彭公永，胡錦興，鄒義敏，彭 芳，周玉民，胡國平，趙祝香

(廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院/廣州呼吸疾病研究所/呼吸疾病國家重點實驗室/呼吸疾病國家臨床醫(yī)學研究中心，廣東廣州 510120)

SKF96365和氯化鎳對環(huán)匹阿尼酸誘導的大鼠PASMC[Ca2+]i升高的影響

彭公永，胡錦興，鄒義敏，彭 芳，周玉民，胡國平，趙祝香

(廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院/廣州呼吸疾病研究所/呼吸疾病國家重點實驗室/呼吸疾病國家臨床醫(yī)學研究中心，廣東廣州 510120)

目的 研究SKF96365和氯化鎳(NiCl2)對環(huán)匹阿尼酸(CPA)誘導的大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞(PASMC)內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca2+]i)變化的影響。方法培養(yǎng)大鼠PASMC，運用熒光顯微鏡和InCyte細胞內(nèi)鈣濃度檢測系統(tǒng)觀測CPA、SKF96365和NiCl2對PASMC [Ca2+]i的影響。結(jié)果含5 μmol/L硝苯地平的無鈣Krebs溶液孵育PASMC，10 μmol/L CPA使PASMC[Ca2+]i短暫小幅升高，恢復細胞外Ca2+至2.5 mmol/L后，10 μmol/L CPA使PASMC [Ca2+]i迅速顯著升高；50 μmol/L SKF96365和500 μmol/L NiCl2均能明顯抑制10 μmol/L CPA引起的PASMC [Ca2+]i升高，但對高鉀(60 mmol/L KCl)溶液引起的PASMC [Ca2+]i升高無影響。結(jié)論CPA可致大鼠PASMC [Ca2+]i升高，且能被SKF96365和NiCl2阻斷，提示CPA可能誘發(fā)細胞外Ca2+經(jīng)鈣池操縱性鈣通道(SOCC)內(nèi)流，SKF96365和NiCl2能選擇性抑制SOCC活性使經(jīng)SOCC的Ca2+內(nèi)流減少。

環(huán)匹阿尼酸；游離鈣離子濃度；肺動脈平滑肌細胞；硝苯地平；鈣池操縱性鈣通道；大鼠

中國40歲以上人群慢性阻塞性肺疾病(COPD)患病率高達8.2%[1-2]，多數(shù)人經(jīng)缺氧性肺動脈高壓發(fā)展為慢性肺源性心臟病。急性缺氧性肺血管收縮反應和慢性缺氧性肺血管結(jié)構(gòu)重塑是缺氧性肺動脈高壓發(fā)生的兩大主要環(huán)節(jié)[3-6]，而缺氧對遠端肺動脈收縮和重塑的影響比近端肺動脈更明顯[7-8]，表明遠端肺動脈是肺動脈高壓發(fā)病的主要部位。Ca2+在肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMC)的缺氧性收縮反應和增殖過程中發(fā)揮關鍵作用[9-11]。環(huán)匹阿尼酸(cyclopiazonic acid，CPA)是平滑肌肌漿網(wǎng)上的一種特異性Ca2+ATP酶阻斷劑，能夠激活平滑肌細胞膜鈣池操縱性鈣通道(store-operated Ca2+channels，SOCC)，參與調(diào)節(jié)平滑肌細胞內(nèi)游離Ca2+濃度(intracellular Ca2+concentration，[Ca2+]i)。本研究通過原代培養(yǎng)大鼠遠端PASMC，選用SOCC 拮抗劑SKF96365和氯化鎳(NiCl2)，觀察其對CPA誘導的PASMC [Ca2+]i改變的影響，為進一步研究缺氧引起的肺動脈收縮和血管重塑機制打下基礎。

1 材料與方法

1.1材料 主要試劑：Ⅰ型膠原酶、NaCl、KCl、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、NaHCO3、CPA、SKF96365、NiCl2、葡萄糖、硝苯地平(美國Sigma)；Fura-2 AM(美國Invitrogen)；PBS、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco)。儀器：倒置相差顯微鏡、體式顯微鏡、熒光顯微鏡(日本Nikon)；InCyte細胞內(nèi)鈣濃度檢測系統(tǒng)(美國Intracellular Imaging)；雙通道溫度控制系統(tǒng)(美國Warner Instrument)；顯微鑷、顯微剪(上海金鐘)。

1.2方法

1.2.1大鼠遠端PASMC的原代培養(yǎng) 參照文獻[12-14]的方法，選取250～300 g雄性SD大鼠8只，2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，開胸取心肺，體式顯微鏡下用顯微鑷、剪分離肺內(nèi)肺動脈。剝除血管外膜組織，縱向剪開血管，棉簽刮除內(nèi)皮后置入3 mLⅠ型膠原酶消化液(1 800 U/mL)中，37 ℃消化20 min，棄上層液，加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基15 mL，吹吸20次制成細胞懸液，以5×104/mL接種于6孔培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3天常規(guī)換液。

1.2.2[Ca2+]i測定 參照文獻[12,15-16]的方法，選取50%～60%融合細胞于37 ℃避光負載5 μmol/L的Fura-2 AM 1 h，固定細胞蓋玻片于熒光顯微鏡觀測盒內(nèi)，按0.50～1.00 mL/min流速用Krebs液(118.00 mmol/L NaCl、4.70 mmol/L KCl、1.18 mmol/L KH2PO4、0.57 mmol/L MgSO4、2.50 mmol/L CaCl2、25.00 mmol/L NaHCO3和10.00 mmol/L葡萄糖)灌流孵育細胞15 min，以16%O2、5%CO2混合氮氣持續(xù)平衡灌流液，用雙通道溫度控制系統(tǒng)控制觀測盒溫度37.00～37.20 ℃，打開熒光顯微鏡和InCyte細胞內(nèi)鈣離子濃度檢測系統(tǒng)，實時記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3CPA對PASMC[Ca2+]i影響 分對照組和CPA組。對照組先用Krebs液孵育5 min，再用5 μmol/L硝苯地平無鈣Krebs液(118.00 mmol/L NaCl、4.70 mmol/L KCl、1.18 mmol/L KH2PO4、0.57 mmol/L MgSO4、25.00 mmol/L NaHCO3和10.00 mmol/L葡萄糖)孵育10 min，用5.00 μmol/L硝苯地平Krebs液孵育15 min后，最后用Krebs液孵育10 min。CPA組先用Krebs液孵育5 min，再用10.00 μmol/L CPA、5.00 μmol/L硝苯地平無鈣Krebs液孵育10 min，用10.00 μmol/L CPA、5.00 μmol/L硝苯地平Krebs液孵育15 min，最后用Krebs液孵育10 min。

1.2.4SKF96365、NiCl2對CPA誘導的PASMC [Ca2+]i升高的影響 分對照組、SKF96365組和NiCl2組。Krebs液孵育各組細胞5 min，對照組以10.00 μmol/L CPA、5.00 μmol/L硝苯地平無鈣Krebs液孵育10 min，再用10.00 μmol/L CPA、5.00 μmol/L硝苯地平Krebs液孵育15 min；而SKF96365組和NiCl2組在相同時相的灌流液中分別加入50.00 μmol/L SKF96365和500.00 μmol/L NiCl2，其余處理與對照組相同，最后，各組以Krebs溶液孵育10 min。

1.2.5SKF96365、NiCl2對高鉀引起的PASMC[Ca2+]i升高影響 分KCl組、SKF96365組和NiCl2組。Krebs液孵育各組細胞5 min，KCl組用高鉀Krebs液(60.00 mmol/L KCl、60.00 mmol/L NaCl、1.18 mmol/L KH2PO4、0.57 mmol/L MgSO4、25.00 mmol/L NaHCO3、2.50 mmol/L CaCl2和10.00 mmol/L葡萄糖)孵育10 min，SKF96365組用50.00 μmol/L SKF96365高鉀Krebs液孵育10 min，NiCl2組用500.00 μmol/L NiCl2高鉀Krebs液孵育10 min，3組細胞分別用Krebs液孵育10 min。

2 結(jié) 果

2.1CPA對大鼠遠端PASMC[Ca2+]i的影響 對照組[Ca2+]i隨時間變化維持基線(圖1A)。CPA組換10.00 μmol/L CPA、5.00 μmol/L硝苯地平無鈣Krebs液孵育后，[Ca2+]i呈小幅升高，持續(xù)5～10 min達基線水平(圖1B)；再換10.00 μmol/L CPA、5.00 μmol/L硝苯地平Krebs液恢復細胞外Ca2+到2.50 mmol/L后，[Ca2+]i迅速升高(圖1B)。CPA組△[Ca2+]i峰值達(382.83±83.17)nmol/L，對照組僅(25.17±6.75)nmol/L,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(n=8，P<0.05)(圖1C)；再以Krebs液孵育，[Ca2+]i恢復基線，見圖1B。

A、B:對照組、CPA組時間-[Ca2+]i曲線；C:兩組△[Ca2+]i峰值；a：P<0.05，與對照組比較。

圖1 CPA對大鼠遠端PASMC[Ca2+]i的影響

2.2SKF96365、NiCl2對CPA誘導的PASMC [Ca2+]i升高的影響 以10.00 μmol/L CPA、5.00 μmol/L硝苯地平Krbs液孵育恢復細胞外Ca2+到2.50 mmol/L，對照組[Ca2+]i迅速顯著升高(圖2A)，同時期SKF96365組和NiCl2組[Ca2+]i均僅小幅升高(圖2B、C)，△[Ca2+]i峰值分別僅為(94.17±44.47)、(96.67± 44.92)nmol/L(n=6，P<0.05)，而對照組△[Ca2+]i峰值高達(386.81±66.72)nmol/L，見圖2D。

2.3SKF96365、NiCl2對高鉀引起的大鼠遠端PASMC的[Ca2+]i升高的影響 高鉀Krebs液孵育KCl組后，[Ca2+]i迅速增高(圖3A)，換Krebs液孵育后[Ca2+]i恢復基線；同時期SKF96365組和NiCl2組[Ca2+]i也均迅速增高(圖3B、C)，△[Ca2+]i峰值分別達(136.33±48.16)、(136.83±62.81)nmol/L(n=6，P>0.05)，與KCl組(134.50±70.41)nmol/L比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3D。

A、B、C：對照組、SKF96365組、NiCl2組時間-[Ca2+]i曲線；D：3組△[Ca2+]i峰值；a：P<0.05，與對照組比較。

圖2 SKF96365、NiCl2對CPA誘導的PASMC[Ca2+]i升高的影響

A、B、C：KCl組、SKF96365組、NiCl2組時間-[Ca2+]i曲線；D:3組△[Ca2+]i峰值。

圖3 SKF96365、NiCl2對高鉀引起的大鼠遠端PASMC[Ca2+]i升高的影響

3 討 論

急性缺氧性肺血管收縮反應和慢性缺氧性肺血管結(jié)構(gòu)重塑是缺氧性肺動脈高壓發(fā)生的主要機制，肺動脈平滑肌[Ca2+]i升高在肺血管收縮和結(jié)構(gòu)重塑中發(fā)揮關鍵作用。前期研究證實，原代培養(yǎng)的大鼠遠端PASMC具有電壓依賴性鈣通道(the voltage-dependent Ca2+channels,VDCC)，5.00 μmol/L硝苯地平能完全阻斷PASMC的VDCC[12]。

CPA是平滑肌肌漿網(wǎng)一種特異性的Ca2+ATP酶阻斷劑，能不可逆的抑制肌漿網(wǎng)Ca2+泵。當用5.00 μmol/L硝苯地平孵育大鼠遠端PASMC而阻斷VDCC后，再用無鈣Krebs液孵育細胞，CPA能使PASMC [Ca2+]i小幅短暫升高，提示CPA抑制肌漿網(wǎng)Ca2+泵后，導致肌漿網(wǎng)中Ca2+釋放，從而使PASMC [Ca2+]i升高；在VDCC被5.00 μmol/L硝苯地平完全阻斷條件下，再恢復細胞外Ca2+到2.50 mmol/L，CPA導致[Ca2+]i迅速顯著升高，而去除CPA則導致[Ca2+]i恢復基線，提示大鼠遠端PASMC肌漿網(wǎng)Ca2+泵被CPA抑制后，Ca2+從肌漿網(wǎng)釋放，可能激活SOCC，SOCC激活后，細胞外Ca2+通過SOCC內(nèi)流增加，引起[Ca2+]i升高，這和國外學者報道結(jié)果一致[17]。

文獻報道SOCC既能被有機拮抗劑如SKF96365抑制，也能被無機拮抗劑如La3+、Cd3+、Ni2+抑制[18-19]。本實驗中，大鼠遠端PASMC用5.00 μmol/L硝苯地平阻斷VDCC并分別用50.00 μmol/L SKF-96365或500.00 μmol/L NiCl2干預后，恢復細胞外Ca2+到2.50 mmol/L時CPA引起的[Ca2+]i升高幅度均顯著下降，表明SKF96365和Ni2+均能明顯抑制CPA誘導的大鼠遠端PASMC的[Ca2+]i升高，進一步提示CPA激活SOCC后，導致細胞外Ca2+內(nèi)流。進一步的高鉀實驗觀察到SKF96365和Ni2+對高鉀Krebs溶液引起的大鼠遠端PASMC的[Ca2+]i升高并無影響，表明SKF96365和Ni2+對大鼠遠端PASMC的VDCC均無影響，能選擇性作用于SOCC。

綜上所述，CPA可以導致大鼠遠端PASMC的[Ca2+]i升高，其機制可能與肌漿網(wǎng)Ca2+泵被CPA阻斷后釋放肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+，并激活SOCC誘發(fā)細胞外Ca2+經(jīng)SOCC內(nèi)流有關；SKF96365和NiCl2能夠選擇性作用于SOCC，并明顯抑制SOCC活性，導致SOCC介導的Ca2+內(nèi)流減弱，提示大鼠遠端PASMC細胞外Ca2+通過SOCC內(nèi)流在缺氧引起的肺動脈收縮反應和結(jié)構(gòu)重塑過程中可能發(fā)揮作用。

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Effect of SKF96365 and NiCl2on cyclopiazonic acid induced intracellular calcium cation concentration increase in rat distal pulmonary arterial smooth muscle cells*

PengGongyong,HuJinxing,ZouYimin,PengFang,ZhouYumin,HuGuoping,ZhaoZhuxiang

(NationalClinicalResearchCenterforRespiratoryDisease,NationalKeyLaboratoryofRespiratoryDisease,GuangzhouInstituteofRespiratoryDiseases,FirstAffiliatedHospital,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510120,China)

Objective To study the effect of SKF96365 and NiCl2on cyclopiazonic acid (CPA) induced intracellular calcium cation concentration ([Ca2+]i) change in rat distal pulmonary arterial smooth muscle cells (PASMC).Methods The rat distal PASMC were isolated and cultured.The effects of CPA,SKF96365 and NiCl2on [Ca2+]iin PASMC were tested by fluorescence microscope and InCyte [Ca2+]imeasurement system.Results PASMC were incubated with Ca2+-free Krebs solution containing 5 μmol/L nifedipine,10 μmol/L CPA caused a small transient increase in [Ca2+]i;after restoration of extracellular Ca2+to 2.5 mmol/L,10 μmol/L CPA caused marked increases in [Ca2+]iin PASMC incubated with Krebs solution containing 5 μmol/L nifedipine.Both 50 μmol/L SKF96365 and 500 μmol/L NiCl2distinctly attenuated the increases in [Ca2+]icaused by 10 μmol/L CPA in PASMC.However,neither 50 μmol/L SKF96365 nor 500 μmol/L NiCl2affected the increases in [Ca2+]icaused by 60 mmol/L KCl in PASMC.Conclusion CPA induced increases in [Ca2+]imay related to Ca2+release from sarcoplasmic reticulum and the influx of Ca2+through store-operated Ca2+channels (SOCC) in rat distal PASMC.Both SKF96365 and NiCl2could selectively block SOCC and attenuated the influx of Ca2+through SOCC in PASMC.

cyclopiazonic acid;intracellular calcium cation concentration;pulmonary arterial smooth muscle cells;nifedipine;store-operated Ca2+channels;rat

著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.11.002

國家自然科學基金資助項目(81000020)；十二五國家科技支撐計劃課題資助項目(2013BAI09B09)；廣東省自然科學基金資助項目(2014A030313486)；廣州市科技計劃資助項目(1563000587)；羊城學者科研計劃學術(shù)骨干資助項目(10A025G)；呼吸疾病國家重點實驗室青年科學基金支持資助項目(11)。

彭公永(1976-)，副主任醫(yī)師，碩士生導師，醫(yī)學博士，從事肺血管疾病基礎與臨床研究。

R543.2

A

1671-8348(2015)11-1445-04

2014-07-08

2015-01-16)