郁 博，張 斌，蘇 磊，潘 敏，陳宏泉△

(1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，山東青島266003；2.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院皮膚科，重慶 400037)

皮膚黑色素瘤細(xì)胞中TGF-βRⅠ型和Ⅱ型受體表達(dá)的研究

郁 博1，張 斌2，蘇 磊1，潘 敏1，陳宏泉1△

(1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，山東青島266003；2.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院皮膚科，重慶 400037)

目的 探討轉(zhuǎn)化生長因子β受體(TGF-βR)Ⅰ、Ⅱ型在皮膚黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況。方法應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-實(shí)時熒光定量PCR(RT-PCR)和蛋白免疫印跡(Western blot)方法，對TGF-βRⅠ、Ⅱ型的mRNA及其蛋白在人皮膚黑色素瘤A375細(xì)胞和人正常黑素細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果A375細(xì)胞中TGF-βRⅠ、Ⅱ型的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著低于正常人黑素細(xì)胞。結(jié)論在黑色素瘤細(xì)胞的TGF-β/Smad信號通路中出現(xiàn)TGF-βR表達(dá)的下調(diào)，可能是皮膚黑色素瘤發(fā)病機(jī)制之一。

黑色素瘤；受體，轉(zhuǎn)化生長因子β；黑素細(xì)胞

在皮膚腫瘤的致死率排名中，皮膚黑色素瘤一直高居首位。過去的50年間，其發(fā)病率增加超出6倍，黑色素瘤一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，則預(yù)后極差，總體5年生存率小于5%，中位生存期為6～10個月。其病理變化表現(xiàn)為黑素細(xì)胞失控性增殖。轉(zhuǎn)化生長因子β (transforming growth factor-β，TGF-β)是一種具有多項(xiàng)生物學(xué)作用的細(xì)胞因子。它廣泛存在于體內(nèi)，對大多數(shù)上皮細(xì)胞具有生長抑制作用。TGF-β通過其受體(TGF-βR)來發(fā)揮重要生物學(xué)作用。有研究顯示，在眼葡萄膜黑色素瘤組織中存在TGF-βR的表達(dá)異常[1-2]，提示TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的改變與黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展有較為密切的關(guān)系。在人黑色素瘤組織中是否存在TGF-βR的表達(dá)異常？本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞為研究對象，采用反轉(zhuǎn)錄-實(shí)時熒光定量PCR(RT-PCR)和蛋白免疫印跡(Western blot)方法對其TGF-βRⅠ、Ⅱ的mRNA及其蛋白在人皮膚黑色素瘤A375細(xì)胞和人正常黑素細(xì)胞中的表達(dá)分別進(jìn)行檢測，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 (1)細(xì)胞：人黑色素瘤細(xì)胞A375細(xì)胞系(以下簡稱A375細(xì)胞)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。(2)主要試劑及儀器：DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Gibco公司，PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM購自日本TaKaRa Bio株式會社，抗TGF-βRⅠ、Ⅱ多克隆抗體購自Santa Cruz公司，Chemi ImagerTM5500型凝膠成像分析儀購自美國Alpha Innotech公司，7500 Real Time 熒光定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀購自美國Applied Biosystems公司，半干電轉(zhuǎn)儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人皮膚黑素細(xì)胞提取參照文獻(xiàn)[3]取健康成年人包皮(取自包皮環(huán)切術(shù)患者)進(jìn)行消化、分離提取。黑素細(xì)胞、A375細(xì)胞培養(yǎng)條件為：5%CO2孵箱 37 ℃飽和濕度環(huán)境下孵育，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，每2天更換1次培養(yǎng)液。

1.2.2RT-PCR檢測 細(xì)胞總RNA提取參照Trizol(Invitogen公司)說明書操作步驟進(jìn)行，并對所抽提的細(xì)胞總RNA質(zhì)量進(jìn)行驗(yàn)證。引物設(shè)計根據(jù)熒光定量PCR引物設(shè)計原則[4]。TGF-βRⅠ引物：上游為5′-GCA GTA AGA CAT GAT TCA GCC ACA G-3′，下游為5′-CAA TGG AAC ATC GTC GAG CAA-3′，擴(kuò)增片段為190 bp；TGF-βRⅡ引物，上游為5′-TCG TCC TGT GGA CGC GTA TC-3′，下游為5′-GAA ACT TGA CTG CAC CGT TGT TG-3′，擴(kuò)增片段為102 bp；內(nèi)參校準(zhǔn)基因GAPDH引物：上游為5′-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3′，下游為5′-ATG GTG GTG AAG ACG CCA GT-3′，擴(kuò)增片段：142 bp。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA：根據(jù)RT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，溫度設(shè)定為42 ℃ 15 min，然后95 ℃ 2 min使反轉(zhuǎn)錄酶失活，所得cDNA產(chǎn)物保存?zhèn)溆糜?20 ℃冰箱中。RT-PCR反應(yīng)：50 μL反應(yīng)體系內(nèi)含模板cDNA 200 ng，擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性10 s，95 ℃變性 5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環(huán)。分別設(shè)置融解曲線檢測自65～95 ℃的融解溫度，以驗(yàn)證產(chǎn)物的特異性。

1.2.3Western blot檢測 參照文獻(xiàn)[5]常規(guī)進(jìn)行。分別取A375細(xì)胞(A375組)和正常黑素細(xì)胞(黑素細(xì)胞組)的總蛋白40 μg，上樣至10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳后，電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，再用5%的脫脂奶粉室溫下封閉60 min，TBS洗膜，分別加入用0.5%的BSA稀釋的一抗(工作濃度為1∶200)，4 ℃孵育過夜后，TBS洗膜，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育1 h，TBST(TBS+0.1%Tween20) 洗膜。此后按DAB顯色試劑盒說明書操作顯色。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞中TGF-βRⅠ、Ⅱ型mRNA的表達(dá)檢測 與A375組(設(shè)為100%)相比，黑素細(xì)胞組TGF-βRⅠ、Ⅱ型mRNA的2-△△CT值分別為2.126±0.130、4.282±0.226。黑素細(xì)胞組的TGF-βRⅠ、Ⅱ型mRNA表達(dá)量分別是A375細(xì)胞的(2.126±0.130)、(4.282±0.226)倍，A375組的TGF-βRⅠ、Ⅱ型mRNA表達(dá)水平顯著低于黑素細(xì)胞組(P<0.05)，見圖1、2。

a：P<0.05，與黑素細(xì)胞組比較。

圖1 兩組細(xì)胞TGF-βRⅠ型mRNA相對表達(dá)量比較

2.2細(xì)胞中TGF-βRⅠ、Ⅱ型蛋白質(zhì)的表達(dá)檢測 黑素細(xì)胞組、A375組TGF-βRⅠ型蛋白質(zhì)相對表達(dá)量分別為0.669±0.078、0.413±0.067(t=2.654，P<0.05)。黑素細(xì)胞組、A375組TGF-βRⅡ型蛋白質(zhì)相對表達(dá)量分別為0.831±0.167、0.212±0.056(t=5.668，P<0.01)。A375組中TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ蛋白質(zhì)表達(dá)量明顯低于黑素細(xì)胞組，見圖3。

a：P<0.05，與黑素細(xì)胞組比較。

圖2 兩組細(xì)胞TGF-β RⅡ型mRNA相對表達(dá)量比較

圖3 兩組細(xì)胞TGF-βRⅠ、Ⅱ型蛋白質(zhì)表達(dá)圖

3 討 論

TGF-β是一種多功能蛋白，可以影響多種細(xì)胞的生長，分化、細(xì)胞凋亡及免疫調(diào)節(jié)等功能。TGF-β包括3個亞型，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3[6-7]。TGF-β可以與細(xì)胞表面的TGF-βR結(jié)合而激活其受體，從而啟動了信號傳導(dǎo)級聯(lián)而導(dǎo)致多種生物化學(xué)變化。TGF-β具有Ⅰ型和Ⅱ型兩種跨膜信號傳遞受體，其受體內(nèi)部含有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。TGF-βR在機(jī)體組織、細(xì)胞中廣泛分布。皮膚作為人體組織的最大器官，是TGF-β發(fā)揮作用的重要靶器官。

對于多種腫瘤的形成與發(fā)展，TGF-β可表現(xiàn)出截然相反的兩種作用，在腫瘤發(fā)生的早期階段表現(xiàn)抑制作用，而在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及擴(kuò)散的晚期階段表現(xiàn)為促進(jìn)及加劇的作用[8-9]。通過細(xì)胞處于G1期以其保持在非增殖狀態(tài)，從而對腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抑制作用。這種抑制功能是通過TGF-β/Smad信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)TGF-βR和多種Smad蛋白來發(fā)揮的[10-11]。此外，激活某些重要的細(xì)胞周期關(guān)鍵基因會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的生長抑制，也是因?yàn)檫@些關(guān)鍵基因是TGF-β/Smad信號通路的下游靶點(diǎn)[11-13]。另外，在正常上皮細(xì)胞中幾種促進(jìn)細(xì)胞周期停滯的基因的表達(dá)，也能被TGF-β所調(diào)控。腫瘤細(xì)胞趨于喪失TGF-β對腫瘤抑制作用的反應(yīng)能力，從而加速了腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展。通過加速腫瘤新生血管的形成、免疫逃逸/抑制、增進(jìn)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用來促進(jìn)腫瘤的侵襲、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，是TGF-β在促進(jìn)腫瘤發(fā)生機(jī)制方面主要的作用[14]。

目前研究發(fā)現(xiàn)在惡性黑色素瘤組織中TGF-β/Smad信號通路中的多種重要成分-TGF-β、TGF-βR及部分Smad蛋白出現(xiàn)表達(dá)異常[1-2]，提示在黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的多個環(huán)節(jié)的改變可能是其發(fā)病機(jī)制的重要原因之一。本研究通過比較體外培養(yǎng)的人黑色素瘤A375細(xì)胞及人正常黑素細(xì)胞中TGF-βRⅠ、Ⅱ型基因及蛋白質(zhì)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)A375細(xì)胞的TGF-βRⅠ、Ⅱ型的表達(dá)均出現(xiàn)明顯降低。由于TGF-β信號是通過其受體-TGF-βR來介導(dǎo)的，TGF-βR的存在是TGF-β/Smads信號下傳的必要條件，如果TGF-βR表達(dá)水平降低或喪失，則TGF-β信號傳導(dǎo)受阻，無法發(fā)揮TGF-β維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性。在癌基因啟動和抑癌基因功能喪失等多種相關(guān)因素的共同作用下，黑色素瘤細(xì)胞自身出現(xiàn)TGF-β抑制作用缺失，可導(dǎo)致黑色素瘤細(xì)胞的特征性病理改變，出現(xiàn)異常黑素細(xì)胞的失控性異常增殖及浸潤、擴(kuò)散。因此，本實(shí)驗(yàn)為黑色素瘤細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖的機(jī)制研究提供了一定的依據(jù)。

通過本實(shí)驗(yàn)研究，說明TGF-βR表達(dá)水平的降低可能既存在于機(jī)體的黑色素瘤組織中，也出現(xiàn)在體外培養(yǎng)的人黑色素瘤細(xì)胞株中。推測TGF-βR的異常表達(dá)可能參與了黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，也或許為黑色素瘤細(xì)胞本身內(nèi)在所固有的表現(xiàn)。因此在體外培養(yǎng)條件下，人黑色素瘤A375細(xì)胞仍然持續(xù)表達(dá)此信號通路異常的特質(zhì)。但機(jī)體黑色素瘤中TGF-βR表達(dá)降低的原因并不清楚，是否可以推測：黑色素瘤組織中存在多種促使或抑制黑素細(xì)胞生長、增殖、凋亡及分化的基因發(fā)生改變，而TGF-βR表達(dá)的降低可能是其中原因之一。在多種促癌基因和抑癌基因異常調(diào)節(jié)的協(xié)同作用下，異常黑素細(xì)胞出現(xiàn)失控性異常增殖。研究黑色素瘤細(xì)胞中的TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)，是為進(jìn)一步深入系統(tǒng)了解黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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Research of expression of TGF-β receptorⅠ/TGF-β receptor Ⅱin skin malignant melanoma cells*

YuBo1,ZhangBin2,SuLei1,PanMin1,ChenHongquan1△

(1.DepartmentofDermatology,AffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao,Shandong266003,China;2.DepartmentofDermatology,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China)

Objective To investigate the expression and significance of TGF-β receptor Ⅰ/TGF-β receptor Ⅱ(TGF-β Ⅰ/TGF-β Ⅱ) in human skin malignant melanoma A375 cell line.Methods The reverse transcription-real time polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot were utilized to assess the expressions of TGF-βR Ⅰ/TGF--βR Ⅱ in A375 cell line and human normal melanocytes.Results The expressions of TGF-βR Ⅰ/TGF--βR Ⅱ mRNA and protein of A375 cells line were significantly lower than those of human normal melanocytes.Conclusion The down-regulated expression of TGF-βR in the TGF-β/Smad signal pathway of human skin malignant melanoma may be one of the pathogenesis of skin malignant melanoma．

melanoma;receptors,transforming growth factor beta;melanocytes

·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.11.006

山東省科技發(fā)展計劃資助項(xiàng)目(2011YD18012)；山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2010HM022)；山東省中醫(yī)藥科技資助項(xiàng)目(2011-199)。

郁博(1976-)，副主任醫(yī)師，博士后，主要從事黑色素瘤發(fā)病機(jī)制與TGF-β/Smad信號通路的研究工作。

△通訊作者，Tel：(0532)82911215；E-mail:chhq6198@163.com。

R332 R322.61

A

1671-8348(2015)11-1460-03

2014-07-11

2015-01-24)