-17)，112.1(C-1')，146.9(C-2')，120.7 (C-3')，131.8(C-4')，99.4(C-5')，156.1(C-6')，170.3(C-7')，42.5(C-8')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致［15］，故確定該化合物為Acetylstachyflin(乙酰司他弗林)。

化合物13 淡黃色固體(甲醇);分子式為C6H6N2O;ESI-MSm/z:145［M+Na］+;1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:9.03 (1H，d，J=1.4 Hz，H-2)，8.21(1H，d，J=7.5 Hz，H-4)，7.49 (1H，dd，J=7.5，4.8 Hz，H-5)，9.03(1H，d，J=1.4 Hz，H-6);13C NMR (DMSO-d6，125 MHz)δ:152.0(C-2)，129.7(C-3)，135.2(C-4)，123.5(C-5)，152.0(C-6)，166.6(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致［16］，故確定該化合物為Nicotinamide(尼克酰胺)。

化合物14 黃色固體(甲醇，氯仿);分子式為C24H19N3O2;ESI-MSm/z:404 ［M+Na］+;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.89 (1H，d，J=8.1 Hz，H-4)，7.60(1H，dd，J=8.1，7.2 Hz，H-5)，7.69(1H，dd，J=8.0，7.2 Hz，H-6)，7.73(1H，d，J=8.0 Hz，H-7)，8.28(1H，d，J=7.7 Hz，H-12)，7.64(1H，dd，J=7.7，7.3 Hz，H-13)，7.94(1H，dd，J=8.2，7.3 Hz，H-14)，7.91(1H，d，J=8.2 Hz，H-15)，4.86(1H，dd，J=7.6，7.6 Hz H-19)，3.82-3.41 (2H，dd，J=14.8，7.6 Hz，H-20)，7.40(1H，br d，J=7.4 Hz，H-22，26)，7.28(1H，br t，J=7.4 Hz，H-23，25)，7.23(1H，br d，J=7.4 Hz，H-24)，3.05(3H，s，H-27);13C NMR (CDCl3，125 MHz)δ:130.1(C-4)，129.7(C-5)，131.6(C-6)，129.1 (C-7)，134.5(C-8)，125.4 (C-10)，162.0 (C-11)，123.1 (C-12)，128.4(C-13)，135.8(C-14)，128.8(C-15)，147.5(C-16)，154.1(C-18)，59.6(C-19)，33.6(C-20)，138.5(C-21)，129.8(C-22，26)，129.5(C-23，25)，127.7(C-24)，28.2(C-27)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致［17］，故確定該化合物為Benzomalvin A{(S)-7-苯甲基-6-甲基-6，7-二氫苯并［6，7］［1，4］二氮雜卓［2，1-b］喹唑啉-5，13-二酮}。

2.2 MTT 法檢測(cè)結(jié)果

MTT 法檢測(cè)化合物1～6、12、14(其余化合物無活性)對(duì)HT-29、A-549 和MCF-7 三種細(xì)胞的抑制率如表1 所示。

表1 部分化合物(25 μg/mL)對(duì)三種腫瘤細(xì)胞的抑制率(%，± s)Table 1 Inhibition rates of compounds 1～6，12 and 14 (25 μg/ mL)on three tumor cells (%，± s)

表1 部分化合物(25 μg/mL)對(duì)三種腫瘤細(xì)胞的抑制率(%，± s)Table 1 Inhibition rates of compounds 1～6，12 and 14 (25 μg/ mL)on three tumor cells (%，± s)

結(jié)果顯示，在分離得到的化合物中，化合物5 具有較明顯的抗腫瘤活性。檢測(cè)不同濃度的化合物5對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 化合物5 對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果Fig.1 Inhibition effect of compound 5 on three tumor cells

從圖1 可以看出，對(duì)HT-29 和A-549 細(xì)胞，在6～50 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，隨著化合物5 濃度的增加，抑制率逐漸增強(qiáng)。在濃度為50 μg/mL 時(shí)，抑制率達(dá)到最大值。對(duì)MCF-7 細(xì)胞，在6～100 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，抑制率逐漸隨化合物5 濃度的增加而增強(qiáng)。三種細(xì)胞的ED50分別為21.59 μg/mL、23.45 μg/mL 和37.36 μg/mL。

3 結(jié)論

從錫尾礦真菌P-20 液體發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到14 個(gè)化合物，為錫尾礦真菌次生代謝產(chǎn)物的研究提供信息。經(jīng)MTT 法檢測(cè)到化合物5 有較明顯的抗腫瘤活性。對(duì)于這些化合物的其他活性有待進(jìn)一步研究。

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