葉實(shí)明關(guān)兵徐英冀德君

·研究生園地·

CCL2在變應(yīng)性鼻炎患者鼻黏膜組織中的差異表達(dá)*

葉實(shí)明1關(guān)兵1徐英2冀德君2

目的探討趨化因子CCL2在變應(yīng)性鼻炎發(fā)病過程中的作用。方法參照變應(yīng)性鼻炎評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，留取2例變應(yīng)性鼻炎手術(shù)者部分下鼻甲組織及1例正常鼻甲組織作為對(duì)照，進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并進(jìn)行差異表達(dá)分析。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，趨化因子CCL2表達(dá)上調(diào)，其所參與KEGG通路中相關(guān)聯(lián)基因表達(dá)上調(diào)的主要有：CXCL12、CXCL14、IL-6及EGF；涉及的主要信號(hào)通路有細(xì)胞因子與受體作用、趨化因子信號(hào)傳導(dǎo)及NOD樣受體信號(hào)通路等；相關(guān)的下調(diào)基因主要有：CXCL9、IL-8、AP1及LIF等，涉及的主要信號(hào)通路有B細(xì)胞、T細(xì)胞受體信號(hào)等通路，相關(guān)差異基因多與炎性及細(xì)胞生長增殖等反應(yīng)有關(guān)。結(jié)論CCL2在變應(yīng)性鼻炎患者鼻黏膜中表達(dá)增強(qiáng)，可能是變應(yīng)性鼻炎發(fā)病及向鼻息肉增生轉(zhuǎn)變的主要因素。

變應(yīng)性鼻炎；趨化因子CCL2；差異表達(dá)；鼻息肉

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis,AR）是一種發(fā)病廣泛、呈全球蔓延的鼻腔變態(tài)反應(yīng)疾病，嚴(yán)重困擾著人們生活、工作和學(xué)習(xí)，影響全球約30%的成人和40%的兒童[1]。AR屬于IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，致病原因主要涉及環(huán)境及遺傳兩個(gè)方面。趨化因子CCL2是第一個(gè)被鑒定出的CC類趨化因子，其分子結(jié)構(gòu)包括23個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽和76個(gè)氨基酸組成的成熟肽。最初對(duì)CCL2的研究主要是針對(duì)其對(duì)粒細(xì)胞趨化作用，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)在變態(tài)反應(yīng)、腎病、炎性腸病、免疫缺陷性疾病、血腦屏障通透性相關(guān)疾病、動(dòng)脈粥樣硬化和腫瘤等疾病過程中都發(fā)揮重要作用，而目前尚未見以RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序手段探究CCL2在AR發(fā)病中作用的研究報(bào)道。本研究進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，根據(jù)樣本的各基因表達(dá)情況，進(jìn)行差異表達(dá)分析，對(duì)照在線數(shù)據(jù)庫，獲得相應(yīng)基因的注解，通過進(jìn)一步分析各趨化因子基因與其它主要的AR應(yīng)答基因之間的關(guān)聯(lián)性，探討趨化因子CCL2在AR發(fā)病中的作用機(jī)制。

材料與方法

1 一般資料

收集2014年1月至2014年3月，在江蘇省蘇北人民醫(yī)院耳鼻咽喉科住院行手術(shù)治療的AR患者2例（男女各1例，年齡分別為43歲和46歲），診斷按照“2009年武夷山指南”[2]。另選取行單純鼻中隔偏曲矯正的患者1例（男，48歲）為對(duì)照組。全部病例術(shù)前詳細(xì)詢問病史，行鼻內(nèi)鏡檢查了解黏膜有無蒼白水腫、有無鼻息肉，行變應(yīng)原皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)檢測(cè)致敏原。本研究取材在取得患者本人知情同意的前提下進(jìn)行，術(shù)前3周內(nèi)均未用抗組胺藥及皮質(zhì)類固醇激素等藥物。

2 標(biāo)本收集

AR標(biāo)本2例，患者除AR癥狀外不伴有其它鼻部疾病，術(shù)中在鼻內(nèi)鏡直視下鉗取少許下鼻甲黏膜組織。對(duì)照組1例，術(shù)中在鼻內(nèi)鏡直視下鉗取部分下鼻甲黏膜組織。取下的標(biāo)本組織去除血跡后，放入凍存管后并立即置于液氮中，后轉(zhuǎn)入—70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 總RNA提取

分別取AR患者及對(duì)照者下鼻甲冰凍組織約100mg，運(yùn)用Trizol法提取組織總RNA，步驟如下：將組織放入預(yù)冷的研缽中徹底研碎呈粉末狀，加入Trizol試劑，勻漿液靜置后按照5∶1比例加入氯仿室溫靜置后離心15min，取上層水相置于新離心管中，按2∶1比例加入異丙醇室溫靜置再次離心10min，棄上清，加入等量的75%乙醇進(jìn)行洗滌，渦旋混合后離心5min，棄上清，讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥（5~10min），用RNase-free water溶解RNA沉淀，將提取好的總RNA經(jīng)檢測(cè)合格后，放置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 RNA序列測(cè)定及分析

按照Illumina公司提供的標(biāo)準(zhǔn)操作程序執(zhí)行，包括樣本制備實(shí)驗(yàn)和測(cè)序?qū)嶒?yàn)，實(shí)驗(yàn)中保證每個(gè)樣品測(cè)序產(chǎn)生不少于5M的原始reads序列，保證Q30達(dá)到80%，并將reads序列與參考基因序列的比對(duì)分析，使用Bowtie軟件將各樣品測(cè)序得到的reads與物種Unigenes進(jìn)行比對(duì)，在比對(duì)過程中，對(duì)于比對(duì)到多個(gè)位置的情況，則會(huì)輸出前200個(gè)比對(duì)結(jié)果。然后根據(jù)比對(duì)信息并利用Cufflinks/RSEM[3]進(jìn)行表達(dá)量水平估計(jì)。最后，利用RPKM值[4]（Reads Per Kb per Million reads）來反映對(duì)應(yīng)Unigenes的表達(dá)豐度，RPKM能消除基因長度和測(cè)序量差異對(duì)計(jì)算基因表達(dá)的影響，通過RPKM量化基因的表達(dá)水平，計(jì)算得到的基因表達(dá)量可直接用于比較不同樣品間的基因，進(jìn)而篩選出有差異表達(dá)的基因。檢測(cè)差異表達(dá)基因時(shí)，以樣品類型為依據(jù)選取合適的差異基因分析軟件，DESeq[5]適用于有生物學(xué)重復(fù)的樣品進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選，對(duì)于沒有生物學(xué)重復(fù)的樣品選擇EBSeq[6]進(jìn)行差異表達(dá)分析。在差異基因篩選中，選取FDR＜0.01且Flod Change≥2作為標(biāo)準(zhǔn)。這里FDR（False discovery rate）表示錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率，它是通過對(duì)P值進(jìn)行校正得到的。因?yàn)镽NASEQ中的差異基因分析是對(duì)大量的基因進(jìn)行獨(dú)立的統(tǒng)計(jì)假設(shè)檢驗(yàn)，它會(huì)導(dǎo)致總體假陽性偏高的問題，故在差異軟件進(jìn)行差異分析過程中，我們都會(huì)采用Benjamini-Hochberg校正方法對(duì)原有假設(shè)檢驗(yàn)得到的P值進(jìn)行校正，最終采用FDR作為差異基因篩選取的關(guān)鍵指標(biāo)。

3.3 基因功能比對(duì)注釋

使用BLAST[7]軟件對(duì)差異表達(dá)基因序列與KEGG[8]數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，獲得差異表達(dá)基因的注釋信息。

結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)其中一例AR患者獲得差異表達(dá)基因376條，與對(duì)照組相比較，AR組253條基因至少上調(diào)2倍，123條基因下調(diào)至少50%；另一例AR患者獲得差異表達(dá)基因659條，與對(duì)照組相比較，AR組274條基因至少上調(diào)2倍，385條基因下調(diào)至少50%（表1）。

表1 樣品間的差異表達(dá)基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)表

進(jìn)一步將差異表達(dá)基因與KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)比分析（圖1），得出趨化因子CCL2及其參與的KEGG通路中相關(guān)上調(diào)表達(dá)基因主要有：CCL2、CXCL12、CXCL14、IL-6和EGF，涉及的主要信號(hào)通路有細(xì)胞因子及受體相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）、趨化因子信號(hào)通路（chemokine signaling pathway）及 NOD樣受體信號(hào)通路（NOD-like receptor signaling pathway）；相關(guān)的下調(diào)基因主要有：CXCL9、IL-8、AP1和LIF等，涉及的主要信號(hào)通路有B cell、T cell受體信號(hào)通路等，相關(guān)差異基因多與細(xì)胞生長、增殖及免疫等炎性反應(yīng)有關(guān)。

圖1 差異基因KEGG富集散點(diǎn)圖

而且，對(duì)照基因表達(dá)量表我們得出，在細(xì)胞因子及受體相互作用通路中各差異表達(dá)因子對(duì)應(yīng)的基因編碼及其RPKM值（表2），根據(jù)各分組RPKM值得出細(xì)胞因子差異表達(dá)對(duì)比圖（圖2）。

表2 細(xì)胞因子及受體相互作用通路中各差異表達(dá)因子及對(duì)應(yīng)RPKM值

圖2 細(xì)胞因子及受體相互作用通路中細(xì)胞因子差異表達(dá)情況對(duì)比表中E1為對(duì)照組，E2和E3為AR組

表2和圖2中顯示CCL2、IL-6和EGF均顯示表達(dá)上調(diào)，且其中一例AR患者（E3組）CXCL12及CXCL14表達(dá)也增強(qiáng)，提示CCL2、CXCL12、CXCL14及IL-6的mRNA量比對(duì)照組增高，而CXCL9、IL-8及LIF均顯示表達(dá)下調(diào)，提示CXCL9、IL-8及LIF的mRNA量比正常對(duì)照組下降。

同時(shí)，結(jié)合基因表達(dá)量表與KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)比分析結(jié)果，CCL2、IL-6及IL-8等在NOD樣受體信號(hào)通路中也存在差異表達(dá)，各差異表達(dá)因子對(duì)應(yīng)的基因編碼及其RPKM值（表3），根據(jù)各分組RPKM值我們得出細(xì)胞因子差異表達(dá)對(duì)比圖（圖3）。

表3 NOD樣受體信號(hào)通路中各差異表達(dá)因子及對(duì)應(yīng)RPKM值

圖3 NOD樣受體信號(hào)通路中細(xì)胞因子差異表達(dá)情況對(duì)比表中E1為對(duì)照組，E2和E3為AR組

以上表3和圖3中顯示CCL2和IL-6表達(dá)均上調(diào)，而其中一例AR患者（E2組）同時(shí)伴有IL-8的表達(dá)下調(diào)，另一例（E3組）則伴有JNK的表達(dá)下調(diào)。

討論

CCL2原名為單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1），目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的單核細(xì)胞趨化蛋白還有4種，分別為MCP-2（CCL8）、MCP-3（CCL7）、MCP-4（CCL13）及MCP-5（CCL12），而與AR有關(guān)的主要是MCP-1、MCP-3、MCP-4及Christodou1opou1os等[9]。用免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)MCP-1、MCP-3和MCP-4在鼻黏膜的表達(dá)定位于上皮細(xì)胞內(nèi)。在鼻黏膜刺激實(shí)驗(yàn)前后MCP-3和MCP-4的表達(dá)有顯著差異，而MCP-1差異不明顯，鼻黏膜上皮中MCP-1表達(dá)細(xì)胞主要是單核巨噬細(xì)胞，其次是T細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞。Fujikura等[10]發(fā)現(xiàn)組胺能誘導(dǎo)AR患者鼻黏膜中CCL類趨化因子（包括MCP-1、MCP-3、Eotaxin、RANTES）的表達(dá)，提示可能存在一個(gè)組胺-MCPs軸，在AR發(fā)病中起著重要作用。變應(yīng)原刺激局部鼻黏膜后，產(chǎn)生的包括MCPs在內(nèi)的各種趨化因子增加，誘導(dǎo)各種炎性細(xì)胞（如單核巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等）在鼻黏膜及黏膜下聚集，當(dāng)再次受到變應(yīng)原刺激后產(chǎn)生大量的以組胺為主的炎性遞質(zhì)，導(dǎo)致鼻黏膜變態(tài)反應(yīng)發(fā)生，同時(shí)也誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的趨化因子（MCPs等），從而形成一個(gè)惡性循環(huán)，使AR癥狀的加重和反復(fù)的發(fā)作。

細(xì)胞因子及受體相互作用滲透到AR的多個(gè)環(huán)節(jié)，如Thl/Th2失衡及二大類細(xì)胞因子的相互調(diào)節(jié)、AR的致敏及激發(fā)階段。在這個(gè)過程中，本研究的IL-6高表達(dá)、IL-8的低表達(dá)與Thl/Th2失衡學(xué)說中Th2類細(xì)胞因子優(yōu)勢(shì)表達(dá)相符合，EGF是一類廣泛存在于人和動(dòng)物體內(nèi)、可促進(jìn)或抑制多類細(xì)胞生長的多肽。國內(nèi)有關(guān)研究提示[11]，EGF可促進(jìn)鼓膜纖維層血管增生以促進(jìn)鼓膜穿孔的愈合。有研究[12]發(fā)現(xiàn)，EGF和EGFR在慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者鼻竇黏膜中均有明顯表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)組中EGF和CCL2等因子的高表達(dá)提示AR與鼻息肉可能存在一定相關(guān)性。

Bogefors等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在人類鼻腔中存在三種NOD樣受體（Nodl、Nod2和Nalp3）。AR患者在花粉過敏季節(jié)，Nodl和Nalp3的表達(dá)下調(diào)，而Nod2的表達(dá)無差異。Shin等[14]通過AR動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)證明，Nodl的配體可以增強(qiáng)變應(yīng)原特異性Th2的應(yīng)答，但Th2細(xì)胞因子對(duì)Nodl的表達(dá)卻有抑制作用。本次實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR檢測(cè)提示，與對(duì)照組比較，AR患者鼻甲組織中CCL2的mRNA表達(dá)量顯著增加，進(jìn)一步對(duì)照KEGG在線數(shù)據(jù)庫結(jié)果提示在趨化因子CCL2參與的NOD樣受體信號(hào)通路，同時(shí)伴有Th2類細(xì)胞因子IL-6表達(dá)上調(diào)，其中一例AR患者顯示JNK及Th1類細(xì)胞因子IL-8表達(dá)下調(diào)。我們推測(cè)，CCL2參與AR的發(fā)病過程，可能在NOD樣受體信號(hào)通路中起某種作用。

CXCL12又名SDF-α/β，其受體是 CXCR4。CXCL12與CXCR4相互作用形成CXCL12/CXCR4軸，在AR發(fā)病中起著一定的作用。Gonzalo等[15]通過對(duì)鼠科動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn)如下證據(jù)支持CXCL12/ CXCR4軸與變應(yīng)性氣道疾病相關(guān)：①變應(yīng)性炎癥的嚴(yán)重程度與CXCR4細(xì)胞數(shù)量存在相關(guān)性；②應(yīng)用抗CXCR4抗體或抗CXCL12抗體都能抑制變應(yīng)性炎癥反應(yīng)；③變應(yīng)性氣道疾病局部的白細(xì)胞中存在CXCR4的過度表達(dá)。而Eddleston等[16]研究人變應(yīng)性氣道疾?。ㄏ癆R）中CXCL12/CXCR4軸的作用，發(fā)現(xiàn)CXCL12和CXCR4在疾病發(fā)病期患者鼻黏膜及肺的Ⅱ型呼吸上皮中的表達(dá)都比正常人明顯增高，說明CXCL12/CXCR4軸在人類變應(yīng)性氣道疾病的發(fā)病中很可能也起著重要作用。

CXCL14是趨化因子CXC家族的一個(gè)新成員，最早是由Hromas于1999年從人類乳腺和腎臟組織中分離克隆出來的，定位于染色體5q31。CXCLl4在正常組織中主要表達(dá)于表皮、腎臟、小腸和肝臟，近年學(xué)者們發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤細(xì)胞及組織中表達(dá)異常，且其表達(dá)存在組織特異性[17]。

同時(shí)，我們也注意到，對(duì)于在同類研究中多次報(bào)道的嗜酸粒細(xì)胞的特異性趨化因子Eotaxin及另一種對(duì)嗜酸粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞都有趨化作用的趨化因子RANTES（CCL5）在本次試驗(yàn)過程并未出現(xiàn)陽性結(jié)果，可能與實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采取部位、實(shí)驗(yàn)中男女對(duì)照陽性標(biāo)準(zhǔn)不同、病變的個(gè)體差異及AR本身復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，對(duì)此值得進(jìn)一步探討。

1 Brozek JL,Bousquet J,Baena-Cagnani CE,et al.Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma (ARIA)guidelines: 2010 revision.J Allergy Clin Immunol,2010,126:466-476.

2 Zhang.L,Han D,Huang D,et al.Prevalence of self-reported allergic rhinitis in eleven major cities in china.Int Arch Allergy Immunol,2009,149:47-57.

3 Trapnell C,Williams BA,Pertea G,et al.Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.Nat Biotechnol,2010,28:511-515.

4 Mortazavi A,Williams BA,McCue K,et al.Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.Nat Methods,2008.5:621-628.

5 Anders S,Huber W.DESeq¨C Digital gene expresion analysis based on the negative binomial distribution.Nature Proceedings,http://precedings.nature.com/documents/4282/version/2.

6 Leng N,Dawson JA,Thomson JA,et al.EBSeq:an empirical Bayes hierarchical model for inference in RNA-seq experiments.Bioinformatics,2013,29:1035-1043.

7 Altschul SF,Madden TL,Sch ffer AA,et al.Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs.Nucleic Acids Res,1997,25: 3389-3402.

8 Kanehisa M,Goto S,Kawashima S,et al.The KEGG resource for deciphering the genome.Nucleic Acids Res, 2004,32:D277-280.

9 Christodoulopoulos P,Wright E,Frenkiel S,et a1.Monocyte chemotactic protein in allergen-induced inflammation in the nasal mucosa effect of topical corticosteroids．J Allergy Clin Immunol,1999,103:1036-1044.

10 Fujikura T,Shimosawa T,Yakuo I.Regulatory effect of histamine H1 receptor antagonist on the expression of messenger RNA encoding CC chemokines in the human nasal mucosa.J Allergy Clin Immunol,2001,107:123-128.

11 段文彬,陳文弦,崔鵬程,等.表皮生長因子對(duì)鼓膜穿孔愈合作用與內(nèi)耳功能影響的研究.現(xiàn)代康復(fù),2001,5: 56-57.

12 丁國強(qiáng),鄭春泉.慢性鼻竇炎鼻竇黏膜中表皮生長因子及其受體的表達(dá).中國耳鼻咽喉頭頸外科,2007,14: 219-222.

13 Bogefors J,Rydberg C,Uddman R,et a1.Nodl，Nod2 and Nalp3 receptors,new potential targets in treatment of allergic rhinitis.Allergy,2010,65:1222-1226.

14 Shin JH，Kim SW，Park YS．Role of NODl-mediated signals in a mouse model of allergic rhinitis.Otolaryngol Head Neck Surg,2012,147:1020-1026.

15 Gonzalo JA,Lloyd CM,Peled A,et a1.Critical involvement of the chemotactic axis CXCR4-stromal cellderived factor-1 alpha in the inflammatory component of allergic airway disease.J Immunol,2000,165:499-508.

16 Eddleston J,Christiansen SC,Zuraw BL.Functional expression of the C-X-C chemokine receptor CXCR4 by human bronchialepithelialcells：regulation by proin flammatory mediators.J Immunol,2002,169:6445-6451.

17 Fredefick MJ,HendersonY,Xu X,et a1.In vivo expression of the novel CXC chemokine BRAK in normal and cancerous human tissue.Am J Pathol,2000,156:1937-1950.

（收稿:2015-03-12）

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2015.02.015

江蘇省社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（BE2012706）；揚(yáng)州市2012科技攻關(guān)項(xiàng)目（YZ2011055）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目

1 揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 江蘇省蘇北人民醫(yī)院耳鼻咽喉科（揚(yáng)州，225009）

2 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院

關(guān)兵，主任醫(yī)師. Email: aliceguan0685@sina.com