邵 杭，梅文莉，李 薇，蓋翠娟，朱國鵬，戴好富*

1海南大學(xué)園藝園林學(xué)院，?？?570228;2 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3 海南省沉香工程技術(shù)研究中心，?？?571101

柳葉擬沉香(Gyrinops salicifoliaRidl)是瑞香科(Thymelaeaceae)擬沉香屬(Gyrinops)的一種常綠喬木，是巴布亞·新幾內(nèi)亞特有樹種［1］。迄今為止，全世界共發(fā)現(xiàn)8 種擬沉香屬植物，主要分布于東南亞地區(qū)以及印度尼西亞群島一帶，與沉香屬(Aquilaria)植物一起被認(rèn)為是能產(chǎn)沉香的物種［2，3］，且均被列入了《瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)附錄Ⅱ。沉香作為傳統(tǒng)名貴藥材和天然香料，具有行氣止痛，溫中止嘔，納氣平喘的功能，可用于治療胸腹脹悶疼痛，胃寒嘔吐呃逆，腎虛氣逆喘急［4］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，沉香具有抗菌［5］、抗癌［6，7］、消炎［8］、神經(jīng)保護(hù)［9，10］和降血糖［11］等功效。目前各國學(xué)者對沉香屬植物所產(chǎn)沉香的化學(xué)成分研究較多，發(fā)現(xiàn)其主要為倍半萜和2-(2-苯乙基)色酮類化合物［12-18］，而對擬沉香屬植物的化學(xué)成分研究甚少，其所產(chǎn)沉香的化學(xué)成分研究還未見報(bào)道。本次研究主要對柳葉擬沉香所產(chǎn)沉香的化學(xué)成分及其藥理活性進(jìn)行研究，利用各種柱色譜和波譜學(xué)方法，共分離鑒定出8 個(gè)2-(2-苯乙基)色酮類化合物，均為首次從擬沉香屬植物所產(chǎn)沉香中分離得到，并采用Elman 比色法對全部化合物進(jìn)行活性測試，結(jié)果表明化合物2～4、7 對乙酰膽堿酯酶具有一定的抑制活性。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

薄層層析硅膠板和柱色譜硅膠(200～300 目)和硅膠H 為青島海洋化工廠產(chǎn)品;Sephadex LH-20為Merck 公司產(chǎn)品;ODS(20～45 μm)為Fuji 公司產(chǎn)品;MS 譜在Autospec-3000 質(zhì)譜儀上測定;NMR用Brucker AV-500 型超導(dǎo)核磁儀測定，以TMS 為內(nèi)標(biāo);N-1000(2L)立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為上海愛朗儀器有限公司;SHZ-D(ш)循環(huán)真空泵為上海隆拓儀器設(shè)備有限公司;DX-2015 低溫循環(huán)機(jī)為北京長流科學(xué)儀器有限公司;BP221S 萬分之一電子秤為北京賽多利斯天平有限公司;乙酰膽堿酯酶(041M7009V)、碘化硫代乙酰膽堿(BCBF0420V)、二硫代二硝基苯甲酸(DNTB)(SHBD2937V)、他克林(07220AV)均購自Sigma 公司;ELX-800 酶標(biāo)儀購自美國寶特公司;超凈工作臺為上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)樣品于2014年12月購買于澳門，經(jīng)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所王軍博士鑒定該沉香的源植物為柳葉擬沉香Gyrinops salicifoliaRidl，憑證標(biāo)本(CX20141222)存放于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。

2 提取與分離

柳葉擬沉香根產(chǎn)沉香(491.1 g)用95%乙醇加熱回流提取三次，減壓濃縮，得到乙醇提取物(177.4 g)，將提取物分散于水中成懸濁液，用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到乙酸乙酯萃取物(141.2 g)，正丁醇萃取物(26.8 g)。乙酸乙酯部分采用硅膠(硅膠H)減壓柱，以氯仿-甲醇(1∶0～0∶1)梯度洗脫，分段收集得到10 個(gè)流分(Fr.1～10)。Fr.2(5.1 g)經(jīng)ODS(甲醇-水=3∶7～1∶0)梯度洗脫，得到14 個(gè)流分(Fr.2-1～Fr.2-14)。Fr.2-7(190.0 mg)經(jīng)Sephadex LH-20(氯仿-甲醇=1∶1)，再經(jīng)反復(fù)硅膠柱(200～300 目)色譜(石油醚-乙酸乙酯=30∶1)洗脫，得到化合物2(11.2 mg)。Fr.2-8(340.0 mg)經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)，再經(jīng)反復(fù)硅膠柱(200～300目)色譜(石油醚-乙酸乙酯=20∶1)洗脫，得到化合物1(5.3 mg)和3(13.5 mg)。Fr.3(7.2 g)經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)，再經(jīng)ODS(甲醇-水=3∶7～1∶0)梯度洗脫，得到19 個(gè)流分(Fr.3-1～Fr.3-19)。Fr.3-5(143.4 mg)經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)，再經(jīng)反復(fù)硅膠柱(200～300 目)色譜(氯仿-甲醇=100∶1)洗脫，得到化合物4(10.4 mg)。Fr.3-6(99.3 mg)經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)，得到Fr.3-6-1(66.0 mg)。Fr.3-6-1(66.0 mg)再經(jīng)反復(fù)硅膠柱(200～300 目)色譜(氯仿-甲醇=200∶1)洗脫，得到化合物8(5.3 mg)。Fr.4(11.5 g)經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)，再經(jīng)ODS(甲醇-水=3∶7～1∶0)梯度洗脫，得到11 個(gè)流分(Fr.4-1～ Fr.4-11)。Fr.4-3(180.9 mg)經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)，再經(jīng)反復(fù)硅膠柱(200～300目)色譜(氯仿-甲醇=100∶1、80∶1)洗脫，得到化合物5(4.1 mg)、6(4.0 mg)和7(6.3 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 無色油狀;ESI-MSm/z273 ［M +Na］+;分子式為C17H14O2;1H NMR (CDCl3，500 MHz)δ:8.21 (1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-5)，7.68(1H，dd，J=7.7，6.0 Hz，H-7)，7.46 (1H，d，J=8.4 Hz，H-8)，7.41 (1H，t，J=7.6 Hz，H-6)，7.28(5H，m，H-2'，H-3'，H-4'，H-5'，H-6')，6.18 (1H，s，H-3)，3.09 (2H，m，H-7')，2.97 (2H，m，H-8');13C NMR (CDCl3，125 MHz)δ:168.5 (C-2)，110.4 (C-3)，178.4 (C-4)，125.1 (C-5)，125.9 (C-6)，133.7(C-7)，118.0 (C-8)，156.6 (C-9)，123.9 (C-10)，139.9 (C-1')，128.8 (C-2'，C-6')，128.4 (C-3'，C-5')，126.7 (C-4')，33.1 (C-7')，36.3 (C-8')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［16］對照基本一致，故鑒定該化合物為2-(2-苯乙基)色酮。

化合物2 黃色粉末;ESI-MSm/z305 ［M +Na］+，281 ［M-H］-;分子式為C17H14O4;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.19 (5H，m，H-2'，H-3'，H-4'，H-5'，H-6')，7.09 (1H，d，J=8.8 Hz，H-7)，6.59(1H，dd，J=8.8，1.2 Hz，H-6)，6.02 (1H，s，H-3)，3.04 (2H，m，H-7')，2.94 (2H，m，H-8');13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:170.1 (C-2)，108.6 (C-3)，183.7 (C-4)，139.6 (C-5)，110.2 (C-6)，121.8 (C-7)，137.1 (C-8)，152.1 (C-9)，110.8 (C-10)，144.8 (C-1')，128.7 (C-2'，C-6')，128.3 (C-3'，C-5')，126.6 (C-4')，32.8 (C-7')，35.9 (C-8')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］對照基本一致，故鑒定該化合物為5，8-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮。

化合物3 黃色粉末;ESI-MSm/z335 ［M +Na］+，311 ［M-H］-;分子式為C18H16O5;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:7.40 (1H，d，J=9.2 Hz，H-7)，7.37 (2H，d，J=9.2 Hz，H-2'，H-6')，7.07(2H，d，J=8.6 Hz，H-3'，H-5')，6.88 (1H，d，J=8.8 Hz，H-6)，6.29 (1H，s，H-3)，4.02 (3H，s，4'-OCH3)，3.30(2H，m，H-8')，3.23 (2H，m，H-7');13C NMR (CD3OD，125 MHz)δ:171.3 (C-2)，109.1(C-3)，184.4 (C-4)，152.4 (C-5)，110.6 (C-6)，122.4 (C-7)，138.0 (C-8)，145.6 (C-9)，111.3 (C-10)，132.3 (C-1')，129.8 (C-2'，C-6')，114.5 (C-3'，C-5')，158.8 (C-4')，55.5 (4'-OCH3)，32.4 (C-7')，36.8 (C-8')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］對照基本一致，故鑒定該化合物為5，8-二羥基-2-［2-(4-甲氧基苯)乙基］色酮。

化合物4 淡粉色粉末;ESI-MSm/z305［M +Na］+，281 ［M-H］-;分子式為C17H14O4;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:7.25 (4H，m，H-2'，H-3'，H-5'，H-6')，7.17 (1H，m，H-4')，6.87 (1H，d，J=2.8 Hz，H-5)，6.77 (1H，d，J=2.6 Hz，H-7)，6.06(1H，s，H-3)，3.10 (2H，m，H-7')，2.98 (2H，m，H-8');13C NMR (CD3OD，125 MHz)δ:170.7 (C-2)，109.6 (C-3)，180.7 (C-4)，99.1 (C-5)，156.2 (C-6)，109.6 (C-7)，148.9 (C-8)，142.2 (C-9)，125.7(C-10)，141.3 (C-1')，129.5 (C-2'，C-6')，129.4(C-3'，C-5')，127.3 (C-4')，33.9 (C-7')，37.2 (C-8')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［17］對照基本一致，故鑒定該化合物為6，8-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮。

化合物5 無色油狀;ESI-MSm/z335 ［M +Na］+，311 ［M-H］-;分子式為C18H16O5;1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:9.72 (1H，s，4'-OH)，9.21(1H，s，6-OH)，7.24 (1H，s，H-5)，7.13 (1H，s，H-8)，7.03 (2H，d，J=8.4 Hz，H-2'，H-6')，6.66(2H，d，J=8.4 Hz，H-3'，H-5')，6.03 (1H，s，H-3，)，3.90 (3H，s，7-OCH3)，2.87 (4H，m，H-7'，H-8');13C NMR (DMSO-d6，125 MHz)δ:167.8 (C-2)，108.8 (C-3)，176.1 (C-4)，107.2 (C-5)，144.9(C-6)，153.5 (C-7)，100.4 (C-8)，151.0 (C-9)，116.5 (C-10)，130.2 (C-1')，129.2 (C-2'，C-6')，115.2 (C-3'，C-5')，155.7 (C-4')，31.4 (C-7')，35.3 (C-8')，56.2 (7-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］對照基本一致，故鑒定該化合物為6-羥基-7-甲氧基-2-［2-(4-羥基苯)乙基］色酮。

化合物6 淡黃色粉末;ESI-MSm/z365［M +Na］+，341 ［M-H］-;分子式為C19H18O6;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.63 (1H，s，H-5)，7.37 (1H，s，H-8)，7.02 (1H，d，J=1.87 Hz，H-2')，6.96(1H，d，J=8.00 Hz，H-6')，6.91 (1H，dd，J=8.03，1.94 Hz，H-5')，6.34 (1H，s，H-3)，4.27 (3H，s，6-OCH3)，4.01 (3H，s，4'-OCH3)，3.26 (2H，m，H-7')，3.22 (2H，m，H-8');13C NMR (CDCl3，125 MHz)δ:170.9 (C-2)，109.9 (C-3)，180.1 (C-4)，108.4 (C-5)，148.9 (C-6)，155.6 (C-7)，100.8 (C-8)，153.7 (C-9)，117.8 (C-10)，132.9 (C-1')，116.2 (C-2')，146.6 (C-3')，146.0 (C-4')，113.2(C-5')，121.9 (C-6')，33.9 (C-7')，37.4 (C-8')，57.0 (6-OCH3)，56.3 (4'-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］對照基本一致，故鑒定該化合物為6-甲氧基-7-羥基-2-［2-(3-羥基-4-甲氧基苯)乙基］色酮。

化合物7 淡黃色油狀;ESI-MSm/z365［M +Na］+，341 ［M-H］-;分子式為C19H18O6;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.65 (1H，s，H-5)，6.89 (1H，s，H-8)，6.81 (1H，d，J=2，4 Hz，H-2')，6.78 (1H，d，J=8.2 Hz，H-5')，6.67 (1H，dd，J=8.2，2.4 Hz，H-6')，6.10 (1H，s，H-3)，4.03 (3H，s，7-OCH3)，3.88 (3H，s，4'-OCH3)，2.97 (2H，t，J=2.8 Hz，H-7')，2.87 (2H，t，J=3.3 Hz，H-8');13C NMR (CDCl3，125 MHz)δ:167.9 (C-2)，109.7 (C-3)，177.9 (C-4)，108.4 (C-5)，145.8 (C-6)，152.1(C-7)，99.2 (C-8)，152.1 (C-9)，117.9 (C-10)，133.2 (C-1')，114.6 (C-2')，144.0 (C-3')，145.4(C-4')，110.9 (C-5')，119.8 (C-6')，32.6 (C-7')，36.3 (C-8')，56.6 (7-OCH3)，56.1 (4'-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］對照基本一致，故鑒定該化合物為6-羥基-7-甲氧基-2-［2-(3-羥基-4-甲氧基苯)乙基］色酮。

化合物8 淡黃色粉末;ESI-MSm/z335［M +Na］+，311 ［M-H］-;分子式為C18H16O5;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:7.44 (1H，d，J=9.0 Hz，H-8)，7.40 (1H，dd，J=3.1，1.7 Hz，H-5)，7.24 (1H，ddd，J=9.1，3.0，1.5 Hz，H-7)，6.79 (1H，d，J=2.2 Hz，H-2')，6.70 (1H，d，J=8.2 Hz，H-5')，6.64(1H，ddd，J=8.2，4.1，2.0 Hz，H-6')，6.11 (1H，s，H-3)，3.82 (3H，s，3'-OCH3)，2.96 (4H，m，H-7'，H-8');13C NMR (CD3OD，125 MHz)δ:171.0 (C-2)，109.6 (C-3)，180.5 (C-4)，108.7 (C-5)，155.9 (C-6)，124.3 (C-7)，120.3 (C-8)，151.8 (C-9)，124.9(C-10)，133.8 (C-1')，112.6 (C-2')，147.2 (C-3')，147.3 (C-4')，116.2 (C-5')，120.2 (C-6')，33.2 (C-7')，37.1 (C-8')，56.4 (3'-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［18］對照基本一致，故鑒定該化合物為6-羥基-2-［2-(3-甲氧基-4-羥基苯)乙基］色酮。

4 活性檢測

用Elman 法［19］測定化合物1～8 和乙酸乙酯萃取物的抗乙酰膽堿酯酶活性。待測樣品均用DMSO進(jìn)行溶解。取110 μL 磷酸緩沖液(pH 8.0)，10 μL待測樣品(50 μg/mL)和40 μL 乙酰膽堿酯酶(0.02 μg/mL)于96 孔板中，溫育20 min(30 ℃)，之后加入DTNB(2.48 mg/mL)和碘化硫代乙酰膽堿(1.81 mg/mL)等體積混合液20 μL，反應(yīng)體系總共200 μL，30 min 后，405 nm 處酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。陽性對照為他克林，反應(yīng)終濃度為0.08 μg/mL，陰性對照為DMSO，反應(yīng)終濃度為0.1%，實(shí)驗(yàn)3 次重復(fù)。按照(E-S)/ E × 100% 來計(jì)算化合物對乙酰膽堿酯酶的抑制率(E 為陰性對照平均吸光值，S 為待測樣品的平均吸光值)。測試結(jié)果(見表1)表明，乙酸乙酯萃取物和化合物2～4、7 對乙酰膽堿酯酶具有一定的抑制活性。

表1 乙酸乙酯萃取物與化合物1-8 的乙酰膽酯酶抑制活性(濃度:50 μg/mL)Table 1 AChE inhibitory activity of EtOAc extract and compounds 1-8 at 50 μg/mL

5 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)采取多種色譜技術(shù)，從柳葉擬沉香所產(chǎn)沉香中分離得到了8 個(gè)2-(2-苯乙基)色酮類化合物，均為首次從擬沉香屬植物所產(chǎn)沉香中分離得到。乙酰膽堿脂酶抑制活性測試結(jié)果顯示，化合物2～4、7 對乙酰膽堿酯酶具有一定的抑制活性。

本次研究發(fā)現(xiàn)2-(2-苯乙基)色酮類化合物是柳葉擬沉香所產(chǎn)沉香的一類主要化學(xué)成分，與沉香屬植物所產(chǎn)沉香的主要化學(xué)成分類別一致。2-(2-苯乙基)色酮類化合物是評價(jià)沉香品質(zhì)的主要成分之一［20］，本次研究結(jié)果豐富了擬沉香屬植物所產(chǎn)沉香的化學(xué)成分，不僅為更好地探索擬沉香屬植物結(jié)香機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)，也為該屬植物及其所產(chǎn)沉香的開發(fā)和利用提供了科學(xué)依據(jù)。

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