響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化新疆野生準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)卸嗵羌兓に?/h1>
2015-01-05 01:40
食品科學(xué) 2015年12期
（新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 8 30054）
響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化新疆野生準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)卸嗵羌兓に?/p>
張 玉，李 進(jìn)*，呂海英，張 俠，張花麗
（新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 8 30054）
為純化準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)械拇侄嗵牵ㄟ^(guò)動(dòng)態(tài)吸附和洗脫實(shí)驗(yàn)從7 種大孔吸附樹(shù)脂中選出兩種最優(yōu)樹(shù)脂NKA-9和D101，按一定比例進(jìn)行混合實(shí)驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法確定最佳純化條件：NKA-9與D101樹(shù)脂最佳混合質(zhì)量比為2∶3；最佳吸附工藝條件為上樣液流速3.75 mL/min、上樣液質(zhì)量濃度1.32 g/L、樹(shù)脂徑高比1∶13，此條件下多糖的吸附率為60.75%；最佳洗脫工藝條件為洗脫液濃度0.27 mol/L、洗脫液流速3.5 mL/min、洗脫液用量7 BV，此條件下多糖的洗脫率為84.22%。樣品中 多糖含量由原來(lái)的5.06%上升至21.13%。
準(zhǔn)噶爾山楂；多糖；響應(yīng)面法；精制工藝
多糖又稱多聚糖，是由多個(gè)單糖聚合而成的天然高分子化合物，在動(dòng)植物體內(nèi)廣泛存在，分布極廣[1-3]，植物多糖由于其具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、延緩衰老、降低糖脂等生物活性，在抗生素替代物及保健品領(lǐng)域已有很廣泛的應(yīng)用[4-7]。
準(zhǔn)噶爾山楂（ Crataegus songarica）是薔薇科山楂屬植物，是新疆特有落葉小喬木，現(xiàn)已被列為三級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物并被列入中國(guó)優(yōu)先保護(hù)物種名錄，生長(zhǎng)于河谷或干旱碎石坡地，海拔700～20 000 m，在中國(guó)大陸僅分布 于新疆霍城縣，在俄羅斯、阿富汗、伊朗等地也有分布，花期5～6 個(gè)月，果期7～8 個(gè)月[8]。研究表明，其果實(shí)中富含抗細(xì)胞氧化的黃酮類[9]、熊果酸[10]、天然花色苷[11]等，然而對(duì)于準(zhǔn)噶爾山楂多糖的研究還未見(jiàn)報(bào)道。
大孔吸附樹(shù)脂是一種具有良好的大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大比表面積的高分子型吸附樹(shù)脂，與傳統(tǒng)吸附劑相比，它具有選擇吸附性強(qiáng)、解吸條件溫和、吸附量大、耐污染、使用壽命長(zhǎng)、機(jī)械強(qiáng)度高、再生容易等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)我國(guó)將其作為中藥分離純化的常用方法[12-14]。
響應(yīng)面法是采用多元二次回歸方程擬合響應(yīng)項(xiàng)與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，得到最優(yōu)工藝條件的有效方法之一，目前，該分析方法已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)[15-16]。
目前準(zhǔn)噶爾山楂資源沒(méi)有被充分利用，其果實(shí)提取過(guò)花色苷后產(chǎn)生的大量殘?jiān)ǔ１恢苯觼G棄，前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些殘?jiān)泻写罅慷嗵穷愇镔|(zhì)。本實(shí)驗(yàn)以提取過(guò)花色苷的準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)鼮樵咸崛《嗵牵庙憫?yīng)面法優(yōu)化多糖精制工藝，為更高效地利用新疆特有準(zhǔn)噶爾山楂資源提供一定的科學(xué)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
準(zhǔn)噶爾山楂成熟果實(shí)采于新疆伊犁，已提取過(guò)花色苷，粉末60℃烘干、過(guò)篩備用。
D101、NKC-9、NKA-9、YPR-Ⅱ、S-8、CAD-40、HPD100樹(shù)脂 天津南開(kāi)合成科技有限公司。
1.2儀器與設(shè)備
RV10自動(dòng)控制型立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)IKA集團(tuán)；VIS-7220紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、DZF-6021型真空干燥箱上海恒平科學(xué)儀器有限公司；SHA-CA數(shù)顯水浴恒溫振蕩器 天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器廠；AUY220電子天平 日本島津公司。
1.3方法
1.3.1準(zhǔn)噶爾山楂粗多糖的制備
采用水提醇沉法[17]。取5 g山楂粉末于200 mL蒸餾水中90℃熱水浸提60 min，浸提液減壓濃縮，雙氧水氧化脫色，Sevag試劑除蛋白后4 000 r/min離心10 min，取上清液，加5倍體積的95%乙醇溶液，冰箱靜置24 h后減壓抽濾分離絮狀沉淀，乙醇、丙酮淋洗3次后于60℃恒溫箱烘干，得粗多糖。經(jīng)苯酚-硫酸法測(cè)定，多糖含量為5.06%。
1.3.2大孔樹(shù)脂的預(yù)處理[18]
使用95%乙醇溶液將樹(shù)脂充分浸泡24 h后用無(wú)水乙醇洗滌至無(wú)白色混濁出現(xiàn)，用蒸餾水沖洗樹(shù)脂無(wú)醇味，后分別用5%HCl溶液、5%NaOH溶液浸泡3 h，用蒸餾水洗至pH值為中性。
1.3.3大孔樹(shù)脂的篩選
選用7種不同型號(hào)的樹(shù)脂：D101、NKC-9、NKA-9、YPR-Ⅱ、S-8、CAD-40和HPD100樹(shù)脂，準(zhǔn)確稱取5.0 g預(yù)處理過(guò)的樹(shù)脂放入錐形瓶中，分別加入40μg/mL的上樣液（準(zhǔn)噶爾山楂多糖溶液）30 mL，恒溫25℃，振蕩吸附24 h后分離出樹(shù)脂，加入洗脫液（NaCl溶液）振蕩洗脫24 h，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液的吸光度，根據(jù)式（1）、（2）計(jì)算不同型號(hào)樹(shù)脂的吸附率和洗脫率。
式（1）、（2）中：V1為吸附液體積/mL；V2為洗脫液用量/mL；ρ0為上樣液起始質(zhì)量濃度/（μg/mL）；ρ1為吸附后上樣液質(zhì)量濃度/（μg/mL）；ρ2為洗脫液質(zhì)量濃度/（μg/mL）。
根據(jù)文獻(xiàn)[19]，將上述方法選出的吸附率和洗脫率最高的兩種樹(shù)脂按照不同比例混合，準(zhǔn)確稱取5.0 g預(yù)處理過(guò)的混合樹(shù)脂放入錐形瓶中，量取40μg/mL的準(zhǔn)噶爾山楂多糖溶液30 mL進(jìn)行吸附和洗脫，計(jì)算吸附率和洗脫率，選出最優(yōu)的混合比例。
1.3.4多糖含量測(cè)定
采用苯酚-硫酸法[20]。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：精確量取質(zhì)量濃度為100μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至10 mL具塞比色管中，各用蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL，使用苯酚-硫酸法顯色，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，橫坐標(biāo)X為葡萄糖質(zhì)量濃度（μg/mL），縱坐標(biāo)Y為吸光度，得到回歸方程：Y=0.069 45X+0.002 8（R2=0.999 14），線性關(guān)系良好。
樣品多糖含量的測(cè)定：精確稱量70 mg干燥準(zhǔn)噶爾山楂粗多糖定容至100 mL，苯酚-硫酸法顯色后測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得準(zhǔn)噶爾山楂多糖質(zhì)量濃度，按照式（3）計(jì)算多糖含量。
式中：ρ為液體中多糖質(zhì)量濃度/（μg/mL)；V為液體體積/mL；m為稱取干燥樣品的質(zhì)量/mg。
1.3.5吸附多糖單因素試驗(yàn)
配制pH值分別為6、7、8、9、10，質(zhì)量濃度為1 g/L的準(zhǔn)噶爾山楂多糖溶液，控制流速3 mL/min，流經(jīng)樹(shù)脂徑高比為1∶10的大孔樹(shù)脂柱；配制質(zhì)量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0 g/L的準(zhǔn)噶爾山楂多糖溶液，固定pH 8，控制流速3 mL/min，流經(jīng)樹(shù)脂徑高比為1∶10的大孔樹(shù)脂柱；配制質(zhì)量濃度為0.5 g/L的準(zhǔn)噶爾山楂多糖溶液，固定pH 8，控制流速分別為1.0、3.0、5.0、7.0 mL/min，流經(jīng)樹(shù)脂徑高比為1∶10的大孔樹(shù)脂柱；配制質(zhì)量濃度為0.5 g/L的準(zhǔn)噶爾山楂多糖溶液，固定pH 8，流速為1.0 mL/min，流經(jīng)樹(shù)脂徑高比分別為1∶5、1∶8、1∶10、1∶13、1∶15的大孔樹(shù)脂柱；收集流出液，計(jì)算吸附率。
1.3.6洗脫多糖單因素試驗(yàn)
配制pH值分別為6、7、8、9、10，濃度為0.2 mol/L NaCl溶液，固定洗脫液用量4 BV，控制流速3.0 mL/min進(jìn)行洗脫；配制pH 8、洗脫液用量4 BV、濃度為0.2 mol/L的NaCl溶液，控制流速分別為1.0、3.0、5.0、7.0 mL/min進(jìn)行洗脫；配制pH 8、洗脫液用量4 BV、濃度分別為0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mol/L的NaCl溶液，控制流速1.0 mL/min進(jìn)行洗脫；配制pH 8、濃度0.25 mol/L的NaCl溶液，控制流速1.0 mL/min，洗脫液用量分別為2、4、6、8BV進(jìn)行洗脫；收集洗脫液，計(jì)算洗脫率。
1.3.7 吸附和洗脫多糖的響應(yīng)面試驗(yàn)
選取3 個(gè)對(duì)吸附率和洗脫率影響較大的單因素，設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)[21-23]，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1、2。
表1 吸附多糖響應(yīng)面因素水平表Table 1 Factors and their coded levels of response surface design for the optimization of adsorption conditions
表2 洗脫多糖響應(yīng)面因素水平表Table 2 Factors and their coded levels of response surface design for the optimization of desorption conditions
2 結(jié)果與分析
2.1 大孔樹(shù)脂的篩選
圖1 不同樹(shù)脂對(duì)多糖的吸附和解吸附能力Fig.1 Comparison of polysaccharide adsorption and desorption capacities of different resins
由圖1可以看出，不同型號(hào)樹(shù)脂對(duì)多糖的吸附能力差異較大，利用吸附的可逆性分離多糖，吸附率與洗脫率的高低都將影響多糖純化的程度，由于樹(shù)脂極性不同，吸附洗脫準(zhǔn)噶爾山楂多糖的程度也不同，其中以NKA-9的吸附能力最強(qiáng)，D101洗脫率最高，本實(shí)驗(yàn)將采用NKA-9樹(shù)脂和D101樹(shù)脂按一定比例混合純化準(zhǔn)噶爾山楂粗多糖，旨在提高吸附率與洗脫率。
由圖2可以看出，經(jīng)過(guò)混合后的樹(shù)脂，吸附率與洗脫率都大幅上升，NKA-9與D101樹(shù)脂質(zhì)量比為2∶3時(shí)，吸附率為77%，洗脫率為97%；樹(shù)脂質(zhì)量比為3∶2時(shí)吸附率為78%，洗脫率為74%；樹(shù)脂質(zhì)量比為1∶1時(shí)， 吸附率為74%，洗脫率為85%。因此選擇NKA-9與D101樹(shù)脂比例為2∶3。
圖2 不同混合比例樹(shù)脂的吸附率與洗脫率對(duì)比Fig.2 Comparison of adsorption and desorption capacities of NKA-9:D101 mixtures in different proportions
2.2 動(dòng)態(tài)吸附準(zhǔn)噶爾山楂多糖單因素試驗(yàn)結(jié)果
2.2.1 上樣液pH值對(duì)吸附率的影響
圖3 上樣液pH值對(duì)吸附率的影響Fig.3 Effect of sample pH on the adsorption rate of polysaccharides
由圖3可以看出，混合樹(shù)脂吸附率隨著pH值的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，pH達(dá)到8時(shí)，吸附率最大。這是因?yàn)槎嗵穷愇镔|(zhì)在強(qiáng)堿性條件下會(huì)發(fā)生異構(gòu)化和分解反應(yīng)，因此在弱堿性條件下有利于大孔樹(shù)脂吸附多糖，pH值繼續(xù)升高不利于吸附[24-25]，因此選擇pH 8為最佳上樣液pH值。
2.2.2 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響
圖4 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附率影響Fig.4 Effect of sample concentration on the adsorption rate of polysaccharides
由圖4可以看出，隨著上樣液質(zhì)量濃度從0.5 g/L逐漸增加，吸附率反而下降，這是因?yàn)闃?shù)脂吸附目標(biāo)產(chǎn)物時(shí)，存在著一個(gè)吸附平衡，該平衡和料液質(zhì)量濃度有很大的關(guān)系。尤其是當(dāng)樹(shù)脂的吸附平衡是受液膜擴(kuò)散控制時(shí)，料液質(zhì)量濃度對(duì)樹(shù)脂吸附平衡影響更大[26]，當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度過(guò)大時(shí)，多糖含量高，過(guò)于密集，不能使其更充分地與樹(shù)脂接觸，影響吸附效果，且高質(zhì)量濃度會(huì)增加懸浮雜質(zhì)，堵塞樹(shù)脂孔洞，所以選擇0.5 g/L為上樣液合適質(zhì)量濃度。
2.2.3 上樣液流速對(duì)吸附率的影響
圖5 上樣液流速對(duì)吸附率的影響Fig.5 Effect of sampling flow rate on the adsorption rate of polysaccharides
由圖5可知，隨著上樣液流速的增加，吸附率在不斷降低，上樣液流速為1.0 mL/min時(shí)，混合樹(shù)脂的吸附率最大。這是由于流速的增加意味著多糖的單位時(shí)間流量增加，過(guò)快的流速會(huì)提 前泄漏，不能使樹(shù)脂充分吸附多糖，降低內(nèi)孔利用率，引起損失，流速低，有利于充分吸附，但會(huì)影響生產(chǎn)效率，使生產(chǎn)周期延長(zhǎng)，所以確定1.0 mL/min為上樣液最佳流速。
2.2.4 樹(shù)脂徑高比對(duì)吸附率的影響
圖6 樹(shù)脂徑高比對(duì)吸附率的影響Fig.6 Effect of column diameter-to-height ratio on the adsorption rate of polysaccharides
由圖6可知，大孔樹(shù)脂徑高比和吸附率呈良好的線性關(guān)系，隨著樹(shù)脂徑高比的減小，吸附率不斷增大。因?yàn)闃?shù)脂用量越大，吸附總表面就越大，越有利于吸附過(guò)程的進(jìn)行，但樹(shù)脂用量過(guò)多，又將導(dǎo)致成本增加。從節(jié)省材料和最適吸附率角度考慮，確定1∶13為合適大孔樹(shù)脂徑高比。
2.3 動(dòng)態(tài)洗脫準(zhǔn)噶爾山楂多糖單因素試驗(yàn)結(jié)果
2.3.1 洗脫液pH值對(duì)洗脫率的影響
由圖7可以看出，隨著洗脫液pH值的升高，洗脫率也隨之增高，pH 8時(shí)洗脫率最高，pH 9時(shí)，洗脫率開(kāi)始有所降低，pH值升高到10時(shí)，洗脫率急速下降，這是由于過(guò)堿性的條件會(huì)引起 多糖降解且不符合樹(shù)脂本身性質(zhì)要求，因此選擇pH 8為洗脫液的最佳pH值。
圖7 洗脫液pH值對(duì)洗脫率的影響Fig.7 Influence of eluent pH values on the elution efficiency
2.3.2 洗脫液流速對(duì)洗脫率的影響
圖8 洗脫液流速對(duì)洗脫率的影響Fig.8 Effect of eluent flow rate on the desorption rate of polysaccharides
由圖8可以看出，洗脫液流速與洗脫率成反比例關(guān)系，隨著流速的增大，洗脫率在不斷降低，洗脫液流速為1.0 mL/min時(shí)，多糖的洗脫率最高，這是由于過(guò)快的流速使洗脫液與樹(shù)脂柱接觸不充分，導(dǎo)致多糖洗脫率降低，確定1.0 mL/min為洗脫液的最適流速。
2.3.3 洗脫液濃度對(duì)洗脫率的影響
圖9 洗脫液濃度對(duì)洗脫率的影響Fig.9 Effect of eluent concentration on the desorption rate of polysaccharides
由圖9可以看出，隨著NaCl溶液濃度的增高，洗脫率先升高后下降，出現(xiàn)這種情況是由于鹽濃度過(guò)低會(huì)使多糖更易被吸附，吸附后不易被洗脫，鹽濃度過(guò)高會(huì)使溶液的顆粒物含量增大，降低多糖洗脫率。所以確定0.25 mol/L為洗脫液的最適濃度。
2.3.4 洗脫液用量對(duì)洗脫率的影響
圖10 洗脫液用量的選擇Fig.10 Effect of eluent amount on the desorption rate of polysaccharides
由圖10可以看出，洗脫劑用量與洗脫率呈正相關(guān)，隨著NaCl溶液用量的增加，洗脫率在不斷上升，用量越大，洗脫率越大，但增加幅度不斷減小，在6～8 BV之間增加幅度最小。從節(jié)省洗脫劑的用量的角度考慮，選用6 BV的NaCl溶液洗脫。
2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果
表3 吸附多糖響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Response surface design arrangement and corresponding experimental data for the optimization of adsorption conditions
使用Design-Expert軟件，得到響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3、4。對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析擬合，得到二次多元回歸方程：
吸附率（Y1）對(duì)上樣液流速（A）、上樣液質(zhì)量濃度（B）、樹(shù)脂徑高比（C）的回歸方程：
洗脫率（Y2）對(duì)洗脫液濃度（X1）、洗脫液流速（X2）、洗脫液用量（X3）的回歸方程：
表4 洗脫多糖響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Response surface design arrangement and corresponding experimental data for the optimization of desorption conditions
對(duì)得到的吸附與洗脫回歸模型分別進(jìn)行方差分析如表5、6所示。
表5 吸附率回歸模型的方差分析Table 5 Analysis of variance for the fitted regression equation for the adsorption rate of polysaccharides
吸附模型極顯著（P＜0.001），失擬項(xiàng)（P=0.918 2＞0.05）不顯著，說(shuō)明模型與試驗(yàn)擬合程度較高，可用于上樣液流速（A）、上樣液質(zhì)量濃度（B）、樹(shù)脂徑高比（C）對(duì)樹(shù)脂吸附率的理論預(yù)測(cè)。回歸方程各項(xiàng)顯著性表明：一次項(xiàng)A（P=0.001 9＜0.01）顯著，B（P=0.001）極顯著，C（P=0.004 1＜0.01）顯著，交互項(xiàng)只有BC項(xiàng)有差異，平方項(xiàng)A2為極顯著項(xiàng)，C2為顯著項(xiàng)，根據(jù)回歸方程一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值大小可以得到，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，3 個(gè)因素對(duì)多糖吸附率的影響由大到小排序?yàn)椋荷蠘右嘿|(zhì)量濃度（B）＞上樣液流速（A）＞樹(shù)脂徑高比（C）。
表6 洗脫率回歸模型的方差分析Table 6 Analysis of variance for the fitted regression equation for the desorption rate of polysaccharides
洗脫模型極顯著（P＜0.0 0 0 1），失擬項(xiàng)（P=0.385 2＞0.05）不顯著，說(shuō)明模型與試驗(yàn)擬合程度較高，可用于洗脫液濃度（X1）、洗脫液流速（X2）、洗脫液用量（X3）對(duì)多糖洗脫率的理論預(yù)測(cè)?；貧w方程各項(xiàng)顯著性表明：一次項(xiàng)X1（P＜0.000 1）極顯著，X2、X3都為顯著項(xiàng)，平方項(xiàng)都為極顯著項(xiàng)，為顯著項(xiàng)，說(shuō)明選取的三因素對(duì)NaCl溶液洗脫準(zhǔn)噶爾山楂多糖的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，平方項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值也有很大影響。根據(jù)回歸方程一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值大小可以得到，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，3 個(gè)因素對(duì)多糖洗脫率的影響由大到小排序?yàn)椋合疵撘簼舛龋╔1）＞洗脫液用量（X3）＞洗脫液流速（X2）。
2.5 響應(yīng)面分析
2.5.1 動(dòng)態(tài)吸附多糖各因素間交互作用的響應(yīng)面
圖11 動(dòng)態(tài)吸附多糖各因素間相互影響的響應(yīng)面圖Fig.11 Response surface plots illustrating the effect of adsorption parameters on the adsorption rate of polysaccharides
由圖11a可見(jiàn)，等高線圖呈橢圓形，說(shuō)明上樣液流速和質(zhì)量濃度的交互作用對(duì)多糖吸附率影響顯著，當(dāng)流速相同時(shí)，隨著上樣液質(zhì)量濃度的增大，吸附率變化不顯著；當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度一定時(shí)，隨著流速的增加，吸附率也增加，當(dāng)流速超過(guò)一定范圍時(shí)，反而不利于吸附。由圖11b可見(jiàn)，等高線圖呈圓形，響應(yīng)面圖的坡度較為平緩，說(shuō)明樹(shù)脂徑高比和流速的交互作用對(duì)多糖吸附率影響不顯著，當(dāng)樹(shù)脂徑高比相同時(shí)，隨著流速的增大，吸附率增大；當(dāng)流速相同時(shí)，隨著樹(shù)脂徑高比的 減小，吸附率增大。由圖11c可見(jiàn)，等高線圖呈橢圓形，說(shuō)明樹(shù)脂徑高比和上樣液質(zhì)量濃度的交互作用對(duì)多糖吸附率影響顯著；當(dāng)樹(shù)脂徑高比相同時(shí)，隨著上樣液質(zhì)量濃度的增加，吸附率變化不明顯；當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度一定時(shí)，隨著樹(shù)脂徑高比的減小，吸附率先升高后降低。
通過(guò)對(duì)方程求解得到最佳吸附條件為上樣液流速3.75 mL/min、上樣液質(zhì)量濃度1.32 g/L、樹(shù)脂徑高比1∶13.2，吸附率為62.77%?？紤]到實(shí)際操作的便利，將其修正為上樣液流速3.75 mL/min、質(zhì)量濃度1.32 g/L、樹(shù)脂徑高比1∶13，根據(jù)此條件進(jìn)行吸附驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，吸附率為60.75%。
2.5.2 動(dòng)態(tài)洗脫多糖各因素間交互作用響應(yīng)面
圖12 動(dòng)態(tài)洗脫多糖各因素間交互作用的等高線及響應(yīng)面圖Fig.12 Response surface and contour graphs illustrating the effect of desorption parameters on the desorption rate of polysaccharides
由圖12a可見(jiàn)，等高線圖呈圓形，響應(yīng)面圖的坡度較為平緩，說(shuō)明洗脫液流速和濃度的交互作用對(duì)多糖洗脫率影響不顯著，當(dāng)流速相同時(shí)，隨著濃度的增大，洗脫率升高；當(dāng)濃度一定時(shí)，隨著流速的增加，洗脫率變化不明顯。由圖12b可見(jiàn)，等高線圖呈橢圓形，響應(yīng)面圖的坡度較陡，說(shuō)明洗脫液濃度和用量的交互作用對(duì)多糖洗脫率影響顯著，當(dāng)濃度相同時(shí)，隨著用量的增大，洗脫率變化不明顯；當(dāng)用量相同時(shí)，隨著濃度的增大，洗脫率先增大后減小。由圖12c可見(jiàn)，等高線圖呈橢圓形，說(shuō)明用量和流速的交互作用對(duì)多糖洗脫率影響顯著；當(dāng)用量相同時(shí)，隨著流速的增加，洗脫率變化不明顯；當(dāng)流速一定時(shí)，隨著用量的增大，洗脫率先升高后降低。
對(duì)方程求解，得到最佳洗脫條件為洗脫液濃度0.27 mol/L、洗脫液流速3.44 mL/min、洗脫液用量6.73 BV，洗脫率89.97%，考慮到實(shí)際操作的便利將其修正為洗脫液濃度0.27 mol/L、洗脫液流速3.5 mL/min、洗脫液用量7 BV，根據(jù)此條件進(jìn)行洗脫驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，洗脫率為84.22%，與預(yù)測(cè)值相差不大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)純化后，樣品多糖含量由原來(lái)的5.06%上升至21.13%，可見(jiàn)采用響應(yīng)面法可實(shí)現(xiàn)多條件同步優(yōu)化準(zhǔn)噶爾山楂精制工藝，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
3 結(jié) 論
在比較D101、NKC-9、NKA-9、YPR-Ⅱ、S-8、CAD-40和HPD100樹(shù)脂對(duì)準(zhǔn)噶爾山楂多糖溶液吸附和洗脫效果基礎(chǔ)上選擇NKA-9和D101為最優(yōu)樹(shù)脂。NKA-9與D101樹(shù)脂質(zhì)量比為2∶3對(duì)準(zhǔn)噶爾山楂多糖的吸附洗脫效果最好。最佳吸附工藝條件為上樣液流速3.75 mL/min、質(zhì)量濃度1.32 g/L、樹(shù)脂徑高比1∶13，此條件下多糖的吸附率為60.75%。最佳洗脫工藝條件為洗脫液濃度0.27 mol/L、洗脫液流速3.5 mL/min、洗脫液用量7 BV，此條件下多糖的洗脫率為84.22%。
與常規(guī)方法相比，采用混合大孔樹(shù)脂純化多糖，多糖的損失率較小，能夠較大地提高多糖的得率。經(jīng)過(guò)純化后，樣品多糖含量由原來(lái)的5.06%上升至21.13%，提高近4 倍，本研究為準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)嗵堑募兓峁┬路椒?，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。
[1] 梁寧, 楊磊, 李靖. 多糖研究進(jìn)展[J]. 吉林農(nóng)業(yè), 2011, 20(5): 321-329.
[2] 林龍, 常建波, 孫煜煊. 孔石莼多糖降血糖作用研究[J]. 食品科技, 2012, 37(6): 224-227.
[3] 劉德勝, 劉為忠, 顏玲. 櫻桃葉多糖的抗氧化活性研究[J]. 中國(guó)生化藥物雜志, 2012, 33(5): 571-573.
[4] 徐世忱, 李廣全, 孫瑩. 北五味子粗多糖的提取與成分分析[J]. 吉林醫(yī)藥工業(yè), 1992(4): 15-18.
[5] 方一葦. 具有藥理活性多糖的研究現(xiàn)況[J]. 分析化學(xué), 1994, 22(9): 955-960.
[6] 劉潔, 李文香, 王文亮. 生物多糖研究進(jìn)展[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011(5): 98-101.
[7] 王章姐, 郁萬(wàn)楊, 張夢(mèng)如. 植物多糖研究進(jìn)展[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2014, 10(6): 39.
[8] 安爭(zhēng)夕, 韓英蘭, 李學(xué)禹. 新疆植物志[M]. 2版. 烏魯木齊: 新疆科技衛(wèi)生出版社, 1995: 282.
[9] 任艷利, 張維, 劉影. 準(zhǔn)噶爾山楂葉總黃酮的超聲波提取及抗氧化研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(15): 8710-8712.
[10] 任艷利, 張相鋒, 趙玉. 超聲波提取準(zhǔn)噶爾山楂中的熊果酸與抗氧化研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào), 2012, 8(1): 46-48.
[11] 呂海英, 周露露, 李進(jìn). 準(zhǔn)噶爾山楂果實(shí)色素提取工藝研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào), 2011, 17(9): 25-27.
[12] 趙靜虹, 穆楠, 閆桂琴. 大孔樹(shù)脂純化翅果油樹(shù)葉片多糖的研究[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2012, 34(4): 78-82.
[13] 雍曉靜, 劉鋼, 張境. 應(yīng)用大孔樹(shù)脂分離純化枸杞葉總黃酮的研究[J].寧夏大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2005, 26(2): 148-150.
[14] 蔡丹昭, 劉華鋼. 大孔吸附樹(shù)脂分離純化番石榴葉總黃酮的研究[J].生命科學(xué)研究, 2008, 12(1): 57-60.
[15] 王明艷, 張小杰, 王濤. 響應(yīng)面法優(yōu)化香椿葉多糖的提取條件[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(4): 106-110.
[16] 崔鳳杰, 許泓瑜. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化灰樹(shù)花水溶性多糖提取工藝的研究[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(4): 142-146.
[17] 馬玉婷, 李進(jìn), 張志怡. 響應(yīng)面法優(yōu)化黑果枸杞酒渣多糖精制工藝[J].食品科學(xué), 2012, 33(6): 37-43.
[18] 劉安軍, 劉慧慧, 郭丹霄, 等. 大孔吸附樹(shù)脂分離純化枸杞葉總黃酮的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2012, 28(3): 292-296.
[19] 黃金龍, 殷之武, 何新華. 銀杏葉總黃酮純化工藝研究[J]. 中草藥, 2012, 43(5): 922-925.
[20] 劉曉涵, 陳永剛, 林勵(lì). 蒽酮硫酸法與苯酚硫酸法測(cè)定枸杞子中多糖含量的比較[J]. 食品科技, 2009, 34(9): 270-272.
[21] GUO Lei, CHEN Yu. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides fromEnteromorpha proliferaby response surface methodology[J]. Food Scie nce, 2010, 31(16): 117-121.
[22] NEDIM T, ESRA Y. Ultrasound-assisted extraction of d-pinitol from carob pods using response surface methodology[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2014, 21(2): 860-865.
[23] 王莉, 趙樺, 馬英麗. 響應(yīng)面法優(yōu)化小叢紅景天多糖超聲提取工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2014, 35(14): 315-320.
[24] 黃永春, 楊鋒, 馬月飛. D941大孔樹(shù)脂吸附茶多糖的熱力學(xué)研究[J].食品科學(xué), 2008, 29(11): 274-277.
[25] 黃建明, 郭濟(jì)賢, 陳萬(wàn)生, 等. 大孔樹(shù)脂對(duì)草烏生物堿的吸附性能及提純工藝[J]. 復(fù)旦學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版, 2003, 30(3): 267-269.
[26] 楊樂(lè), 王洪新, 秦曉娟. 大孔樹(shù)脂純化筍殼中的黃酮物質(zhì)[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2011, 30(2): 218-223.
Optimization of Purification Process for Crude Polysaccharides from the Pomace of Wild Crataegus songorica in Xinjiang by Response Surface Methodology
ZHANG Yu, LI Jin*, L? Haiying, ZHANG Xia, ZHANG Huali
(Xinjiang Key Laboratory of Special Sp ecies Conservation and Regulatory Biology, College of L ife Sciences, Xinjiang Normal University, ?rümqi 830054, China)
In order to improve the purity of polysaccharides from the pomace of wild Crataegus songorica, NKA-9 and D101 were selected from 7 kinds of macroporous resins by static adsorption-desorption experiments, and the two selected resins were mixed at an appropriate ratio. On the basis of single factor expe riments, response surface methodology was used to optimize process parameters. The optimal mixing ratio of NKA-9 to D101-1 was 2:3 (by mass). The optimum experimental parameters for adsorption were as follows: sample loading fl ow rate, 3.75 mL/min; sample concentration, 1.32 g/L; and resin diameter-to-height ratio, 1:13, yielding a rate of adsorption of 60.75%. Under the optimal desorption conditions: 7 BV of 0.27 mol/L NaCl as eluent at a fl ow rate of 3.5 mL/min, a rate of desorption of 84.22% could be achieved. The content of polysaccharides was increased from 5.06% to 21.13%.
Crataegus songorica; polys accharides; response surface methodology; purifi cation
Q946.8
A
1002-6630（2015）12-0022-07
10.7506/spkx1002-6630-201512005
2014-11-22
國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31200300）；新疆維吾爾自治區(qū)教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（XJSD2013-0104）
張玉（1990—），女，碩士研究生，主要從事植物資源研究。E-mail：1107662720@qq.com
*通信作者：李進(jìn)（1969—），男，教授，博士，主要從事植物生理生態(tài)和資源利用研究。E-mail：xjcjlj4@xjnu.edu.cn
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（新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 8 30054）
響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化新疆野生準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)卸嗵羌兓に?/p>
張 玉，李 進(jìn)*，呂海英，張 俠，張花麗
（新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 8 30054）
為純化準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)械拇侄嗵牵ㄟ^(guò)動(dòng)態(tài)吸附和洗脫實(shí)驗(yàn)從7 種大孔吸附樹(shù)脂中選出兩種最優(yōu)樹(shù)脂NKA-9和D101，按一定比例進(jìn)行混合實(shí)驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法確定最佳純化條件：NKA-9與D101樹(shù)脂最佳混合質(zhì)量比為2∶3；最佳吸附工藝條件為上樣液流速3.75 mL/min、上樣液質(zhì)量濃度1.32 g/L、樹(shù)脂徑高比1∶13，此條件下多糖的吸附率為60.75%；最佳洗脫工藝條件為洗脫液濃度0.27 mol/L、洗脫液流速3.5 mL/min、洗脫液用量7 BV，此條件下多糖的洗脫率為84.22%。樣品中 多糖含量由原來(lái)的5.06%上升至21.13%。
準(zhǔn)噶爾山楂；多糖；響應(yīng)面法；精制工藝
多糖又稱多聚糖，是由多個(gè)單糖聚合而成的天然高分子化合物，在動(dòng)植物體內(nèi)廣泛存在，分布極廣[1-3]，植物多糖由于其具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、延緩衰老、降低糖脂等生物活性，在抗生素替代物及保健品領(lǐng)域已有很廣泛的應(yīng)用[4-7]。
準(zhǔn)噶爾山楂（ Crataegus songarica）是薔薇科山楂屬植物，是新疆特有落葉小喬木，現(xiàn)已被列為三級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物并被列入中國(guó)優(yōu)先保護(hù)物種名錄，生長(zhǎng)于河谷或干旱碎石坡地，海拔700～20 000 m，在中國(guó)大陸僅分布 于新疆霍城縣，在俄羅斯、阿富汗、伊朗等地也有分布，花期5～6 個(gè)月，果期7～8 個(gè)月[8]。研究表明，其果實(shí)中富含抗細(xì)胞氧化的黃酮類[9]、熊果酸[10]、天然花色苷[11]等，然而對(duì)于準(zhǔn)噶爾山楂多糖的研究還未見(jiàn)報(bào)道。
大孔吸附樹(shù)脂是一種具有良好的大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大比表面積的高分子型吸附樹(shù)脂，與傳統(tǒng)吸附劑相比，它具有選擇吸附性強(qiáng)、解吸條件溫和、吸附量大、耐污染、使用壽命長(zhǎng)、機(jī)械強(qiáng)度高、再生容易等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)我國(guó)將其作為中藥分離純化的常用方法[12-14]。
響應(yīng)面法是采用多元二次回歸方程擬合響應(yīng)項(xiàng)與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，得到最優(yōu)工藝條件的有效方法之一，目前，該分析方法已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)[15-16]。
目前準(zhǔn)噶爾山楂資源沒(méi)有被充分利用，其果實(shí)提取過(guò)花色苷后產(chǎn)生的大量殘?jiān)ǔ１恢苯觼G棄，前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些殘?jiān)泻写罅慷嗵穷愇镔|(zhì)。本實(shí)驗(yàn)以提取過(guò)花色苷的準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)鼮樵咸崛《嗵牵庙憫?yīng)面法優(yōu)化多糖精制工藝，為更高效地利用新疆特有準(zhǔn)噶爾山楂資源提供一定的科學(xué)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
準(zhǔn)噶爾山楂成熟果實(shí)采于新疆伊犁，已提取過(guò)花色苷，粉末60℃烘干、過(guò)篩備用。
D101、NKC-9、NKA-9、YPR-Ⅱ、S-8、CAD-40、HPD100樹(shù)脂 天津南開(kāi)合成科技有限公司。
1.2儀器與設(shè)備
RV10自動(dòng)控制型立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)IKA集團(tuán)；VIS-7220紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、DZF-6021型真空干燥箱上海恒平科學(xué)儀器有限公司；SHA-CA數(shù)顯水浴恒溫振蕩器 天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器廠；AUY220電子天平 日本島津公司。
1.3方法
1.3.1準(zhǔn)噶爾山楂粗多糖的制備
采用水提醇沉法[17]。取5 g山楂粉末于200 mL蒸餾水中90℃熱水浸提60 min，浸提液減壓濃縮，雙氧水氧化脫色，Sevag試劑除蛋白后4 000 r/min離心10 min，取上清液，加5倍體積的95%乙醇溶液，冰箱靜置24 h后減壓抽濾分離絮狀沉淀，乙醇、丙酮淋洗3次后于60℃恒溫箱烘干，得粗多糖。經(jīng)苯酚-硫酸法測(cè)定，多糖含量為5.06%。
1.3.2大孔樹(shù)脂的預(yù)處理[18]
使用95%乙醇溶液將樹(shù)脂充分浸泡24 h后用無(wú)水乙醇洗滌至無(wú)白色混濁出現(xiàn)，用蒸餾水沖洗樹(shù)脂無(wú)醇味，后分別用5%HCl溶液、5%NaOH溶液浸泡3 h，用蒸餾水洗至pH值為中性。
1.3.3大孔樹(shù)脂的篩選
選用7種不同型號(hào)的樹(shù)脂：D101、NKC-9、NKA-9、YPR-Ⅱ、S-8、CAD-40和HPD100樹(shù)脂，準(zhǔn)確稱取5.0 g預(yù)處理過(guò)的樹(shù)脂放入錐形瓶中，分別加入40μg/mL的上樣液（準(zhǔn)噶爾山楂多糖溶液）30 mL，恒溫25℃，振蕩吸附24 h后分離出樹(shù)脂，加入洗脫液（NaCl溶液）振蕩洗脫24 h，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液的吸光度，根據(jù)式（1）、（2）計(jì)算不同型號(hào)樹(shù)脂的吸附率和洗脫率。
式（1）、（2）中：V1為吸附液體積/mL；V2為洗脫液用量/mL；ρ0為上樣液起始質(zhì)量濃度/（μg/mL）；ρ1為吸附后上樣液質(zhì)量濃度/（μg/mL）；ρ2為洗脫液質(zhì)量濃度/（μg/mL）。
根據(jù)文獻(xiàn)[19]，將上述方法選出的吸附率和洗脫率最高的兩種樹(shù)脂按照不同比例混合，準(zhǔn)確稱取5.0 g預(yù)處理過(guò)的混合樹(shù)脂放入錐形瓶中，量取40μg/mL的準(zhǔn)噶爾山楂多糖溶液30 mL進(jìn)行吸附和洗脫，計(jì)算吸附率和洗脫率，選出最優(yōu)的混合比例。
1.3.4多糖含量測(cè)定
采用苯酚-硫酸法[20]。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：精確量取質(zhì)量濃度為100μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至10 mL具塞比色管中，各用蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL，使用苯酚-硫酸法顯色，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，橫坐標(biāo)X為葡萄糖質(zhì)量濃度（μg/mL），縱坐標(biāo)Y為吸光度，得到回歸方程：Y=0.069 45X+0.002 8（R2=0.999 14），線性關(guān)系良好。
樣品多糖含量的測(cè)定：精確稱量70 mg干燥準(zhǔn)噶爾山楂粗多糖定容至100 mL，苯酚-硫酸法顯色后測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得準(zhǔn)噶爾山楂多糖質(zhì)量濃度，按照式（3）計(jì)算多糖含量。
式中：ρ為液體中多糖質(zhì)量濃度/（μg/mL)；V為液體體積/mL；m為稱取干燥樣品的質(zhì)量/mg。
1.3.5吸附多糖單因素試驗(yàn)
配制pH值分別為6、7、8、9、10，質(zhì)量濃度為1 g/L的準(zhǔn)噶爾山楂多糖溶液，控制流速3 mL/min，流經(jīng)樹(shù)脂徑高比為1∶10的大孔樹(shù)脂柱；配制質(zhì)量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0 g/L的準(zhǔn)噶爾山楂多糖溶液，固定pH 8，控制流速3 mL/min，流經(jīng)樹(shù)脂徑高比為1∶10的大孔樹(shù)脂柱；配制質(zhì)量濃度為0.5 g/L的準(zhǔn)噶爾山楂多糖溶液，固定pH 8，控制流速分別為1.0、3.0、5.0、7.0 mL/min，流經(jīng)樹(shù)脂徑高比為1∶10的大孔樹(shù)脂柱；配制質(zhì)量濃度為0.5 g/L的準(zhǔn)噶爾山楂多糖溶液，固定pH 8，流速為1.0 mL/min，流經(jīng)樹(shù)脂徑高比分別為1∶5、1∶8、1∶10、1∶13、1∶15的大孔樹(shù)脂柱；收集流出液，計(jì)算吸附率。
1.3.6洗脫多糖單因素試驗(yàn)
配制pH值分別為6、7、8、9、10，濃度為0.2 mol/L NaCl溶液，固定洗脫液用量4 BV，控制流速3.0 mL/min進(jìn)行洗脫；配制pH 8、洗脫液用量4 BV、濃度為0.2 mol/L的NaCl溶液，控制流速分別為1.0、3.0、5.0、7.0 mL/min進(jìn)行洗脫；配制pH 8、洗脫液用量4 BV、濃度分別為0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mol/L的NaCl溶液，控制流速1.0 mL/min進(jìn)行洗脫；配制pH 8、濃度0.25 mol/L的NaCl溶液，控制流速1.0 mL/min，洗脫液用量分別為2、4、6、8BV進(jìn)行洗脫；收集洗脫液，計(jì)算洗脫率。
1.3.7 吸附和洗脫多糖的響應(yīng)面試驗(yàn)
選取3 個(gè)對(duì)吸附率和洗脫率影響較大的單因素，設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)[21-23]，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1、2。
表1 吸附多糖響應(yīng)面因素水平表Table 1 Factors and their coded levels of response surface design for the optimization of adsorption conditions
表2 洗脫多糖響應(yīng)面因素水平表Table 2 Factors and their coded levels of response surface design for the optimization of desorption conditions
2 結(jié)果與分析
2.1 大孔樹(shù)脂的篩選
圖1 不同樹(shù)脂對(duì)多糖的吸附和解吸附能力Fig.1 Comparison of polysaccharide adsorption and desorption capacities of different resins
由圖1可以看出，不同型號(hào)樹(shù)脂對(duì)多糖的吸附能力差異較大，利用吸附的可逆性分離多糖，吸附率與洗脫率的高低都將影響多糖純化的程度，由于樹(shù)脂極性不同，吸附洗脫準(zhǔn)噶爾山楂多糖的程度也不同，其中以NKA-9的吸附能力最強(qiáng)，D101洗脫率最高，本實(shí)驗(yàn)將采用NKA-9樹(shù)脂和D101樹(shù)脂按一定比例混合純化準(zhǔn)噶爾山楂粗多糖，旨在提高吸附率與洗脫率。
由圖2可以看出，經(jīng)過(guò)混合后的樹(shù)脂，吸附率與洗脫率都大幅上升，NKA-9與D101樹(shù)脂質(zhì)量比為2∶3時(shí)，吸附率為77%，洗脫率為97%；樹(shù)脂質(zhì)量比為3∶2時(shí)吸附率為78%，洗脫率為74%；樹(shù)脂質(zhì)量比為1∶1時(shí)， 吸附率為74%，洗脫率為85%。因此選擇NKA-9與D101樹(shù)脂比例為2∶3。
圖2 不同混合比例樹(shù)脂的吸附率與洗脫率對(duì)比Fig.2 Comparison of adsorption and desorption capacities of NKA-9:D101 mixtures in different proportions
2.2 動(dòng)態(tài)吸附準(zhǔn)噶爾山楂多糖單因素試驗(yàn)結(jié)果
2.2.1 上樣液pH值對(duì)吸附率的影響
圖3 上樣液pH值對(duì)吸附率的影響Fig.3 Effect of sample pH on the adsorption rate of polysaccharides
由圖3可以看出，混合樹(shù)脂吸附率隨著pH值的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，pH達(dá)到8時(shí)，吸附率最大。這是因?yàn)槎嗵穷愇镔|(zhì)在強(qiáng)堿性條件下會(huì)發(fā)生異構(gòu)化和分解反應(yīng)，因此在弱堿性條件下有利于大孔樹(shù)脂吸附多糖，pH值繼續(xù)升高不利于吸附[24-25]，因此選擇pH 8為最佳上樣液pH值。
2.2.2 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響
圖4 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附率影響Fig.4 Effect of sample concentration on the adsorption rate of polysaccharides
由圖4可以看出，隨著上樣液質(zhì)量濃度從0.5 g/L逐漸增加，吸附率反而下降，這是因?yàn)闃?shù)脂吸附目標(biāo)產(chǎn)物時(shí)，存在著一個(gè)吸附平衡，該平衡和料液質(zhì)量濃度有很大的關(guān)系。尤其是當(dāng)樹(shù)脂的吸附平衡是受液膜擴(kuò)散控制時(shí)，料液質(zhì)量濃度對(duì)樹(shù)脂吸附平衡影響更大[26]，當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度過(guò)大時(shí)，多糖含量高，過(guò)于密集，不能使其更充分地與樹(shù)脂接觸，影響吸附效果，且高質(zhì)量濃度會(huì)增加懸浮雜質(zhì)，堵塞樹(shù)脂孔洞，所以選擇0.5 g/L為上樣液合適質(zhì)量濃度。
2.2.3 上樣液流速對(duì)吸附率的影響
圖5 上樣液流速對(duì)吸附率的影響Fig.5 Effect of sampling flow rate on the adsorption rate of polysaccharides
由圖5可知，隨著上樣液流速的增加，吸附率在不斷降低，上樣液流速為1.0 mL/min時(shí)，混合樹(shù)脂的吸附率最大。這是由于流速的增加意味著多糖的單位時(shí)間流量增加，過(guò)快的流速會(huì)提 前泄漏，不能使樹(shù)脂充分吸附多糖，降低內(nèi)孔利用率，引起損失，流速低，有利于充分吸附，但會(huì)影響生產(chǎn)效率，使生產(chǎn)周期延長(zhǎng)，所以確定1.0 mL/min為上樣液最佳流速。
2.2.4 樹(shù)脂徑高比對(duì)吸附率的影響
圖6 樹(shù)脂徑高比對(duì)吸附率的影響Fig.6 Effect of column diameter-to-height ratio on the adsorption rate of polysaccharides
由圖6可知，大孔樹(shù)脂徑高比和吸附率呈良好的線性關(guān)系，隨著樹(shù)脂徑高比的減小，吸附率不斷增大。因?yàn)闃?shù)脂用量越大，吸附總表面就越大，越有利于吸附過(guò)程的進(jìn)行，但樹(shù)脂用量過(guò)多，又將導(dǎo)致成本增加。從節(jié)省材料和最適吸附率角度考慮，確定1∶13為合適大孔樹(shù)脂徑高比。
2.3 動(dòng)態(tài)洗脫準(zhǔn)噶爾山楂多糖單因素試驗(yàn)結(jié)果
2.3.1 洗脫液pH值對(duì)洗脫率的影響
由圖7可以看出，隨著洗脫液pH值的升高，洗脫率也隨之增高，pH 8時(shí)洗脫率最高，pH 9時(shí)，洗脫率開(kāi)始有所降低，pH值升高到10時(shí)，洗脫率急速下降，這是由于過(guò)堿性的條件會(huì)引起 多糖降解且不符合樹(shù)脂本身性質(zhì)要求，因此選擇pH 8為洗脫液的最佳pH值。
圖7 洗脫液pH值對(duì)洗脫率的影響Fig.7 Influence of eluent pH values on the elution efficiency
2.3.2 洗脫液流速對(duì)洗脫率的影響
圖8 洗脫液流速對(duì)洗脫率的影響Fig.8 Effect of eluent flow rate on the desorption rate of polysaccharides
由圖8可以看出，洗脫液流速與洗脫率成反比例關(guān)系，隨著流速的增大，洗脫率在不斷降低，洗脫液流速為1.0 mL/min時(shí)，多糖的洗脫率最高，這是由于過(guò)快的流速使洗脫液與樹(shù)脂柱接觸不充分，導(dǎo)致多糖洗脫率降低，確定1.0 mL/min為洗脫液的最適流速。
2.3.3 洗脫液濃度對(duì)洗脫率的影響
圖9 洗脫液濃度對(duì)洗脫率的影響Fig.9 Effect of eluent concentration on the desorption rate of polysaccharides
由圖9可以看出，隨著NaCl溶液濃度的增高，洗脫率先升高后下降，出現(xiàn)這種情況是由于鹽濃度過(guò)低會(huì)使多糖更易被吸附，吸附后不易被洗脫，鹽濃度過(guò)高會(huì)使溶液的顆粒物含量增大，降低多糖洗脫率。所以確定0.25 mol/L為洗脫液的最適濃度。
2.3.4 洗脫液用量對(duì)洗脫率的影響
圖10 洗脫液用量的選擇Fig.10 Effect of eluent amount on the desorption rate of polysaccharides
由圖10可以看出，洗脫劑用量與洗脫率呈正相關(guān)，隨著NaCl溶液用量的增加，洗脫率在不斷上升，用量越大，洗脫率越大，但增加幅度不斷減小，在6～8 BV之間增加幅度最小。從節(jié)省洗脫劑的用量的角度考慮，選用6 BV的NaCl溶液洗脫。
2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果
表3 吸附多糖響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Response surface design arrangement and corresponding experimental data for the optimization of adsorption conditions
使用Design-Expert軟件，得到響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3、4。對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析擬合，得到二次多元回歸方程：
吸附率（Y1）對(duì)上樣液流速（A）、上樣液質(zhì)量濃度（B）、樹(shù)脂徑高比（C）的回歸方程：
洗脫率（Y2）對(duì)洗脫液濃度（X1）、洗脫液流速（X2）、洗脫液用量（X3）的回歸方程：
表4 洗脫多糖響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Response surface design arrangement and corresponding experimental data for the optimization of desorption conditions
對(duì)得到的吸附與洗脫回歸模型分別進(jìn)行方差分析如表5、6所示。
表5 吸附率回歸模型的方差分析Table 5 Analysis of variance for the fitted regression equation for the adsorption rate of polysaccharides
吸附模型極顯著（P＜0.001），失擬項(xiàng)（P=0.918 2＞0.05）不顯著，說(shuō)明模型與試驗(yàn)擬合程度較高，可用于上樣液流速（A）、上樣液質(zhì)量濃度（B）、樹(shù)脂徑高比（C）對(duì)樹(shù)脂吸附率的理論預(yù)測(cè)。回歸方程各項(xiàng)顯著性表明：一次項(xiàng)A（P=0.001 9＜0.01）顯著，B（P=0.001）極顯著，C（P=0.004 1＜0.01）顯著，交互項(xiàng)只有BC項(xiàng)有差異，平方項(xiàng)A2為極顯著項(xiàng)，C2為顯著項(xiàng)，根據(jù)回歸方程一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值大小可以得到，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，3 個(gè)因素對(duì)多糖吸附率的影響由大到小排序?yàn)椋荷蠘右嘿|(zhì)量濃度（B）＞上樣液流速（A）＞樹(shù)脂徑高比（C）。
表6 洗脫率回歸模型的方差分析Table 6 Analysis of variance for the fitted regression equation for the desorption rate of polysaccharides
洗脫模型極顯著（P＜0.0 0 0 1），失擬項(xiàng)（P=0.385 2＞0.05）不顯著，說(shuō)明模型與試驗(yàn)擬合程度較高，可用于洗脫液濃度（X1）、洗脫液流速（X2）、洗脫液用量（X3）對(duì)多糖洗脫率的理論預(yù)測(cè)?；貧w方程各項(xiàng)顯著性表明：一次項(xiàng)X1（P＜0.000 1）極顯著，X2、X3都為顯著項(xiàng)，平方項(xiàng)都為極顯著項(xiàng)，為顯著項(xiàng)，說(shuō)明選取的三因素對(duì)NaCl溶液洗脫準(zhǔn)噶爾山楂多糖的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，平方項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值也有很大影響。根據(jù)回歸方程一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值大小可以得到，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，3 個(gè)因素對(duì)多糖洗脫率的影響由大到小排序?yàn)椋合疵撘簼舛龋╔1）＞洗脫液用量（X3）＞洗脫液流速（X2）。
2.5 響應(yīng)面分析
2.5.1 動(dòng)態(tài)吸附多糖各因素間交互作用的響應(yīng)面
圖11 動(dòng)態(tài)吸附多糖各因素間相互影響的響應(yīng)面圖Fig.11 Response surface plots illustrating the effect of adsorption parameters on the adsorption rate of polysaccharides
由圖11a可見(jiàn)，等高線圖呈橢圓形，說(shuō)明上樣液流速和質(zhì)量濃度的交互作用對(duì)多糖吸附率影響顯著，當(dāng)流速相同時(shí)，隨著上樣液質(zhì)量濃度的增大，吸附率變化不顯著；當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度一定時(shí)，隨著流速的增加，吸附率也增加，當(dāng)流速超過(guò)一定范圍時(shí)，反而不利于吸附。由圖11b可見(jiàn)，等高線圖呈圓形，響應(yīng)面圖的坡度較為平緩，說(shuō)明樹(shù)脂徑高比和流速的交互作用對(duì)多糖吸附率影響不顯著，當(dāng)樹(shù)脂徑高比相同時(shí)，隨著流速的增大，吸附率增大；當(dāng)流速相同時(shí)，隨著樹(shù)脂徑高比的 減小，吸附率增大。由圖11c可見(jiàn)，等高線圖呈橢圓形，說(shuō)明樹(shù)脂徑高比和上樣液質(zhì)量濃度的交互作用對(duì)多糖吸附率影響顯著；當(dāng)樹(shù)脂徑高比相同時(shí)，隨著上樣液質(zhì)量濃度的增加，吸附率變化不明顯；當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度一定時(shí)，隨著樹(shù)脂徑高比的減小，吸附率先升高后降低。
通過(guò)對(duì)方程求解得到最佳吸附條件為上樣液流速3.75 mL/min、上樣液質(zhì)量濃度1.32 g/L、樹(shù)脂徑高比1∶13.2，吸附率為62.77%?？紤]到實(shí)際操作的便利，將其修正為上樣液流速3.75 mL/min、質(zhì)量濃度1.32 g/L、樹(shù)脂徑高比1∶13，根據(jù)此條件進(jìn)行吸附驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，吸附率為60.75%。
2.5.2 動(dòng)態(tài)洗脫多糖各因素間交互作用響應(yīng)面
圖12 動(dòng)態(tài)洗脫多糖各因素間交互作用的等高線及響應(yīng)面圖Fig.12 Response surface and contour graphs illustrating the effect of desorption parameters on the desorption rate of polysaccharides
由圖12a可見(jiàn)，等高線圖呈圓形，響應(yīng)面圖的坡度較為平緩，說(shuō)明洗脫液流速和濃度的交互作用對(duì)多糖洗脫率影響不顯著，當(dāng)流速相同時(shí)，隨著濃度的增大，洗脫率升高；當(dāng)濃度一定時(shí)，隨著流速的增加，洗脫率變化不明顯。由圖12b可見(jiàn)，等高線圖呈橢圓形，響應(yīng)面圖的坡度較陡，說(shuō)明洗脫液濃度和用量的交互作用對(duì)多糖洗脫率影響顯著，當(dāng)濃度相同時(shí)，隨著用量的增大，洗脫率變化不明顯；當(dāng)用量相同時(shí)，隨著濃度的增大，洗脫率先增大后減小。由圖12c可見(jiàn)，等高線圖呈橢圓形，說(shuō)明用量和流速的交互作用對(duì)多糖洗脫率影響顯著；當(dāng)用量相同時(shí)，隨著流速的增加，洗脫率變化不明顯；當(dāng)流速一定時(shí)，隨著用量的增大，洗脫率先升高后降低。
對(duì)方程求解，得到最佳洗脫條件為洗脫液濃度0.27 mol/L、洗脫液流速3.44 mL/min、洗脫液用量6.73 BV，洗脫率89.97%，考慮到實(shí)際操作的便利將其修正為洗脫液濃度0.27 mol/L、洗脫液流速3.5 mL/min、洗脫液用量7 BV，根據(jù)此條件進(jìn)行洗脫驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，洗脫率為84.22%，與預(yù)測(cè)值相差不大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)純化后，樣品多糖含量由原來(lái)的5.06%上升至21.13%，可見(jiàn)采用響應(yīng)面法可實(shí)現(xiàn)多條件同步優(yōu)化準(zhǔn)噶爾山楂精制工藝，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
3 結(jié) 論
在比較D101、NKC-9、NKA-9、YPR-Ⅱ、S-8、CAD-40和HPD100樹(shù)脂對(duì)準(zhǔn)噶爾山楂多糖溶液吸附和洗脫效果基礎(chǔ)上選擇NKA-9和D101為最優(yōu)樹(shù)脂。NKA-9與D101樹(shù)脂質(zhì)量比為2∶3對(duì)準(zhǔn)噶爾山楂多糖的吸附洗脫效果最好。最佳吸附工藝條件為上樣液流速3.75 mL/min、質(zhì)量濃度1.32 g/L、樹(shù)脂徑高比1∶13，此條件下多糖的吸附率為60.75%。最佳洗脫工藝條件為洗脫液濃度0.27 mol/L、洗脫液流速3.5 mL/min、洗脫液用量7 BV，此條件下多糖的洗脫率為84.22%。
與常規(guī)方法相比，采用混合大孔樹(shù)脂純化多糖，多糖的損失率較小，能夠較大地提高多糖的得率。經(jīng)過(guò)純化后，樣品多糖含量由原來(lái)的5.06%上升至21.13%，提高近4 倍，本研究為準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)嗵堑募兓峁┬路椒?，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。
[1] 梁寧, 楊磊, 李靖. 多糖研究進(jìn)展[J]. 吉林農(nóng)業(yè), 2011, 20(5): 321-329.
[2] 林龍, 常建波, 孫煜煊. 孔石莼多糖降血糖作用研究[J]. 食品科技, 2012, 37(6): 224-227.
[3] 劉德勝, 劉為忠, 顏玲. 櫻桃葉多糖的抗氧化活性研究[J]. 中國(guó)生化藥物雜志, 2012, 33(5): 571-573.
[4] 徐世忱, 李廣全, 孫瑩. 北五味子粗多糖的提取與成分分析[J]. 吉林醫(yī)藥工業(yè), 1992(4): 15-18.
[5] 方一葦. 具有藥理活性多糖的研究現(xiàn)況[J]. 分析化學(xué), 1994, 22(9): 955-960.
[6] 劉潔, 李文香, 王文亮. 生物多糖研究進(jìn)展[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011(5): 98-101.
[7] 王章姐, 郁萬(wàn)楊, 張夢(mèng)如. 植物多糖研究進(jìn)展[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2014, 10(6): 39.
[8] 安爭(zhēng)夕, 韓英蘭, 李學(xué)禹. 新疆植物志[M]. 2版. 烏魯木齊: 新疆科技衛(wèi)生出版社, 1995: 282.
[9] 任艷利, 張維, 劉影. 準(zhǔn)噶爾山楂葉總黃酮的超聲波提取及抗氧化研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(15): 8710-8712.
[10] 任艷利, 張相鋒, 趙玉. 超聲波提取準(zhǔn)噶爾山楂中的熊果酸與抗氧化研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào), 2012, 8(1): 46-48.
[11] 呂海英, 周露露, 李進(jìn). 準(zhǔn)噶爾山楂果實(shí)色素提取工藝研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào), 2011, 17(9): 25-27.
[12] 趙靜虹, 穆楠, 閆桂琴. 大孔樹(shù)脂純化翅果油樹(shù)葉片多糖的研究[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2012, 34(4): 78-82.
[13] 雍曉靜, 劉鋼, 張境. 應(yīng)用大孔樹(shù)脂分離純化枸杞葉總黃酮的研究[J].寧夏大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2005, 26(2): 148-150.
[14] 蔡丹昭, 劉華鋼. 大孔吸附樹(shù)脂分離純化番石榴葉總黃酮的研究[J].生命科學(xué)研究, 2008, 12(1): 57-60.
[15] 王明艷, 張小杰, 王濤. 響應(yīng)面法優(yōu)化香椿葉多糖的提取條件[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(4): 106-110.
[16] 崔鳳杰, 許泓瑜. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化灰樹(shù)花水溶性多糖提取工藝的研究[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(4): 142-146.
[17] 馬玉婷, 李進(jìn), 張志怡. 響應(yīng)面法優(yōu)化黑果枸杞酒渣多糖精制工藝[J].食品科學(xué), 2012, 33(6): 37-43.
[18] 劉安軍, 劉慧慧, 郭丹霄, 等. 大孔吸附樹(shù)脂分離純化枸杞葉總黃酮的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2012, 28(3): 292-296.
[19] 黃金龍, 殷之武, 何新華. 銀杏葉總黃酮純化工藝研究[J]. 中草藥, 2012, 43(5): 922-925.
[20] 劉曉涵, 陳永剛, 林勵(lì). 蒽酮硫酸法與苯酚硫酸法測(cè)定枸杞子中多糖含量的比較[J]. 食品科技, 2009, 34(9): 270-272.
[21] GUO Lei, CHEN Yu. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides fromEnteromorpha proliferaby response surface methodology[J]. Food Scie nce, 2010, 31(16): 117-121.
[22] NEDIM T, ESRA Y. Ultrasound-assisted extraction of d-pinitol from carob pods using response surface methodology[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2014, 21(2): 860-865.
[23] 王莉, 趙樺, 馬英麗. 響應(yīng)面法優(yōu)化小叢紅景天多糖超聲提取工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2014, 35(14): 315-320.
[24] 黃永春, 楊鋒, 馬月飛. D941大孔樹(shù)脂吸附茶多糖的熱力學(xué)研究[J].食品科學(xué), 2008, 29(11): 274-277.
[25] 黃建明, 郭濟(jì)賢, 陳萬(wàn)生, 等. 大孔樹(shù)脂對(duì)草烏生物堿的吸附性能及提純工藝[J]. 復(fù)旦學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版, 2003, 30(3): 267-269.
[26] 楊樂(lè), 王洪新, 秦曉娟. 大孔樹(shù)脂純化筍殼中的黃酮物質(zhì)[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2011, 30(2): 218-223.
Optimization of Purification Process for Crude Polysaccharides from the Pomace of Wild Crataegus songorica in Xinjiang by Response Surface Methodology
ZHANG Yu, LI Jin*, L? Haiying, ZHANG Xia, ZHANG Huali
(Xinjiang Key Laboratory of Special Sp ecies Conservation and Regulatory Biology, College of L ife Sciences, Xinjiang Normal University, ?rümqi 830054, China)
In order to improve the purity of polysaccharides from the pomace of wild Crataegus songorica, NKA-9 and D101 were selected from 7 kinds of macroporous resins by static adsorption-desorption experiments, and the two selected resins were mixed at an appropriate ratio. On the basis of single factor expe riments, response surface methodology was used to optimize process parameters. The optimal mixing ratio of NKA-9 to D101-1 was 2:3 (by mass). The optimum experimental parameters for adsorption were as follows: sample loading fl ow rate, 3.75 mL/min; sample concentration, 1.32 g/L; and resin diameter-to-height ratio, 1:13, yielding a rate of adsorption of 60.75%. Under the optimal desorption conditions: 7 BV of 0.27 mol/L NaCl as eluent at a fl ow rate of 3.5 mL/min, a rate of desorption of 84.22% could be achieved. The content of polysaccharides was increased from 5.06% to 21.13%.
Crataegus songorica; polys accharides; response surface methodology; purifi cation
Q946.8
A
1002-6630（2015）12-0022-07
10.7506/spkx1002-6630-201512005
2014-11-22
國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31200300）；新疆維吾爾自治區(qū)教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（XJSD2013-0104）
張玉（1990—），女，碩士研究生，主要從事植物資源研究。E-mail：1107662720@qq.com
*通信作者：李進(jìn)（1969—），男，教授，博士，主要從事植物生理生態(tài)和資源利用研究。E-mail：xjcjlj4@xjnu.edu.cn
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