*

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023；2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

正交試驗(yàn)優(yōu)化黃河鯉魚(yú)鱗酶促溶性膠原蛋白提取工藝

肖 楓1,2，朱文學(xué)1,*，康懷彬1，劉麗莉1，賀家亮1，任國(guó)艷1

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023；2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

為提高黃河鯉魚(yú)鱗膠原蛋白提取率，在4 ℃條件下，采用胃蛋白酶和0.5 mol/L乙酸溶液對(duì)其提取工藝進(jìn)行研究，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法探索了提取時(shí)間、加酶量和料液比3 個(gè)因素對(duì)黃河鯉魚(yú)鱗酶促溶性膠原蛋白（pepsin soluble collagen，PSC）提取率的影響。結(jié)果表明，黃河鯉魚(yú)鱗PSC的最適提取工藝參數(shù)為提取時(shí)間60 h、加酶量40 kU/g和料液比1∶10（g/mL），在此條件下，PSC提取率達(dá)到（17.7±0.7）%。所提取的產(chǎn)品與酸溶性膠原蛋白（acid soluble collagen，ASC）有相似的電泳性質(zhì)和氨基酸組成，表明其可能與ASC具有相似的分子結(jié)構(gòu)。

黃河鯉魚(yú)鱗；膠原蛋白；提取工藝

膠原蛋白是脊椎動(dòng)物的主要結(jié)構(gòu)蛋白，約占動(dòng)物總蛋白含量的30%[1]。膠原蛋白是一個(gè)龐大而復(fù)雜的蛋白質(zhì)家族，迄今為止研究人員已經(jīng)從眾多原料中分離并鑒定出21 種不同類型的膠原蛋白[2]。它們廣泛分布在動(dòng)物的皮膚、骨骼、腱、血管和肌肉組織中，以維持組織和器官的穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)完整。特別是Ⅰ型膠原蛋白存在于所有脊椎動(dòng)物的結(jié)締組織中[3]。魚(yú)鱗是生產(chǎn)膠原蛋白的重要原料，可作為哺乳動(dòng)物原料的有效替代品。通常采用傳統(tǒng)的酸提取法制備酸溶性膠原蛋白，其提取率較低，而胃蛋白酶能夠打開(kāi)膠原蛋白端肽區(qū)域的肽鏈，從而促進(jìn)膠原蛋白的溶出[4]。

由于具有獨(dú)特的理化特性和功能特性，水產(chǎn)膠原蛋白的研究已經(jīng)廣受關(guān)注[5-9]。目前，對(duì)水產(chǎn)膠原蛋白的研究主要集中在海洋水產(chǎn)動(dòng)物[3-6,9-16]，而對(duì)淡水魚(yú)類[17-20]膠原蛋白的研究較少，有關(guān)黃河鯉魚(yú)鱗膠原蛋白的提取工藝、理化特性、功能性質(zhì)、分子類型、組成結(jié)構(gòu)等有待研究。本實(shí)驗(yàn)以黃河鯉魚(yú)鱗為原料，采用胃蛋白酶促溶提取工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響魚(yú)鱗膠原蛋白提取效率較大的影響因素進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮黃河鯉魚(yú) 河南三佳食品有限公司。

胃蛋白酶 美國(guó)Sigma公司；冰乙酸、檸檬酸、乙酸鈉、對(duì)二甲氨基苯甲醛、高氯酸、氯胺-T等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722N型分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；Fs4111型電子分析天平 上海衡平儀器儀表廠；HR152型電熱恒溫水浴鍋 金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠；氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 羥脯氨酸含量的測(cè)定

取魚(yú)鱗樣品約0.2 g于安培瓶中，加入6 mol/L的鹽酸2 mL，封口后于130 ℃水解4 h。利用NaOH溶液中和，定容至100 mL。取2 mL水解液加入1 mL氯胺試劑，搖勻，室溫條件下放置20 min，加入1 mL發(fā)色劑（溶解10 g對(duì)二甲胺基苯甲醛于35 mL 60%高氯酸溶液中，緩慢地加入65 mL異丙醇，并不斷攪動(dòng)，制備液當(dāng)天使用），充分混合，于60 ℃水浴加熱20 min，冷卻后在558 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。配制不同質(zhì)量濃度羥脯氨酸溶液按照上述方法測(cè)定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。魚(yú)鱗膠原蛋白提取率計(jì)算公式如下：

1.3.2 魚(yú)鱗的預(yù)處理

先酸后堿處理：稱取2.0 g魚(yú)鱗，按料液比1∶10（g/mL）加入1 mol/L的HCl溶液浸泡2 h，用蒸餾水清洗干凈。再按1∶10（g/mL）的比例加入0.1 mol/L的NaOH溶液浸泡24 h去除雜蛋白。按1.3.1節(jié)方法測(cè)定魚(yú)鱗中羥脯氨酸的質(zhì)量，計(jì)算樣品中膠原蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

先堿后酸處理：稱取2.0 g魚(yú)鱗，按1∶10（g/mL）的比例加入0.1 mol/L的NaOH溶液浸泡24 h去除雜蛋白，用蒸餾水清洗干凈。再按料液比1∶10（g/mL）的比例加入1 mol/L的HCl溶液浸泡2 h。按1.3.1節(jié)方法測(cè)定魚(yú)鱗中羥脯氨酸的質(zhì)量，計(jì)算樣品中膠原蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（濕基）。

以處理后樣品中膠原蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)來(lái)表示雜蛋白脫除的效果，樣品中膠原蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高表明雜蛋白的脫除率越高。

1.3.3 魚(yú)鱗膠原蛋白提取單因素試驗(yàn)

采用0.5 mol/L乙酸溶液提取魚(yú)鱗酸溶性膠原蛋白（acid soluble collagen，ASC），以提取ASC后的殘?jiān)鳛檠芯繉?duì)象，采用胃蛋白酶輔助的方法進(jìn)行胃蛋白酶促溶性膠原蛋白（pepsin soluble collagen，PSC）的提取。選擇提取時(shí)間（24、36、48、60、72 h）、加酶量（20、30、40、50、60 kU/g）和料液比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14（g/mL））作為影響因素，計(jì)算PSC提取率。

1.3.4 魚(yú)鱗PSC提取正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以提取時(shí)間、加酶量和料液比為影響因素，各取3 個(gè)水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以PSC提取率為指標(biāo)，確定黃河鯉魚(yú)鱗PSC的最適提取工藝。試驗(yàn)的因素及水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Independent variables and their levels used in the orthogonal array design

1.3.5 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

參照文獻(xiàn)[16]的方法并作適當(dāng)?shù)男薷?。使用垂直板電泳裝置，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。分離膠配方為：去離子水3.3 mL，30%丙烯酰胺1.5 mL，10% SDS 100 μL，10%過(guò)硫酸銨100 μL，Tris-HCl（1.5 mol/L，pH 8.8）2.5 mL；電泳緩沖液為T(mén)ris-甘氨酸緩沖液（pH 8.3，含0.1% SDS）；樣品緩沖液為pH 8.8的的Tris-HCl緩沖液；染色液為0.25%考馬斯亮藍(lán)、甲醇、去離子水混合；脫色液為7.5%甲醇、5%冰乙酸混合液。

1.3.6 氨基酸組成分析

將ASC和PSC樣品分別用6 mol/L的HCl溶液于105 ℃水解24 h，采用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定水解物的氨基酸組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸堿處理順序?qū)︳~(yú)鱗預(yù)處理效果的影響

先利用HCl溶液脫除魚(yú)鱗中的礦物質(zhì)，再用堿液對(duì)其進(jìn)行處理后，魚(yú)鱗樣品中膠原蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（濕基）為（31.3±0.6）%；而根據(jù)已報(bào)道的相關(guān)文獻(xiàn)中所采用的先堿液處理、再用HCl溶液處理的工藝對(duì)黃河鯉魚(yú)磷進(jìn)行處理后，魚(yú)鱗樣品中膠原蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（濕基）為（19.5±0.9）%?？梢?jiàn)，先用鹽酸脫除魚(yú)鱗中的礦物質(zhì)、再用堿液處理更有利于魚(yú)鱗雜蛋白的脫除，該處理組與先堿處理后酸處理組相比，魚(yú)鱗樣品中膠原蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著提高（P＜0.01）。魚(yú)鱗中除膠原蛋白外，還含有其他種類蛋白質(zhì)，其中一些蛋白質(zhì)可以在酸性、堿性或較高溫度的水中溶出，因此，在提取魚(yú)鱗膠原蛋白或明膠之前，有必要對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚硪蕴岣吣繕?biāo)產(chǎn)物的純度。根據(jù)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)魚(yú)鱗的前處理工藝基本是先采用一定料液比的NaOH溶液或NaCl溶液浸泡，以去除其中的雜蛋白，然后用一定料液比的酸溶液或乙二胺四乙酸溶液浸泡以脫除魚(yú)鱗中的礦物質(zhì)成分[16,18-19,21]。但是并沒(méi)有關(guān)于處理工藝對(duì)其雜蛋白脫除效率影響的報(bào)道，也沒(méi)有魚(yú)鱗雜蛋白脫除工藝優(yōu)化的研究報(bào)道。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，魚(yú)鱗預(yù)處理流程對(duì)提高魚(yú)鱗樣品中膠原蛋白含量有顯著影響（P＜0.01），因?yàn)轸~(yú)鱗在骨質(zhì)層，礦物質(zhì)與其中蛋白質(zhì)等有機(jī)成分相結(jié)合，不利于其中蛋白質(zhì)的溶出，而利用酸液脫除魚(yú)鱗中礦物質(zhì)后，魚(yú)鱗的骨質(zhì)層結(jié)構(gòu)變得較為松散，雜蛋白與堿液接觸更充分，因此脫除礦物質(zhì)后更有利于魚(yú)鱗中雜蛋白的溶出。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取時(shí)間對(duì)魚(yú)鱗PSC提取率的影響

圖1 提取時(shí)間對(duì)PSC提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on collagen yield

在加酶量40 kU/g、料液比1∶10（g/mL）條件下改變提取時(shí)間，測(cè)定魚(yú)鱗PSC提取率。如圖1所示，魚(yú)鱗PSC提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)60 h以后，提取率隨提取時(shí)間的變化趨勢(shì)較緩慢，提取率無(wú)顯著變化（P＞0.05），因此選擇60 h為較優(yōu)提取時(shí)間。

2.2.2 加酶量對(duì)魚(yú)鱗PSC提取率的影響

圖2 加酶量對(duì)PSC提取率的影響Fig.2 Effect of enzyme concentration on collagen yield

在提取時(shí)間60 h、料液比1∶10（g/mL）的條件下研究加酶量對(duì)魚(yú)鱗PSC提取率的影響。如圖2所示，在加酶量0～40 kU/g范圍內(nèi)，提取率隨加酶量的增大而迅速升高，繼續(xù)提高加酶量則對(duì)提PSC提取率沒(méi)有顯著影響（P＞0.05），因此選擇加酶量40 kU/g作為較優(yōu)水平。

2.2.3 料液比對(duì)魚(yú)鱗PSC提取率的影響

圖3 料液比對(duì)PSC提取率的影響Fig.3 Effect of ratio of solvent to solid on collagen yield

在提取時(shí)間60 h、加酶量40 kU/g的條件下研究料液比對(duì)魚(yú)鱗PSC提取率的影響。如圖3所示，PSC提取率隨溶劑用量的增大呈增加趨勢(shì)，表明溶劑用量的增大有利于魚(yú)鱗中膠原蛋白的溶出。當(dāng)料液比達(dá)到1∶10（g/mL）之后時(shí)，PSC提取率沒(méi)有顯著變化（P＞0.05），考慮實(shí)際生產(chǎn)的需要，選擇1∶10（g/mL）作為較優(yōu)水平。

2.3 黃河鯉魚(yú)鱗PSC提取工藝優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇提取時(shí)間、加酶量和料液比3 個(gè)因素按L9（34）正交設(shè)計(jì)表（表1）進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析如表2所示。試驗(yàn)結(jié)果的極差分析表明，對(duì)黃河鯉魚(yú)鱗酶促溶性PSC提取率影響最大的是提取時(shí)間，其次是加酶量，料液比的影響最小。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and experimental results

如表3方差分析所示，可以看出提取時(shí)間和加酶量對(duì)黃河鯉魚(yú)鱗PSC提取率有顯著影響（P＜0.05），而料液比因素在試驗(yàn)中對(duì)魚(yú)鱗PSC的提取率沒(méi)有顯著影響，對(duì)試驗(yàn)因素各水平進(jìn)行最小顯著差數(shù)法多重比較，結(jié)果表明提取時(shí)間和加酶量的1水平與2、3水平存在顯著差異，2、3水平之間沒(méi)有顯著差異，而料液比各水平間均沒(méi)有顯著差異。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果的極差分析（表2），黃河鯉魚(yú)鱗PSC提取率最優(yōu)水平組合為A3B3C3，結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果的方差分析，考慮到實(shí)際生產(chǎn)的方便，可修正黃河鯉魚(yú)鱗PSC提取工藝最優(yōu)組合為A2B2C2，即提取時(shí)間60 h、加酶量40 kU/g和料液比1∶10（g/mL）。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

在修正過(guò)的最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3 次，其結(jié)果為黃河鯉魚(yú)鱗P S C提取率為（17.7±0.7）%，因此，該工藝參數(shù)可以應(yīng)用于黃河鯉魚(yú)鱗PSC的提取。

2.4 黃河鯉魚(yú)鱗PSC的SDS-PAGE分析

圖4 黃河鯉魚(yú)鱗膠原蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE patterns of collagens fromCyprinus carpio haematopterusscale

圖4中α1-帶的強(qiáng)度大約是α2-帶的2倍，表明黃河鯉魚(yú)鱗膠原蛋白的分子可能為兩 條α1-鏈和一條α2-鏈構(gòu)成，或者由α1-鏈、α2-鏈和α3-鏈各一條構(gòu)成，可以看出，黃河鯉魚(yú)鱗PSC 屬于Ⅰ型膠原。這與許多魚(yú)類膠原蛋白如鰱魚(yú)（Hypophthalmichthys molitrix）[20]皮膠原、比目魚(yú)（Paralichthys olivaceus）[22]皮膠原、鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）[23]皮和鱗膠原等類似。

由圖4可知，黃河鯉魚(yú)鱗PSC與ASC有相似的電泳圖譜，但是PSC分子中α1-鏈和α2-鏈的分子質(zhì)量較ASC要低，說(shuō)明PSC與ASC的主體結(jié)構(gòu)一致，但PSC只含有膠原的3 股螺旋主體結(jié)構(gòu)，胃蛋白酶能夠斷開(kāi)端肽區(qū)的交聯(lián)分子，但不能破壞3 股螺旋的完整結(jié)構(gòu)，因此，對(duì)于酸法難以提取的膠原蛋白，利用胃蛋白酶處理可以有效提高膠原蛋白提取率。

2.5 黃河鯉魚(yú)鱗氨基酸組成分析

表4 黃河鯉魚(yú)鱗膠原蛋白氨基酸構(gòu)成Table 4 Amino acid composition of collagens fromCyprinus carpio haematopterus殘基數(shù)/1 000 個(gè)

如表4所示，黃河鯉魚(yú)鱗PSC的氨基酸組成與其他膠原蛋白類似，其中所含Gly比例最高（約為總氨基酸數(shù)量的1/3），而Tyr、His、Phe、Ile和Met所占比例較低。相對(duì)于Ⅰ型膠原蛋白而言，黃河鯉魚(yú)鱗PSC中Met和Phe所占比例較高，而膠原蛋白的特征氨基酸Hyp的比例較低。其亞氨基酸（Hpy和Pro）殘基所占比例分別為18.2%和19.8%，低于豬皮膠原蛋白的22%和Ⅰ型膠原蛋白的21.5%[18]，但是與一些魚(yú)皮和魚(yú)鱗的膠原蛋白比較接近[18,24]。黃河鯉魚(yú)鱗PSC與ASC在氨基酸組成上比較接近，與其電泳圖譜一致，表明黃河鯉魚(yú)鱗PSC與ASC可能具有相似的理化特性。

3 結(jié) 論

先脫除黃河鯉魚(yú)鱗中礦物質(zhì)，再采用堿液處理，可以顯著提高魚(yú)鱗樣品中膠原蛋白的含量，即脫除礦物質(zhì)的處理更有利于魚(yú)鱗樣品中非膠原蛋白成分的脫除。所得產(chǎn)品與傳統(tǒng)酸性介質(zhì)提取的酸溶性膠原蛋白具有一致的分子結(jié)構(gòu)和組成，胃蛋白酶可以促進(jìn)黃河鯉魚(yú)鱗中難溶性膠原蛋白溶出，提取時(shí)間、加酶量和料液比是影響黃河鯉魚(yú)鱗PSC提取率的重要因素，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定黃河鯉魚(yú)鱗PSC的提取工藝參數(shù)為提取時(shí)間60 h、加酶量40 kU/g和料液比1∶10（g/mL），提取率可達(dá)（17.7±0.7）%。胃蛋白酶不能破壞黃河鯉魚(yú)鱗膠原蛋白的主體結(jié)構(gòu)，所得PSC與ASC具有相似的電泳性質(zhì)和氨基酸組成，電泳圖譜表明黃河鯉魚(yú)鱗PSC與ASC一樣為典型的Ⅰ型膠原蛋白。

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Orthogonal Array Design for the Optimization of Pepsin Soluble Collagen Extraction from Cyprinus carpio haematopterusScale

XIAO Feng1,2, ZHU Wenxue1,*, KANG Huaibin1, LIU Lili1, HE Jialiang1, REN Guoyan1
(1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China; 2. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

Pepsin and 0.5 mol/L acetic acid were used to enhance the extraction of collagen from Cyprinus carpio haematopterus scale at 4 ℃. Using combination of single factor experiments and orthogonal array design, the effect of extraction time, enzyme concentration and ratio of solid to solvent on the yield of pepsin soluble collagen (PSC) from C. haematopterus scale were explored. The results showed that the optimal conditions for PSC extraction were determined as follows: extraction time, 60 h; enzyme concentration, 40 kU/g; and ratio of solid to solvent, 1:10 (g/mL). The yield of PSC under these conditions was (17.7 ± 0.7)%. The PSC had electrophoretic properties amino acid composition similar to those of acid soluble collagen (ASC), suggesting similarity beween their molecular structures.

Cyprinus carpio haematopterus scale; collagen; extraction process

TS254.9

A

1002-6630（2015）12-0060-05

10.7506/spkx1002-6630-201512011

2014-10-11

肖楓（1979—），男，講師，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品綜合利用。E-mail：xfeng@haust.edu.cn

*通信作者：朱文學(xué)（1967—），男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品干燥和農(nóng)產(chǎn)品功能性成分分離、提取及活性。

E-mail：zwx@mail.haust.edu.cn