樊 琳， 婁永江， 陳小芳， 孫佩璇

（寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211）

響應(yīng)面法優(yōu)化海帶中重金屬的脫除工藝

樊 琳， 婁永江*， 陳小芳， 孫佩璇

（寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211）

應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化檸檬酸脫除海帶中重金屬的條件，使海帶中重金屬含量達到國家標準，為海帶的安全食用提供基礎(chǔ)。建立海帶中重金屬脫除的二次多項式模型，對模型分析確定海帶重金屬脫除的最佳條件為：脫除液pH=2，脫除時間4 h，液料體積質(zhì)量比125 mL/g。在此條件下海帶中Cd、Cr、Pb、As（總砷）的質(zhì)量分數(shù)分別為0.75、0.63、0.81、14.95 mg/kg，脫除率分別為61.14%、58.28%、70.97%、40.70%。

海帶；重金屬；檸檬酸；響應(yīng)面

海帶作為一種高膳食纖維低熱量的食物，早已成為人們?nèi)粘２妥郎系牟穗?。然而近年來由于水體污染以及藻類自身特殊結(jié)構(gòu)，重金屬超標已經(jīng)成為一個亟待解決的問題。張乾通[1]等對舟山漁場多種水產(chǎn)品的檢測表明：海藻類最嚴重，海藻類中鉛、鎘的超標率非常高，鉛單項污染指數(shù)值為0.53，鎘單項污染指數(shù)值為1.22，且舟山漁場海產(chǎn)品中鉛污染有加重趨勢。

目前國內(nèi)外對海帶中重金屬脫除的相關(guān)研究較少。姜橋等[2]采用一定濃度的鹽酸、醋酸、堿、水和沸水等對海藻中無機砷的脫除進行研究，能脫除海帶中大部分無機砷，但是鹽酸和堿液這兩種脫除劑對海帶食用安全帶來一定影響。舒本勝[3]等采用檸檬酸利用正交試驗優(yōu)化海帶中砷的脫除方法，能達到一定脫除效果且對營養(yǎng)價值沒有太大影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海帶：市售；MARS微波消解儀：美國培安公司產(chǎn)品；2100DV電感耦合等離子發(fā)射光譜儀 （ICPAES）：Perkin Elmer公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 海帶預(yù)處理方法取一定量的海帶漲發(fā)洗凈，去除表面泥砂、污垢，烘干至水分質(zhì)量分數(shù)8% 10%，封口包裝備用。

1.2.2 海帶中重金屬含量的測定方法無機砷：參照GB/T 5009.11-2003進行測定；鉛、鉻、鎘、總砷：參照GB/T 18932.11-2002進行測定。

1.2.3 單因子實驗

1）脫除液pH對海帶重金屬脫除效果的影響取一定量的海帶置于燒杯中，料液比按質(zhì)量體積比1 g∶100 mL分別加入pH值為2、3、4、5、6的檸檬酸溶液，放置2 h取樣，進行消解測定。

2）脫除時間對海帶重金屬脫除效果的影響取一定量的海帶置于燒杯中，料液比按質(zhì)量體積比1 g∶100 mL加入pH=2的檸檬酸溶液，分別放置1、2、3、4、5 h取樣，進行消解測定。

3）料液質(zhì)量體積比對海帶重金屬脫除效果的影響 取一定量的海帶置于200 mL燒杯中，料液比按海帶質(zhì)量和浸泡液體積比1 g∶50 mL～1 g∶150 mL加入pH=2的檸檬酸溶液，放置3 h取樣，進行消解測定。

1.2.4 響應(yīng)面法對海帶重金屬脫除條件進行優(yōu)化綜合單因子實驗結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理[4-8]采用響應(yīng)面法[9]3因子3水平上對海帶中重金屬的脫除條件進行優(yōu)化。

2 結(jié)果與討論

2.1 海帶中重金屬質(zhì)量分數(shù)的測定

海藻細胞壁的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，海藻細胞膜具有高度選擇性,這些結(jié)構(gòu)特點決定了藻類可富集金屬離子。細胞壁組成及金屬種類的不同,決定了富集的效率與選擇性,藻類的細胞壁主要是由多糖、蛋白質(zhì)和脂肪組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),帶一定的負電荷,且有較大的表面積與粘性,它們可提供氨基、酰胺基、羰基、醛基、羥基、硫醇、硫醚等官能團與金屬離子結(jié)合[10]業(yè)廢水中的重金屬離子進入近海域與海帶中的多糖發(fā)生離子交換作用、配位作用、螯合作用、氫鍵作用等。巖藻聚糖硫酸酯是海帶細胞間組織的水溶性硫酸多糖，當中的糖醛酸和硫酸基團具有一定的聚陰離子體系的特征，因此對有毒污染物和重金屬離子(As、Pb等)具有一定的吸附和結(jié)合能力[9]。在褐藻酸鹽中，有毒金屬離子與其中羧酸基團主要發(fā)生離子交換作用和表面絡(luò)合作用。水溶液中離子交換涉及到束縛在各種官能團上(羧基和羥基)的金屬離子和其他陽離子之間，而吸附作用涉及到自由表面的物理化學(xué)束縛[11-14]。

測定結(jié)果可見，海帶中Pb質(zhì)量分數(shù)為2.79 mg/ kg超標嚴重，超出國標規(guī)定2倍左右。海帶中無機砷在正常范圍內(nèi)，但總砷質(zhì)量分數(shù)為25.21 mg/kg高，藻類中的有機砷主要以砷糖形式存在。砷糖含有五價砷，在砷的轉(zhuǎn)換化和反應(yīng)中起重要作用，這種五價砷與兩個甲基團、一個氧原子和一個核糖碳原子鍵合，共4種形式，都含有β-呋喃核苷，區(qū)別只是核糖的1-碳位上連接的支鏈不同。一般認為砷糖屬于無毒物質(zhì)但也有相關(guān)報道指出砷糖被攝入到人體后會轉(zhuǎn)化成大量的二甲基砷酸(DMA)，表明砷糖對人體存在潛在的健康風險[15]。國標中海藻的Cr和Cd的含量沒有明確規(guī)定，但是參考蔬菜的規(guī)定，Cd的質(zhì)量分數(shù)超標，為1.51 mg/kg，Cr含量在正常范圍內(nèi)。所以海帶中的Pb、Cd和總砷應(yīng)作為研究的重點。

2.2 各因素對重金屬脫除效果的影響

2.2.1 脫除液pH對海帶中重金屬脫除效果的影響pH值會影響生物體表面重金屬離子吸附位點的數(shù)量，影響海帶表面活性基團的性質(zhì)，同時決定了重金屬離子的化學(xué)狀態(tài)。如Pb（II），當pH＜6時是以Pb2+和PbOH+的形式存在，當pH＞6時，則主要以Pb（OH）2形式存在。從表1可以看出隨著脫除液pH的升高，海帶中Cd、Cr、Pb、As的脫除率逐漸降低，pH接近中性，脫除效果不明顯。

當pH值較低時，脫除液中H+達到一定程度，可能是海帶中的氨基、酰胺基與金屬離子的結(jié)合狀態(tài)發(fā)生改變，不僅能使金屬離子解析下來，同時金屬離子與H+發(fā)生離子交換實現(xiàn)重金屬的脫除；測量脫除液浸泡前后的pH值，pH值有所升高，這種現(xiàn)象可以表明有離子交換作用的發(fā)生。

表1 脫除液pH對海帶重金屬脫除效果的影響Table 1 Effect of removal liquid pH on the removal of heavy metals in seaweed 質(zhì)量分數(shù)/（mg/kg）

考慮到pH值是影響重金屬吸附的重要因素，采用pH=2的鹽酸、醋酸，在同樣的條件下做預(yù)實驗，得到的重金屬的脫除率均較檸檬酸低，且鹽酸處理的海帶形態(tài)被破壞嚴重，酸味重，醋酸處理的海帶形態(tài)結(jié)構(gòu)較好，但醋酸味太重，難以接受。說明僅僅靠提高脫除液酸度是不能達到去除海帶中重金屬的目的。同時也表明，檸檬酸的絡(luò)合作用在重金屬的脫除中發(fā)揮了一定作用。在3 h pH=2處理下，Cd、Cr、Pb、As的脫除率分別可達 59.58%、64.23%、64.52%、33.08%。

2.2.2 脫除時間對海帶重金屬脫除效果的影響從表2可知，隨著浸泡時間的增加，海帶Cd、Cr、Pb、As含量明顯降低，當時間達到3~4 h時重金屬離子的含量最低，隨著時間的增加由顯著性差異分析可知，重金屬含量并沒有顯著下降，且Cr有略微的上升。檸檬酸脫除重金屬主要依靠pH和檸檬酸的絡(luò)合作用，檸檬酸的滲透需要一定時間，所以在較短的時間內(nèi)脫除效果并不明顯，隨著時間延長海帶中重金屬的解析、吸附和離子交換達到動態(tài)平衡，所以時間延長對于脫除效果的增強是沒有明顯作用。海帶中Cr略微上升，可能是因為細胞壁上解析吸附平衡，被解析下來的Cr進入到細胞內(nèi)部。因此，脫除時間選擇3 h比較合適。

表2 脫除時間對海帶重金屬脫除效果的影響Table 2 Effect of removal time on the removal of heavy metals in seaweed 質(zhì)量分數(shù)/（mg/kg）

相對于其他重金屬，總砷含量脫除率較低，除了藻類中的有機砷的存在形式外，還有可能砷已經(jīng)部分到達海帶細胞內(nèi)部，必需金屬元素競爭膜轉(zhuǎn)運蛋白，以金屬螯合物形態(tài)進入植物細胞，使脫除作用難以進行。而其他幾種金屬大部分被絡(luò)合在海帶細胞壁的表面。這也符合在3 h左右，脫除作用基本達到平衡。

2.2.3 料液比對海帶重金屬脫除效果的影響由表3中可以看出隨著體積質(zhì)量比的增大，海帶中Cd、Cr、Pb、As含量明顯降低，當料液質(zhì)量體積比達到1 g∶100 mL時金屬的含量最低，再增加料液質(zhì)量體積比海帶中金屬的含量有所升高，但基本影響不大。為維持金屬離子在液相和固相之間的平衡重金屬，從海帶表面解吸，由不溶態(tài)轉(zhuǎn)化為可溶態(tài)，從而可降低海帶中重金屬的濃度。可能是因為適當增大料液質(zhì)量體積比有利于平衡向金屬離子脫離的方向移動，但是當溶液劑量達到一定程度時，對于這種平衡的影響作用很小。因此，料液比選擇質(zhì)量體積比1 g∶100 mL比較合適。

2.3 響應(yīng)面實驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計方案及結(jié)果在單因子實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，以X1=（Z1-3）/1，X2=（Z2-3）/1，X3=（Z3-100）/25為自變量，以海帶中重金屬Cd（Y1）、Cr（Y2）、Pb（Y3）、As（Y4）質(zhì)量分數(shù)為響應(yīng)值，進行響應(yīng) 面分析實驗，結(jié)果見表4。

表3 脫除液料液質(zhì)量體積比對海帶重金屬脫除效果的影響Table 3 Effect of ratio of liquid to solid on the removal of heavy metals in seaweed 質(zhì)量分數(shù)/（mg/kg）

表4 響應(yīng)面分析方案及實驗結(jié)果

Table 4 Experiment design and results of response surface methodology 質(zhì)量分數(shù)/（mg/kg）

實驗號X1Y2X2Y3Y42 100 Y11 0.952 X30.6215.35 30.80 21250.5931000.97 2 3 0.653 1.023 3 1.0610040.641.0415.19 0.9715.865 1251.0320.6315.96433 756 1.070.821.3116.21331000.990.631.0215.89 3 8270.85751.040.6415.4493 31000.990.671.0315.82104100 21.220.841.3816.3611100 4 40.751.18 1.0116.16 127540.96 30.691.0215.7513341250.640.96 0.8715.59 14100 240.820.580.8715.11 2751.100.78 3 151.191.09 16.01174 31251.030.741.2416.20316 0.87 31000.950.651.06 15.8315.85

2.3.2 模型方程的建立及顯著性分析利用Design-Expert8.0.5軟件對表4試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到的數(shù)學(xué)模型為

Y1=0.97+0.11X1-0.11X2-0.080X3-0.020X1X2+ 2.500E-003X1X3-5.000E-003X2X3-0.013X12+ 0.039X22-0.023X32

Y2=+0.64+0.090X1-0.026X2-0.041X3-0.013X1X2-7.500E-003X1X3+0.025X2X3+0.031X12+0.018X22+ 0.19X32

Y3=+1.03+0.16X1-0.086X2-0.050X3-2.500E-003X1X2+0.025X1X3+1.000E-002X2X3+0.069X12+ 0.019X22+0.012X32

Y3=+15.85+0.48X1-0.83X2-0.059X3+1.000E-002X1X2+0.060X1X3-0.027X2X3-0.086X12-0.019X22-3.750E-003X32

根據(jù)分析，作者所選模型不同處理間差異極顯著（模型的P<0.000 1），見表5。說明回歸方程描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系時，其應(yīng)變量與全體自變量之間的線性關(guān)系是顯著的，即這種實驗方法是可靠的；失擬項不顯著（P＞0.05），說明本試驗所得二次回歸方程能很好地對響應(yīng)值進行預(yù)測。對于Y1、Y2、Y3、Y4模型的R2分別為98.89%、98.32%、99.05%、99.15%說明這種實驗方法可靠，使用該方程模擬真實的3因子3水平的分析可行。變異系數(shù)分別為1.17%、2.27%、1.90%、0.32%較低，說明實驗具有良好的穩(wěn)定性。

2.3.3 海帶脫除重金屬的響應(yīng)面分析及優(yōu)化由于海帶脫除重金屬響應(yīng)值對應(yīng)的不同因素的等高線圖和響應(yīng)面過多，所以選取交互作用顯著的幾種情況進行分析。

表5 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 5 Test of significance for regression coefficient

在固定料液質(zhì)量體積比為1 g∶100 mL條件下（X3=0），pH和時間及兩者的交互作用對海帶中Cd的脫除影響的響應(yīng)面及對應(yīng)等高線見圖1。當pH保持不變時，脫除初期，Cd的去除效果與時間成正比，當脫除一段時間后，時間對降低海帶中Cd含量作用不明顯，當時間達到3.5 h以后，海帶中Cd的脫除已趨于平緩，從脫除效果和實驗效率考慮，時間應(yīng)選取3.5~4.0 h；當時間保持不變時，隨著pH的增加，海帶中Cd的含量逐漸增加，隨后基本保持不變。從脫除效果和海帶營養(yǎng)價值考慮，脫除液的pH選取2~2.5。

圖1 pH和時間對海帶中Cd脫除的等高線圖和響應(yīng)面圖(X3=100)Fig.1 Contour plot and response surface plot of the effect of pH and time on Cd of seaweed

在固定pH=2條件下（X1=-1），料液質(zhì)量體積比和時間及兩者的交互作用對海帶中Cr的脫除影響的響應(yīng)面及對應(yīng)等高線見圖2。在低時間區(qū)，隨著料液質(zhì)量體積比的增加，海帶中Cr的含量呈降低趨勢；在高時間區(qū)隨著料液質(zhì)量體積比的增加，海帶中Cr含量先降低后上升。所以對于海帶中Cr的脫除，脫除液的料液比質(zhì)量體積應(yīng)選在1 g∶120 mL?？赡苁且驗檎麄€脫除體系不穩(wěn)定，在長時間和高料液質(zhì)量體積比的條件下，脫除作用的不確定因素使固-液界面發(fā)生了吸附反應(yīng)。在低料液比區(qū)，隨著時間的延長，海帶中Cr的含量逐漸降低，隨后變化平緩；在高料液比區(qū)，隨著時間的延長，海帶中Cr的含量先緩慢降低后有所增加，所以對于海帶中Cr的脫除，脫除時間應(yīng)選擇在2.5~3.0 h。

在固定時間為3 h條件下（X2=0），料液質(zhì)量體積比和pH及兩者的交互作用對海帶中Pb的脫除影響的響應(yīng)面及對應(yīng)等高線見圖3。當料液質(zhì)量體積比保持不變時，隨著pH的增加，海帶中Pb的質(zhì)量分數(shù)逐漸升高，隨后變化平緩，同樣選取脫除液的pH為2.0~2.5。當pH保持不變時，隨著料液質(zhì)量體積比的增加，海帶中Pb的質(zhì)量分數(shù)逐漸降低，隨后基本保持不變。考慮脫除效果和節(jié)約資源，料液質(zhì)量體積比應(yīng)選擇在120~125。

圖2 時間和料液質(zhì)量體積比對海帶中Cr脫除的等高線圖和響應(yīng)面圖(X1=2)Fig.2 Contour plot and response surface plot of the effect of time and ratio of liquid to solid on Cr of seaweed

圖3 pH和料液質(zhì)量體積比對海帶中Pb脫除的等高線圖和響應(yīng)面圖(X2=3 h)Fig.3 Contour plot and response surface plot of the effect of pH and ratio of liquid to solid on Pb of seaweed

在固定時間為3 h條件下（X2=+1），料液質(zhì)量體積比和pH及兩者的交互作用對海帶中As的脫除影響的響應(yīng)面及對應(yīng)等高線見圖4。pH保持不變時，隨著料液質(zhì)量體積比的增加，海帶中As的質(zhì)量分數(shù)逐漸降低所以選取料液質(zhì)量體積比范圍是1 g∶125 mL附近。當料液質(zhì)量體積比保持不變時，隨著pH的增加，海帶中As的質(zhì)量分數(shù)逐漸升高，隨后變化平緩，同樣選取pH為2.0~2.5。

從表8中可看出，海帶中Cd、Cr、Pb質(zhì)量分數(shù)基本可以達標，考慮到總砷質(zhì)量分數(shù)偏高，因此選擇時偏重于總砷質(zhì)量分數(shù)，為此選擇總砷取得相對較小響應(yīng)值時，檸檬酸脫除重金屬的條件。此條件為：pH=2，時間4 h，質(zhì)量體積比1 g∶125 mL，此時理論Cd、Cr、Pb、As的理論質(zhì)量分數(shù)分別為0.76、0.60、0.82、14.97 mg/kg。為了檢驗響應(yīng)面法的可行性，采用得到的最佳條件進行海帶重金屬脫除的的驗證實驗。經(jīng)3次平行實驗得到Cd、Cr、Pb、As實際重金屬質(zhì)量分數(shù)分別為0.75、0.63、0.81、14.95 mg/kg，與理論值相差分別為1.3%、3.3%、1.2%、0.13%。

圖4 pH和料液比對海帶中As脫除的等高線圖和響應(yīng)面圖(X2=4 h)Fig.4 Contour plot and response surface plot of the effect of pH and ratio of liquid to solid on As of seaweed

表8 不同重金屬離子取得最值時所對應(yīng)的脫除條件Table 8 Corresponding removal condition when different heavy metal is the minimum

3 結(jié)語

檸檬酸、鹽酸、醋酸和EDTA對海帶中重金屬都有脫除的效果，選用這幾種試劑在相同條件下，檸檬酸脫除效果最好，味道小，且對海帶營養(yǎng)和結(jié)構(gòu)破壞程度小，所以作者選用檸檬酸作為海帶重金屬脫除劑來進一步研究。

檸檬酸對于海帶中的Cd、Cr、Pb、As具有良好的脫除效果，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳工藝參數(shù)為浸泡液pH為2，浸泡時間為4 h，浸泡液體積和海帶質(zhì)量比125 mL∶1 g，此時海帶中Cd、Cr、Pb、As的質(zhì)量分數(shù)分別為0.75、0.63、0.81、14.95 mg/kg，脫除率分別為61.14%、58.28%、70.97%、40.70%，海帶中的重金屬元素質(zhì)量分數(shù)達到國家標準。

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Study on Technology of Removing Heavy Metals from Seaweed by Response Surface Method

FAN Lin， LOU Yongjiang*， CHEN Xiaofang， SUN Peixuan
（School of Marine Science，Ningbo University，Ningbo 315211，China）

The Cd，Cr，Pb，As content of seaweed exceed the national standard.To make the heavy metal content in seaweed reduce to the national standard and provide basis for safe eating of seaweed，the response surface method was applied to optimize the conditions of the heavy metals removal from seaweed.The uadratic polynomial model of removal of heavy metals in seaweed was established and analyzed，which showed the best conditions of heavy metal removal from seaweed：the pH of removal liquid 2，time 4 h，the ratio of solvent to material 125 mL/g.Under these conditions，the content of Cd、Cr、Pb、As（total As）in seaweed were 0.75、0.63、0.81、14.95 mg/kg and the rate of removal were 61.14%、58.28%、70.97%、40.70%.

seaweed，heavy metals，citric acid，response surface method

TS 254

A

1673—1689（2015）01—0094—08

2014-05-14

寧波市農(nóng)業(yè)與社會發(fā)展攻關(guān)項目（2012C10027）。

*通信作者：婁永江（1965—），男，浙江嵊州人，農(nóng)學(xué)碩士，副教授，主要從事水產(chǎn)品加工研究。E-mail：louyongjiangn@nbu.edu.cn