張 穎，肖 沙，徐 偉，刁慶春，郝 進(jìn)

(重慶市第一人民醫(yī)院/重慶市中醫(yī)院皮膚科，重慶 400011)

·技術(shù)與方法·

雷公藤內(nèi)酯醇的細(xì)胞內(nèi)定位研究*

張 穎，肖 沙，徐 偉，刁慶春，郝 進(jìn)△

(重慶市第一人民醫(yī)院/重慶市中醫(yī)院皮膚科，重慶 400011)

目的 檢測雷公藤內(nèi)酯醇的細(xì)胞內(nèi)定位，探討其在細(xì)胞內(nèi)的作用位點(diǎn)。方法采用4-溴甲基-7-甲氧基香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇，與人肝癌細(xì)胞孵育；并與細(xì)胞核染料PI或細(xì)胞質(zhì)膜染料DiI行雙色熒光染色，用熒光顯微鏡觀察。結(jié)果與對照相比，香豆素標(biāo)記在紫外激發(fā)下呈特異性的淡藍(lán)色熒光；與DiI共定位顯示，香豆素標(biāo)記在細(xì)胞質(zhì)(膜)存在；與PI共定位顯示，香豆素標(biāo)記在細(xì)胞核存在，且熒光強(qiáng)于細(xì)胞質(zhì)(膜)。結(jié)論雷公藤內(nèi)酯醇在細(xì)胞內(nèi)主要位于細(xì)胞核，其次是細(xì)胞質(zhì)(膜)，提示雷公藤內(nèi)酯醇可能主要在細(xì)胞核內(nèi)起作用，其次是在細(xì)胞質(zhì)(膜)上起作用。

雷公藤；香豆素；細(xì)胞定位

雷公藤屬于衛(wèi)予科多年生藤本植物，在我國廣泛分布。作為傳統(tǒng)中藥的瑰寶之一，其應(yīng)用于臨床已有2000年的歷史。中國醫(yī)學(xué)最早利用其根莖提取物治療風(fēng)濕性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[1]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[2]等。從上世紀(jì)80年代開始，在大量臨床觀察的基礎(chǔ)上，雷公藤的適應(yīng)證開始不斷得以拓展，目前在皮膚科、眼科、腎內(nèi)科、消化科等領(lǐng)域均有切實(shí)的臨床應(yīng)用。基礎(chǔ)研究表明，雷公藤除了抗炎作用以外[3]，近年來的研究發(fā)現(xiàn)其對多種血液系統(tǒng)腫瘤、實(shí)體性腫瘤也具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，甚至對臨床一些難治性或常規(guī)化學(xué)治療藥物耐藥的腫瘤亦顯示出明確活性[4]。

研究表明，雷公藤是通過幾種活性單體協(xié)同而發(fā)揮其藥理學(xué)活性的，其中一種二萜類化合物——雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide)為活性最強(qiáng)的單體[5]。遺憾的是，作為一種具有悠久歷史的、已被廣泛使用的藥物，絕大多數(shù)的研究主要局限在雷公藤作用后細(xì)胞的功能性改變上，即雷公藤作用結(jié)果的觀察上，而由于技術(shù)手段和研究方法的局限性，對雷公藤的細(xì)胞內(nèi)起作用的位點(diǎn)還未獲得足夠的認(rèn)識(shí)，導(dǎo)致對其作用機(jī)制研究未獲突破。因此，對困擾臨床的適應(yīng)證問題和毒副作用問題目前仍不能準(zhǔn)確闡釋，對于藥物的進(jìn)一步改性也無從著手。為此，本研究首先從雷公藤內(nèi)酯醇在細(xì)胞中起作用位點(diǎn)入手，通過4-溴甲基-7-甲氧基香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇，于熒光顯微鏡下觀察雷公藤內(nèi)酯醇在細(xì)胞中的定位，為下一步分析雷公藤內(nèi)酯醇的作用靶蛋白奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠肝癌細(xì)胞(Hepal-6)購自中山醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；雷公藤內(nèi)酯醇購自廣州牌牌生物科技有限公司，純度99%(hplc級)；4-溴甲基-7-甲氧基香豆素購自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素混合液、胰蛋白酶、1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate(DiI)、碘化丙啶(PI)購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hepal-6細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，輔加1%青/鏈霉素混合液。細(xì)胞置于37 ℃含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，90%融合時(shí)用0.25%胰蛋白酶傳代。

1.2.2 4-溴甲基-7-甲氧基香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇的制備 參照文獻(xiàn)，取雷公藤內(nèi)酯醇10.00 mg，丁二酸酐15.00 mg，4-二甲氨基吡啶0.33 mg，溶解在1 mL的二氯甲烷中；用三乙胺調(diào)pH值至9～10；在磁力攪拌器的攪拌下，溫室反應(yīng)24 h；用大量溫水洗滌反應(yīng)物，將其中有機(jī)相烘干得到淡黃色晶體triptolide14-succinate；取上述反應(yīng)物triptolide14-succinate 5.00 mg，4-溴甲基-7-甲氧基香豆素8.80 mg，碳酸鉀50.00 mg；加入1 mL的丙酮溶劑中，在磁力攪拌器的攪拌下，37 ℃，反應(yīng)1 h；用大量熱水洗滌產(chǎn)物，取有機(jī)相，烘干即得黃色的香豆素標(biāo)記的雷公藤內(nèi)酯醇。

1.2.3 香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇的細(xì)胞內(nèi)定位 處于對數(shù)生長期的Hepal-6細(xì)胞，制備成1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于含有蓋玻片的六孔板內(nèi)；24 h后加入香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇和DiI，使二者的終濃度分別為4 μmol和5 μmol，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min；或者取出香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇孵育后的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min，置于4 μmol的PI溶液中孵育30 min；孵育后的細(xì)胞用PBS清洗3次，于甘油中封片，熒光顯微鏡(Olympus X51)下觀察，Image-Pro Plus 6.0軟件(Media Cybernetics,Inc.)拍照。

2 結(jié) 果

2.1 香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇的細(xì)胞觀察 采用香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇與細(xì)胞孵育，熒光顯微鏡觀察顯示，香豆素在紫外光激發(fā)下產(chǎn)生淡藍(lán)色熒光；而只孵育香豆素的對照未見熒光，表明香豆素可以特異性標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇；基于細(xì)胞形態(tài)的初步觀察表明，雷公藤內(nèi)酯醇主要累積于細(xì)胞核內(nèi)，其次是累積于細(xì)胞質(zhì)(膜)中，見圖1。

2.2 香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇與DiI的共定位 為進(jìn)一步明確雷公藤內(nèi)酯醇的細(xì)胞分布，采用特異性染料DiI標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)膜。與香豆素標(biāo)記的共定位顯示，香豆素的淡藍(lán)色熒光與DiI的紅色熒光在細(xì)胞質(zhì)中重疊成紫色，表明雷公藤內(nèi)酯醇在細(xì)胞質(zhì)中的確存在，見圖2。

A：只孵育香豆素的對照；B：香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇孵育后。

圖1 香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇的細(xì)胞觀察

2.3 香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇與PI的共定位 進(jìn)一步采用細(xì)胞核特異性染料PI標(biāo)記細(xì)胞核，與香豆素標(biāo)記的共定位顯示，香豆素的淡藍(lán)色熒光與PI的紅色熒光在細(xì)胞核中重疊成紫色，表明雷公藤內(nèi)酯醇在細(xì)胞核中的確存在(圖3)。

A：香豆素標(biāo)記；B：DiI標(biāo)記；C：A和B的疊加。

圖2 香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇與DiI的共定位

A：香豆素標(biāo)記；B：PI標(biāo)記；C：A和B的疊加。

圖3 香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇與PI的共定位

3 討 論

雷公藤內(nèi)酯醇是衛(wèi)矛科植物雷公藤的主要藥效成分，是一類環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物，具有廣泛的藥理作用，包括抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等，應(yīng)用于各種炎癥性疾病和腫瘤的治療，提高了患者的生活質(zhì)量。一種化合物具有如此廣泛的藥理作用，必定有其多種作用機(jī)理。近來的研究表明，雷公藤內(nèi)酯醇主要通過NF-κB、MAPK、Akt/mTOR等信號傳導(dǎo)通路以及影響血管生成、細(xì)胞凋亡、腫瘤細(xì)胞增殖等生物學(xué)過程起作用[6-7]，但其在細(xì)胞中具體是通過哪些作用靶點(diǎn)而引起這些生物學(xué)效應(yīng)的，一直沒有得以充分闡明。本研究的結(jié)果提示雷公藤內(nèi)酯醇的主要作用方式是在細(xì)胞核內(nèi)直接調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，與其他研究者的結(jié)果相吻合[8-9]，合理解釋了為什么雷公藤內(nèi)酯醇具有如此廣泛而強(qiáng)大的藥理作用。本研究結(jié)果同時(shí)還表明，雷公藤內(nèi)酯醇可能通過作用于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的靶蛋白或細(xì)胞膜受體參與細(xì)胞功能的調(diào)控。

香豆素及其衍生物是一類具有熒光特性的化合物，在熒光染色和標(biāo)記等領(lǐng)域具有重要的作用。作為一種較新的熒光標(biāo)記試劑，4-溴甲基-7-甲氧基香豆素具有熒光強(qiáng)度高、色彩明亮等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于樣本的痕量分析[10]。且其最大激發(fā)波長320nm，最大發(fā)射波長398nm，在紫外激發(fā)下發(fā)出明亮的淡藍(lán)色熒光，在本研究中可以很好地與另外2種紅色熒光染料(DiI和PI)實(shí)現(xiàn)區(qū)分和共定位。本研究的結(jié)[10]高倩倩，楊秀芬，歐敏．藤茶總黃酮和二氫楊梅素含藥血清對肝癌HepG2細(xì)胞增殖及凋亡的影響[J]．中國中藥雜志，2011，36(4)：500-503．

[11]Liu J,Shu Y,Zhang Q,et al.Dihydromyricetin induces apoptosis and inhibits proliferation in hepatocellular carcinoma cells[J].Oncol Lett,2014,8(4):1645-1651.

[12]Zeng G,Liu J,Chen H,et al.Dihydromyricetin induces cell cycle arrest and apoptosis in melanoma SK-MEL-28 cells[J].Oncol Rep,2014,31(6):2713-2719.

[13]Lin B,Tan X,Liang J,et al.A reduction in reactive Oxygen species contributes to dihydromyricetin-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells[J].Sci Rep,2014,4:7041.

[14]Wu S,Liu B,Zhang Q,et al.Dihydromyricetin reduced Bcl-2 expression via p53 in human hepatoma HepG2 cells[J].PLoS One,2013,8(11):e76886.

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In-cell localization of triptolide*

ZhangYing,XiaoSha,XuWei,DiaoQingchun,HaoJin△

(DepartmentofDermatology,ChongqingFirstPeople′sHospital/ChongqingTraditionalChineseMedicineHospital,Chongqing400011,China)

Objective To clarify the cellular localization of triptolide and to explore its in-cell action sites.Methods4-(Bromomethyl)-7-methoxycoumarin was employed to label triptolide,then labelled triptolide was incubated with human hepatoma carcinoma cells.Subsequently,incubated cells were subjected to stain with fluorescent dye DiI or PI,which were specific to cytoplasmic membrane system and nucleus,respectively.ResultsCompared with the non-triptolide control,coumarin labelled triptolide shown a light blue fluorescence under UV excitation;Co-localization with DiI showed that triptolide exist in cytoplasm and(or) on cell membrane;Co-localization with PI showed that triptolide located in cell nucleus.Moreover,microscopic observation indicated that the fluorescence intensity in nucleus was denser than that in cytoplasm.ConclusionThe presnt study demonstrate that triptolide mainly act in nucleus,followed by acting in cytoplasm and(or) on cell membrane.

triptolide;coumarin;cellular localization

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.25.034

重慶市科委自然科學(xué)基金計(jì)劃資助項(xiàng)目(cstc2011jjA10043,cstc2014jcyjA10130);重慶市中醫(yī)院院內(nèi)培育課題(2012-1-15)。

張穎(1985-)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事皮膚病學(xué)方面的研究?！?/p>

，E-mail:haojin_cq@163.com。

R93

A

1671-8348(2015)25-3556-02

2015-03-08

2015-05-16)