楊廣明， 查小紅， 田亞平

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

一種氨基甲酸乙酯與尿素降解酶產(chǎn)生菌的鑒定及酶學(xué)特性

楊廣明， 查小紅， 田亞平*

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

從小鼠消化系統(tǒng)中篩選到一株能產(chǎn)生氨基甲酸乙酯 （EC，Urethane）降解酶的菌株，16S rDNA序列分析和生理生化鑒定確定為Providencia sp.。酶底物特異性研究表明，該酶對尿素和氨基甲酸乙酯都有相對強的降解作用，而對一些酯類和氨基酸沒有降解作用，該酶對兩種底物的最適作用pH值均為4.5左右，最適溫度均為35℃。單因素實驗優(yōu)化了培養(yǎng)基配方，在最佳培養(yǎng)條件下，酸性EC降解酶酶活從0.32 U/mL提高到0.63 U/mL，酸性脲酶酶活從0.87 U/mL提高到1.95 U/mL。初步應(yīng)用研究表明，該酶在黃酒的復(fù)雜體系中仍然能有效的降解尿素和EC，且對黃酒中的風(fēng)味物質(zhì)幾乎無影響。

菌株鑒定；酸性EC降解酶；酸性脲酶；產(chǎn)酶條件；酶學(xué)特性

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，簡稱EC），又稱尿烷（Urethane）早在1943年，Nettleship[1]等進(jìn)行的動物實驗就證明EC具有潛在的致癌性?；蚨拘院椭掳┬詼y試顯示EC是主要食源性致癌物質(zhì)[2-3]。

EC廣泛存在于發(fā)酵食品（如醬油、腐乳）和飲料酒中（如黃酒、清酒）及蒸餾酒中（如白蘭地、威士忌等）中[4-5]。自從1985年12月加拿大的衛(wèi)生與福利組織（Canadian Department of Health and Welfare）首先規(guī)定各類酒中的EC含量，日本酒行業(yè)也表示加強食品安全的檢測，并把清酒和我國生產(chǎn)的黃酒加入限制的行列，要求我國黃酒的EC質(zhì)量濃度必須低于100 μg/L，因此這就極大地限制了我國的紹興黃酒出口日本和東南亞國家[6-7]。

對EC形成機制的研究表明，酒精飲料中90%以上的EC是來源于酒中的尿素和乙醇的化學(xué)反應(yīng)[8-9]，因此對于黃酒中EC的控制可分為兩個方面，一種是直接降解黃酒中已經(jīng)形成的EC，另一種是通過向后酵酒中添加酸性脲酶，將EC的前體物質(zhì)尿素分解為CO2、H2O和NH3，從而減少EC的進(jìn)一步形成。目前研究者主要致力于第二個方面的研究，即通過篩選產(chǎn)酸性脲酶的微生物來控制黃酒中的EC，國內(nèi)吳偉祥，劉穎等[10]從污泥中篩選到產(chǎn)酸性脲酶的菌株，并研究了產(chǎn)酶條件；田亞平，王松華等[11-12]篩選到一株能產(chǎn)酸性脲酶的腸桿菌，并將該酸性脲酶應(yīng)用于實際黃酒環(huán)境中，能夠降解70%以上的尿素；江南大學(xué)的劉俊等[13]結(jié)合脲酶對尿素的降解和功能性材料對EC的吸附作用，首次建立了從底物到產(chǎn)物對黃酒中EC含量的集成控制策略；田亞平，谷曉蕾[14]篩選到了一株產(chǎn)氨基甲酸乙酯降解酶的變幻青霉并對酶的性質(zhì)做了初步研究。目前國內(nèi)外利用相關(guān)降解酶直接去除EC的研究報道尚比較少。

作者以篩選EC降解酶為目的，在小鼠的消化道中利用傳統(tǒng)的微生物篩選方法，獲得一株同時能產(chǎn)酸性脲酶和EC降解酶的菌株，16S rDNA法鑒定后優(yōu)化其產(chǎn)酶條件，考察其所產(chǎn)酶的基本特性及在黃酒中的初步應(yīng)用效果，為酶法降低酒類發(fā)酵食品中EC的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種來源小鼠消化系統(tǒng)。

1.1.2 培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基（組分g/L）：葡萄糖2，EC 2，磷酸二氫鉀2，乙酸鈉2，氯化鈉5；調(diào)節(jié)pH 5.0。115℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基（組分g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，氯化鈉5，磷酸氫二鉀2，乙酸鈉2，EC 2；調(diào)節(jié)pH 7.0。115℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（組分g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏 5，酵母膏 5，KH2PO42，NaCl 5，NaAc 2，尿素2，四水硫酸錳0.05，六水硫酸鎳0.05；pH 5.5（用30%HCl調(diào)pH）。115℃滅菌20 min。

LB培養(yǎng)基（組分g/L）：胰蛋白胨 10，NaCl 10，酵母膏5；pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒：上海生工生物工程公司；DNA標(biāo)準(zhǔn)相對分子質(zhì)量、DNA膠回收試劑盒、瓊脂糖、PrimeSTAR max DNA聚合酶：大連TaKaRa公司；分子級的酵母粉、蛋白胨：英國Oxoid公司；其他試劑：國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

722光柵分光光度計：上海第三分析儀器廠產(chǎn)品；超聲波細(xì)胞粉碎機：寧波新芝生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋：上海醫(yī)療器械五廠產(chǎn)品；5804R臺式高速冷凍離心機、5424高速離心機：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；BioRad1000系列高性能PCR儀、核酸電泳儀、蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)、GelDoc凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 EC降解酶產(chǎn)生菌的篩選初篩：在超凈臺中取2 g小鼠胃容物，加入到以EC為惟一氮源的富集培養(yǎng)基中，置于搖床上，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，用無菌水稀釋將富集培養(yǎng)后的懸液稀釋至不同的梯度：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，然后涂布在平板培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，之后劃線純化接種至斜面保藏。復(fù)篩：將上一步分離得到的菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)24 h，之后將發(fā)酵液于4℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清液，用0.05 mol/L的檸檬酸-檸檬酸三鈉（pH 4.5）的緩沖溶液重懸后洗滌菌體，離心棄上清液，重復(fù)兩次，之后測定EC降解酶的酶活。

1.3.2 全細(xì)胞的制備將菌種從斜面培養(yǎng)基上接種至種子培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)10 h，再按2%的接種體積分?jǐn)?shù)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中（50 mL/250 mL）中，于37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。之后發(fā)酵液經(jīng)6 000 r/min離心10 min，收集菌體，經(jīng)檸檬酸緩沖液洗滌，離心收集菌體，再重復(fù)洗滌一次，離心獲得全細(xì)胞。

1.3.3 粗酶液的制備將上步獲得的細(xì)胞用檸檬酸緩沖液進(jìn)行稀釋，體積調(diào)整至離心之前發(fā)酵液體積的1/5，冰浴中超聲破碎，破碎液在4℃、9 000 r/min離心10 min，收集上清液，即為粗酶液。

1.3.4 酶活測定采用Berthelot reaction比色法測定酶活[15]。酶活定義：在常壓、37℃、pH 4.5的條件下，每分鐘分解尿素或者EC產(chǎn)生1 μmol氨的酶量為1個酶活單位。

1.3.5 黃酒中尿素和EC去除率的測定黃酒中尿素含量的測定：采用二乙酰一肟法[16]。氨基甲酸乙酯去除率的測定：吸取酒樣8 mL置于20 mL的頂空瓶中，逐漸加入NaCl至飽和，旋緊瓶蓋，插入萃取頭，在70℃下，250 r/min恒溫攪拌萃取45 min。樣品萃取及進(jìn)樣由德國Gerstel多功能進(jìn)樣系統(tǒng)自動完成。上述頂空固相微萃取技術(shù)富集黃酒中的EC，再用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行定性定量分析[17]。

1.3.6 EC降解酶產(chǎn)生菌的鑒定觀察菌株的生長狀態(tài)，包括菌落特征、菌體形態(tài)、革蘭氏染色和生理生化鑒定，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[18]。

細(xì)菌基因組的提?。簩⒑Y選的菌株接入20 mL的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，按照上海生工SK8226柱式基因組DNA快速抽提試劑盒說明書進(jìn)行提取該菌株的總DNA。

16S rDNA序列擴增與回收：PCR反應(yīng)體系為（50 μL）：1 μL primer 27F（10 μmol/L）（5’-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3’），1 μL primer 1492R（10 μmol/L）（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’），5 μL 10×Prime STAR Buffer，4 μL dNTP，0.5 μL Prime STAR MAX DNA聚合酶，1 μL模板DNA，32.5 μL ddH2O。反應(yīng)程序為：98℃5 min；98℃10 s，55℃15 s，72℃1 min 30 s；30個循環(huán)；72℃5 min。PCR擴增條帶用0.8 g/dL的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，切割目的條帶，用DNA凝膠回收試劑盒純化。

16S rDNA序列分析：將純化的PCR產(chǎn)物回收送上海生工生物工程公司測序，測序結(jié)果通過Blastn在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，通過Clustal X和MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 EC降解酶酶學(xué)性質(zhì)

最適pH值：用檸檬酸和檸檬酸三鈉配制0.05 mol/L pH 3.0~7.0的檸檬酸緩沖液；用磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配制0.05 mol/L的pH 6.0~8.0的PBS緩沖液；用Tris-HCl配制0.05 mol/L的pH 7.5~9.0的緩沖液；最適溫度的測定方法同上，在不同的溫度下測定酶活。

1.5 發(fā)酵條件的研究

1.5.1 碳源（葡萄糖）質(zhì)量濃度對產(chǎn)酶的影響分別以1、2、3、4、5 g/dL的量加入葡萄糖，其他成分不變，按照1.3.2的方法進(jìn)行培養(yǎng)，測定粗酶液的酶活。

1.5.2 氮源質(zhì)量濃度對菌株產(chǎn)酶的影響以葡萄糖為碳源，分別以0.5、1、1.5、2、2.5、3.0 g/dL的量加入蛋白胨，其他成分和含量不變，按1.3.2的方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定發(fā)酵粗酶液的酶活。

1.5.3 尿素質(zhì)量濃度對產(chǎn)酶的影響嘗試通過添加EC誘導(dǎo)EC降解酶基因的表達(dá)，當(dāng)加入EC時對菌體的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用。根據(jù)文獻(xiàn)報道，脲酶基因的啟動子受到尿素的誘導(dǎo)，在尿素存在的情況下能夠提高菌體的產(chǎn)酶能力，而尿素作為EC的結(jié)構(gòu)類似物，有可能對于EC降解酶基因的表達(dá)也具有誘導(dǎo)作用，對于菌體產(chǎn)EC降解酶的能力是否有促進(jìn)作用值得研究。在前面優(yōu)化后的最佳的培養(yǎng)基的條件下，通過向培養(yǎng)基中添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/dL的尿素，之后按照1.3.2的方法進(jìn)行培養(yǎng)，測定發(fā)酵粗酶液的酶活。

1.5.4 起始pH值對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響在優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，用0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl將其調(diào)成不同的起始pH值，范圍為3.5~7.0，按1.3.2方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，之后測定粗酶液的酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 EC降解酶產(chǎn)生菌的篩選

按照1.3.1所述的方法，篩選到一株EC降解酶酶活較高的菌株，初始EC降解酶酶活約為0.32 U/mL初始脲酶酶活為0.87 U/mL。通過形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)菌落形態(tài)呈圓形，乳白色半透明，邊緣整齊，革蘭氏染色實驗證明該菌為革蘭氏陰性菌，見圖1。

16S rDNA遺傳學(xué)鑒定：以菌株的總DNA為模板，采用16S rDNA通用引物27F 1492R進(jìn)行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢驗到一條1 400 bp左右大小的條帶，具有典型的16S rDNA特征，切膠回收純化后送上海生工生物工程公司測序，得到菌株的16S rDNA序列，將序列在NCBI上進(jìn)行同源性比較。采用 Clustal X和MEGA軟件對菌株的16S rDNA進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果見圖2。菌株經(jīng)16S rDNA分子序列分析鑒定為 Providencia sp.，與Providencia vermicola和Providencia rettgeri的親源性最近。

圖1 菌落形態(tài)特征Fig.1 Colony morphology

圖2 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

2.2 酶的底物特異性

分別以不同的EC結(jié)構(gòu)類似物作為底物，用Providencia sp.所產(chǎn)粗酶液測定酶活，發(fā)現(xiàn)該菌所產(chǎn)粗酶能有效的去除EC和尿素。而對于其它的氨基酸等結(jié)構(gòu)類似物沒有降解作用，該酶具有相對較強的底物專一性。因此該酶能夠有效的去除尿素和EC等有害物質(zhì)，見圖3。

2.3 菌株所產(chǎn)脲酶和EC降解酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

圖4表明，EC降解酶的最適作用pH值為5.0，但是在pH范圍4.5~6.0 EC降解酶都具有較高的活性，圖5表明脲酶的最適作用pH值為4.5，在酸性范圍內(nèi)對EC和尿素都有比較強的分解作用。黃酒的pH值一般在4.2左右，因此該菌所產(chǎn)的酶有在黃酒體系中作用的潛力。

圖3 Providencia sp.所產(chǎn)酶的底物特異性Fig.3 Substrat specificity of the enzyme produced by Providencia sp.

圖4 EC降解酶作用的最適pH值Fig.4 Optimal pH of the urethanase

圖5 脲酶作用的最適pH值Fig.5 Optimal pH of the urease

由圖6可以看出，脲酶和EC降解酶的最適作用溫度都是35℃左右，并且在30~55℃都有比較高的酶活。

圖6 脲酶和EC降解酶作用的最適溫度Fig.6 Optimal temperature of the urease and urethanase

2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.4.1 葡萄糖及蛋白胨質(zhì)量濃度對產(chǎn)酶的影響圖7和圖8結(jié)果表明，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為3 g/dL時，菌體產(chǎn)生的酶活最高，EC降解酶的酶活達(dá)到了0.50 U/mL，脲酶的酶活達(dá)到了1.41 U/mL。圖7結(jié)果表明，當(dāng)?shù)鞍纂说馁|(zhì)量濃度為1.0 g/dL時，酶活最高。

圖7 葡萄糖質(zhì)量濃度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of the glucose concentration on enzyme production

圖8 蛋白胨質(zhì)量濃度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effectofpeptone concentration on enzyme production

2.4.2 尿素對產(chǎn)酶的影響尿素作為EC的結(jié)構(gòu)類似物，對EC降解酶的產(chǎn)生可能具有促進(jìn)作用，據(jù)文獻(xiàn)報道，脲酶基因的轉(zhuǎn)錄受到其它誘導(dǎo)劑和阻遏劑的調(diào)節(jié)，例如 Proteus mirabilis的脲酶基因受到UreR蛋白的誘導(dǎo)和H-NS的阻遏，當(dāng)尿素存在的情況下能夠阻止H-NS的阻遏作用，從而增加脲酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，提高菌體產(chǎn)酶[19]。圖9結(jié)果表明，隨著尿素添加量的增加，Providencia sp.發(fā)酵產(chǎn)酶活力先呈上升趨勢。當(dāng)尿素質(zhì)量濃度為8 g/L左右時，該菌株產(chǎn)酶活力最高，EC降解酶的活力為0.59 U/mL，脲酶酶活為1.66 U/mL。

圖9 尿素質(zhì)量濃度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of the urea concentration on enzyme production

2.4.3 初始pH值對產(chǎn)酶的影響EC降解酶催化底物EC分解為CO2和NH3，這種催化作用產(chǎn)生的產(chǎn)物與脲酶相同，脲酶對尿素作用能夠?qū)⒛蛩胤纸鉃镃O2和NH3，起到酸緩沖作用[20]，產(chǎn)生的凈效果是使體系的pH回升[21]，當(dāng)微生物處于酸性的環(huán)境中時，這種酸緩沖作用能夠保護菌體免受酸性環(huán)境的毒害作用，在酸脅迫條件下脲酶給菌體提供抗酸保護[22]，有報道表明，酸性培養(yǎng)基環(huán)境能夠誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生更多的脲酶來抵御環(huán)境的酸性毒害[23]。圖10結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH為4.5時，菌株產(chǎn)酶活力最高，EC降解酶的酶活達(dá)到和0.63 U/mL，脲酶酶活為1.95 U/mL。

2.5 酶在黃酒中的作用效果初探

配制尿素質(zhì)量濃度為25 mg/L的黃酒溶液，將制得的粗酶液按照0.1 U/mL的量，向黃酒中添加粗酶，將待處理的混合黃酒液體置于37℃的環(huán)境下進(jìn)行反應(yīng)，分別經(jīng)過1、2、3、4 d測定尿素去除率，由圖11可以看出：粗酶作用于黃酒時，隨著處理時間的延長，酶的作用的效果沒有明顯的增加，第一天的去除率為50%左右，第二天達(dá)到67%左右，之后尿素質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定。

圖10 初始pH值對產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effect of the initial pH on the enzyme production

圖11 尿素去除率結(jié)果Fig.11 Effect of the removal percentage of urea

表1的結(jié)果表明，該菌所產(chǎn)的酶在黃酒體系中對EC具有明顯的降解作用，EC去除率隨著加酶量的增加有一定的上升，當(dāng)加酶量為0.2 U/mL的時候，EC去除率達(dá)到25%。

表1 EC降解酶在黃酒中的EC去除率的作用效果Table 1 Effect of the urethanase on the removal of the EC in Chinese rice wine

初步應(yīng)用結(jié)果表明，該菌所產(chǎn)的酶在黃酒體系中仍然對兩種底物都有明顯效果，且在一定加量情況下其中的脲酶降解酒中尿素的作用更加有效，屬于相對耐乙醇的酸性脲酶，而EC降解酶的作用在黃酒中較弱，可能是由于酶在黃酒復(fù)雜體系中活性降低所致，可在進(jìn)一步純化考察其特性的基礎(chǔ)上通過化學(xué)修飾或固定化修飾或分子定向進(jìn)化的手段提高其耐乙醇和黃酒中各種復(fù)雜成分的能力，以期達(dá)更好的應(yīng)用效果。

2.6 酶處理對黃酒中風(fēng)味物質(zhì)的影響

圖12為原黃酒的對照實驗，圖13為經(jīng)過粗酶液處理的黃酒風(fēng)味物質(zhì)檢測結(jié)果（加酶量為0.2 U/mL）。通過GC-MS的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，風(fēng)味物質(zhì)的種類沒有變化，測定前后都為50種，各種風(fēng)味物質(zhì)的含量僅有微小的變化，可以認(rèn)為酶法處理對黃酒中的風(fēng)味物質(zhì)影響極小。圖12 原黃酒中風(fēng)味物質(zhì)GC-MS譜圖Fig.12 Content of flavor component in original Chinese rice wine

圖13 酶處理后黃酒中風(fēng)味物質(zhì)GC-MS譜圖Fig.13 Content of flavor component in Chinese rice wine processed by Urethanase

3 結(jié)語

作者篩選出一株能同時產(chǎn)脲酶和EC降解酶的菌株，通過16S rDNA結(jié)合生理生化鑒定確定為Providencia sp.。

對該菌株所產(chǎn)的酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步的研究，并在實際黃酒體系中尿素和EC的去除能力進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)該酶在復(fù)雜的黃酒體系中仍然能有效的去除尿素和EC，且對酒中風(fēng)味物質(zhì)幾乎無影響，具有實現(xiàn)從源頭到終端綜合控制黃酒中EC質(zhì)量濃度的應(yīng)用潛力。

發(fā)酵條件優(yōu)化及酶的特性研究發(fā)現(xiàn)，兩種酶有一樣的變化趨勢，初步純化后兩個酶的活性峰仍然一致，初步推測這是一種雙功能酶，與文獻(xiàn)報道的一般的中性脲酶具備的絕對專一性特征明顯不同，該初步結(jié)論將有待進(jìn)一步的分離純化驗證。

該菌所產(chǎn)脲酶基因全序列已經(jīng)獲得，該基因在NCBI中未見報道，進(jìn)一步通過基因工程手段將該脲酶基因在安全宿主菌中進(jìn)行異源表達(dá)具有重要意義。

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Identification and Enzyme Characterization of a Urease and Urethanase-Producing Strain

YANG Guangming， ZHA Xiaohong， TIAN Yaping*
（Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

A strain capable of producing urethanase was isolated from the mouse intestines and identified as Providencia sp.By analyzing the 16S rDNA sequence and conducting the physiology and chemistry experiment.The substrate specificity experiment showed that the enzyme can catalyze both urea and urethane with the optimal pH of 4.5 and optimal temperature of 35℃but had no influence on the ester and amino acid.The fermentation condition was optimized based on single factor experiment.Under the optimal condition，the acid urethanase activity was increased from 0.32 U/mL to 0.63 U/mL and acid urease activity from 0.87 U/mL to 1.95 U/mL.The crude enzyme can effectively decompose the urea and EC in the Chinese rice wine and has little effect on the flavor components.

strain identification，acid urethanase，acid urease，enzyme-producing condition，enzyme characterization

Q 55

A

1673—1689（2015）01—0007—08

2014-04-10

國家973計劃項目（2012CB720802）。

*通信作者：田亞平（1964—），女，江蘇無錫人，工學(xué)博士，教授，主要從事生物活性物質(zhì)研究。E-mail：yapingtian@hotmail.com