張宏梅 姚 鑫 崔佰吉 馬冬飛

(1 吉林醫(yī)藥學(xué)院,吉林,132013； 2 吉林敖東醫(yī)藥科技有限公司,敦化,133700)

返魂草有效成分的提取工藝研究

張宏梅1姚 鑫2崔佰吉1馬冬飛1

(1 吉林醫(yī)藥學(xué)院,吉林,132013； 2 吉林敖東醫(yī)藥科技有限公司,敦化,133700)

目的:優(yōu)化返魂草總黃酮的提取工藝。方法:以返魂草中總黃酮含量為考察指標(biāo),通過單因素實驗考察超聲時間、溫度、功率等對返魂草有效成分含量的影響,采用正交設(shè)計實驗法確定最佳提取工藝。結(jié)果:乙醇回流法提取最佳工藝為:提取時間150 min,溶劑70%乙醇,液料比22∶1。結(jié)論:乙醇回流法提取返魂草總黃酮操作方便,工藝穩(wěn)定,重現(xiàn)性好,適于工業(yè)化生產(chǎn)。

返魂草;黃酮;正交設(shè)計;提取工藝

返魂草為菊科千里光屬植物返魂草的干燥全草,具有利氣化痰、清熱解毒等功效[1-2]。上市的劑型返魂草顆粒和肺寧口服液等,在臨床上廣泛用于治療病毒性感冒、急性呼吸道感染、慢性支氣管炎等疾病[3-4]。目前返魂草活性成分的研究主要有綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、多糖及黃酮類等多種化合物,但對于黃酮類研究的報道較少[5-8]。黃酮類化合物顯示出多種生物活性,故我們采用單因素考察和正交實驗設(shè)計提取返魂草中的總黃酮,以含量為考察指標(biāo),優(yōu)選最佳提取工藝。

1 儀器與試藥

紫外分光光度計(UV1800日本.島津);電子天平(CAP225D Sartorius);冷凍干燥機(Scientz-12SN寧波生物科技股份有限公司);KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。蘆丁對照品(100080-201409)購于中國食品生物制品鑒定研究院。返魂草購于吉林市寶恩大藥房,經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院李景華副教授鑒定為菊科千里光屬植物返魂草(Senecio cannabifolius Less)。

2 方法與結(jié)果

2.1 返魂草總黃酮含量測定 精密稱取蘆丁對照品16.42 mg,置10 mL量瓶中,加甲醇溶解,并稀釋至刻度,得對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg置于10 mL容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,定容。分別精密吸取各對照品溶液1.0 mL置25 mL量瓶中,分別加入30%乙醇5 mL,混勻,加入1 mL濃度為5%的亞硝酸鈉溶液,混勻,放置室溫6 min,加入1 mL濃度為5%的硝酸鋁溶液0.3,混勻,放置室溫6 min,再分別加入濃度為4%的氫氧化鈉溶液10.0 mL,混勻,用30%乙醇稀釋至刻度,混勻,室溫放置15 min后于波長510 nm處測定吸光度。蘆丁對照品的濃度C為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程Y=0.4818 C+0.0562(R=0.999 3),表明蘆丁在0.16～0.64 mg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 供試品制備 返魂草藥材粗粉,按照各處方要求稱取適宜的藥材,置于三角瓶中,按照各處方項下的參數(shù)進行設(shè)定,進行提取。提取液濃縮、冷凍干燥、研成粉末,計算出膏率。精密稱取提取物粉末適量,置50 mL具塞三角瓶中,精密加入25 mL 30%乙醇溶液,溶解,稱定重量,超聲處理30 min,放至室溫,用30%乙醇補足減失重量、混勻,過濾即得。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法進行總黃酮的含量測定。

2.3 單因素考察實驗

2.3.1 溶劑濃度考察 按“2.2”項下的方法,稱取適量的藥材粗粉,提取時間120 min,考察溶劑濃度為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇時,返魂草總黃酮含量及出膏率的變化。含量及出膏率的變化見圖1。由實驗結(jié)果可以看出,隨著乙醇濃度的變化,總黃酮和出膏率也有明顯的變化,但是當(dāng)濃度達(dá)到約60%時,變化趨于穩(wěn)定狀態(tài),所以選擇乙醇濃度為60%、70%、80% 3個濃度進入正交實驗設(shè)計,進一步優(yōu)化實驗條件。

圖1 溶劑濃度考察結(jié)果圖

2.3.2 溶劑用量考察 按照“2.2”項下方法,稱取適量的藥材粗粉,設(shè)定提取時間120 min,乙醇濃度60%,溶劑用量分別為藥材量的14、16、18、20、22倍,考察返魂草總黃酮和出膏率的變化趨勢?？疾旖Y(jié)果見圖2。由實驗結(jié)果可以看出,隨著乙醇用量的增加,總黃酮和出膏率都明顯增加,且出膏率的增加趨勢更加顯著,總黃酮含量增加量不十分明顯,根據(jù)結(jié)果選擇14、18、22倍量進行正交實驗設(shè)計的實驗,以優(yōu)化更佳理想的溶劑用量。

2.3.3 提取時間考察 按照“2.2”項下方法,稱取適量的藥材粗粉,加入20倍量濃度為60%乙醇溶液,設(shè)定提取時間分別為45、60、90、120、150 min,考察返魂草總黃酮和出膏率的變化趨勢。考察結(jié)果見圖3。由實驗結(jié)果可知,隨著提取時間的增加,總黃酮和出膏率均明顯增加,當(dāng)提取時間增加到90 min時,其增加達(dá)到頂點,即再增加提取時間對于整個總黃酮和出膏率的影響不大,所以選擇90、120、150 min進行正交實驗。

圖2 溶劑用量考察結(jié)果圖

圖3 返魂草總黃酮和出膏率的變化趨勢

2.4 正交設(shè)計實驗 根據(jù)單因素實驗的考察結(jié)果,采用L9(34)正交設(shè)計實驗進行研究,因素水平設(shè)置見表1,按照“2.2”項下的方法分別進行各個實驗,分別考察各個條件下的總黃酮和出膏率,以二者的總和作為提取效果的考察指標(biāo),考察結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素水平表

表2 正交設(shè)計表及結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果表

由實驗結(jié)果可知,對于乙醇回流法提取返魂草總黃酮的的過程,乙醇濃度和溶劑的用量對整個結(jié)果的影響較大,3個因素對于結(jié)果的影響大小程度分別為:乙醇濃度>溶劑用量>提取時間,且乙醇濃度和溶劑用量均具有顯著性影響(a=0.1),從直觀分析結(jié)果我們可以看出最佳的實驗方案為A2B3C3,即:乙醇濃度為70%,溶劑用量為22倍量,提取時間為150 min。

2.5 驗證實驗 按“2.4”項下返魂草總黃酮最佳提取工藝參數(shù),按照“2.2”項下的過程進行3個批次的返魂草總黃酮的提取。返魂草總黃酮含量結(jié)果見表4。結(jié)果表明,本工藝穩(wěn)定,可操作性強,適合返魂草總黃酮的提取。

表4 驗證實驗結(jié)果表

3 討論

本研究采用蘆丁顯色的方法進行總黃酮的含量測定,方法比較成熟,在經(jīng)過預(yù)實驗的過程中,我們進行了該方法的穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性、回收率等一系列的方法學(xué)研究,研究表明各項指標(biāo)均能滿足返魂草中總黃酮的含量測定的要求。

返魂草的成方制劑為“返魂草顆?！?即“肺寧顆粒”主要用于肺部疾病的預(yù)防和治療,具有悠久的用藥歷史,但返魂草的應(yīng)用主要集中在返魂草水溶性酚酸類成分,據(jù)研究報道,返魂草的黃酮類成分也具有廣泛的抗炎、抗氧化的作用,在肺部疾病的治療過程中也起到一定的積極作用。本研究采用單因素結(jié)合正交設(shè)計的方法進行返魂草有效成分的提取研究,建立了簡便、易行的工藝設(shè)計,為返魂草藥材的合理化應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

[1]孫佳丹,王曉波,姜爽,等.返魂草素Ⅱ?qū)θ惗∠┲麓笫笪胄约毙苑螕p傷的預(yù)防作用[J].國際藥學(xué)研究雜志,2014，41(4):444-448.

[2]馬鴻雁,楊莉,王長虹,等.HPLC法同時測定返魂草顆粒中6種活性成分[J].中成藥,2012,34(8):1496-1500.

[3]趙春芳,李慶杰,王蓮萍,等.返魂草的高效液相色譜法指紋圖譜研究及成分分析[J].分析化學(xué),2013,41(1):133-136.

[4]李麗靜,王繼彥,王巖,等.返魂草提取物及其有效成分抗病毒作用的研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2005,11(8):585-587.

[5]馬鴻雁,楊莉,王長虹,等.返魂草藥材的HPLC指紋圖譜研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2012,18(13):101-104.

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(2015-07-08收稿 責(zé)任編輯：王明)

Research on the Extracting Process of the Active Ingredient from Senecio cannabifolius Less

Zhang Hongmei1, Yao Xin2, Cui Baiji1, Ma Dongfei1

(1JilinMedicalUniversity,Jilin132013,China; 2JilinAodongMedicineScienceandTechnologyCoLtd,Dunhua133700,China)

Objective: To optimize extracting process of flavonoids from Senecio cannabifolius Less. Methods: The ultrasonic time, the optimum extraction conditions and the material ratio were investigated by single element experiment; the optimum extraction conditions were investigated by orthogonal design and with flavonoids from Senecio cannabifolius Less as the content index by Uv results. Results: The best optimum extracting condition was under 70% ethanol, material ratio 22:1, and extracting time lasting for 150 mins. Conclusion: The method is simple, convenient and can be controlled easily, and suitable for the determination of Senecio cannabifolius Less.

Senecio cannabifolius Less; Flavonoids; Orthogonal design; Extracting process

吉林省教育廳,吉教科合字[2014]第549號

張宏梅(1982—),女,講師,從事中藥新劑型與新技術(shù),E-mail:33134016@qq.com

R284.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.09.032