霍衛(wèi)松，張 磊，高宇哲，孟凡達，高云華

（1．中國科學院 理化技術研究所 光化學轉換和功能材料重點實驗室，北京100190；2．中國科學院大學，北京100049）

1971年，瑞典學者Engvail和Perlmann［1］，荷蘭學者 Van Weeman和Schuurs［2］分別報道了將免疫技術發(fā)展為檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法 （enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）。它是將抗體吸附固定在聚苯乙烯（Polystyrene，PS）表面，通過抗原－抗體間特異性的免疫反應而對分析物進行定性或定量分析。ELISA以其靈敏度高（可達ng甚至pg水平）、特異性好等優(yōu)點，在生命科學、環(huán)境分析等領域得到廣泛應用。然而該方法存在檢測時間較長、操作繁瑣的缺點，其中抗體包被步驟長達10h以上，檢測時間也需2～4h［3］，且該方法僅能對單一分析物進行分析，上述問題限制了其在快速診斷領域的應用。

心力衰竭（Heart Failure）簡稱心衰，是一種嚴重威脅人類健康的全球性疾病，它具有較高的發(fā)病率和死亡率，據(jù)文獻報道，在2010年世界范圍內就有2300萬人受到心衰的影響［4］。心衰的傳統(tǒng)診斷手段存在一些不可靠性，容易讓醫(yī)生產生誤診或漏診，為了提高臨床診斷的準確性，采用測定心衰標志物含量水平來診斷評定心衰等級的方法被廣泛應用。與心衰相關的心臟標志物有很多種，但是這些標志物的特異性、敏感性和臨床可行性差異很大。目前，N端腦鈉肽前體（NT－proBNP）是公認最為有效的心衰標志物［5］；心肌肌鈣蛋白I（cTnI）雖然不是特異性的心衰標志物，但是近年來的研究顯示［6，7］，其可以作為心衰診斷的輔助標志物。NT－proBNP和cTnI的聯(lián)合檢測，可以有效提高檢測準確性。

本文參考ELISA方法，建立了心衰標志物在硅片表面的可視化免疫檢測方法。與ELISA相比，本方法從抗體包被到檢測結束不超過1h，并且操作簡單，可以在同一硅片上對兩種標志物NT－proBNP和cTnI同時檢測，大大縮短了心衰疾病的診斷時間，提高了診斷的準確性。本工作對心衰發(fā)病的早期快速診斷、治療、改善其轉歸有重要的意義，該方法的靈敏度和準確度都可以滿足臨床檢測需要。

1 實驗部分

1．1 儀器、試劑和分析軟件

儀器：超 純 水 儀 器 （EASY pure LF，美 國Barnstead公司），光學顯微鏡（Olympus BX－51，日本），勻膠機（KW－4A，中國科學院微電子所），分析天平 （MettlerToleDo，AB 104－N，美 國），Cobas e411免疫分析儀（Roche公司），Access2免疫分析儀（Beckman Coulter公司）。

試劑：NT－proBNP 抗 原 （NT－proBNP，芬 蘭Hytest公司），cTnI抗原（Cardiac troponin I，美國NIST），NT－proBNP抗體（NT－proBNP－A5（固定抗體），NT－proBNP－A1（標記抗體）芬蘭 Hytest公司），cTnI抗體（cTnI－B3（固定抗體），cTnI－B1（標記你抗體）美國BiosPacific公司），人血清樣本（北大深圳醫(yī)院和深圳人民醫(yī)院），鏈霉親和素磁顆粒（Streptavidin－beads，粒徑500±10nm，東莞博識科技有限公司），硅片（6．6mm×10．7mm×0．75mm，二氧化硅膜厚200nm，北京大學微電子系），其他化學試劑都為分析純。

軟件：顯微鏡拍照軟件DP controller（Olympus公司），Image Pro Plus 6．1（MediaCybernetics公司），Origin 8．5（OriginLab公司），Excel 2013（Microsoft公司）。

1．2 免疫反應原理與步驟

圖1 硅片表面的夾心免疫反應

硅片表面可視化免疫檢測方法與夾心ELISA免疫分析原理［8］是相同的，即夾心免疫反應（Sandwich immunoassay）原理。但是由于反應基底和檢測方法不同，兩種方法檢測步驟有較大的差異，硅片表面可視化免疫檢測方法主要步驟（如圖1所示）：①硅片表面功能化，硅片表面旋涂上厚度約為40nm的聚苯乙烯功能化薄膜；②抗體固定，采用點樣儀在硅片表面點上固定抗體，使抗體得以固定，之后加入BSA封閉液進行封閉；③加入樣本，樣本中的待測抗原（標志物）與固定抗體特異性結合，之后使用沖洗液清除未反應的殘留樣本；④加入生物素修飾的標記抗體，標記抗體可以特異性識別被捕捉固定在硅片表面的抗原，形成抗體－抗原－抗體的夾心結構，之后使用沖洗液清除未反應的殘留標記抗體；⑤加入表面修飾了鏈霉親和素的磁顆粒信號探針，磁顆粒探針與被固定的標記抗體上的生物素結合后，使用沖洗液清除未反應的殘留磁顆粒；⑥對固定在硅片表面的磁顆粒進行定量分析，硅片上結合的磁顆粒的密度與樣本中標志物抗原濃度成正相關性。通過磁顆粒數(shù)目與抗原濃度對應關系的標準曲線，計算得到樣本中的抗原濃度。

圖2 光學顯微鏡拍攝的磁顆粒分布圖像

1．3 可視化磁顆粒定量方法

光學顯微鏡以放大5倍的拍攝倍數(shù)拍攝硅片反應點，可以獲得拍攝面積為3．52mm×2．64 mm的圖像，如圖2A所示。熒光顯微鏡以放大100倍的拍攝倍數(shù)，拍照硅片反應點內的磁顆粒分布情況，可以獲得拍攝面積為176μm×132μm，像素面積為680pixel×510pixel的圖片，利用分析軟件Image pro plus對該圖像中顆粒分布進行分析，結果如圖2B、2C和2D所示。圖2A為光學顯微鏡在明場情況下，放大倍數(shù)5倍，曝光時間0．5s的圖像；圖2B為光學顯微鏡在明場情況下，放大倍數(shù)100倍，曝光時間0．5s的圖像，黃色點為磁顆粒，淡綠色區(qū)域為硅片顏色；圖2C為光學顯微鏡在暗場情況下，放大倍數(shù)100倍，曝光時間60s的圖像，白色點為磁顆粒，黑色區(qū)域為硅片顏色；圖2D為2C中的長方形區(qū)域的放大圖像，該圖像采用Image pro plus進行顆粒計數(shù)處理，該區(qū)域內有23個圓形斑點。

通過設定Image pro plus軟件的容差和濾鏡參數(shù)，可以計算出圖像中顆粒的數(shù)目以及顆粒所占的像素面積。圖2C中磁顆粒數(shù)目為236個，總像素面積為9398pixel2。圖2D中磁顆粒數(shù)目為23個，總像素面積為1009pixel2。磁顆粒數(shù)目和像素面積就是硅片表面單位面積（176μm×132 μm）的磁顆粒密度分布的定量化信息。

1．4 NT－proBNP和cTnI標準曲線建立方法

首先，利用254nm紫外光照射硅片15min，使硅片表面PS薄膜活化。然后，采用點樣儀，將濃度均為50μg／mL的NT－proBNP和cTnI固定抗體（NT－proBNP－A5和cTnI－B3）溶液分別點滴到活化后硅片表面的不同位置，室溫干燥5min。最后在硅片表面滴加含有1%牛血清白蛋白的封閉液，封閉5min后用濾紙吸干封閉液，完成“抗體生物硅片”的制作。

將不同濃度的抗原溶液滴加到“抗體生物硅片”上，滴加量為20μL，抗原溶液濃度如表1所示。37℃溫育5min，之后采用沖洗液（pH值7．4的磷酸鹽緩沖液）沖洗1min。然后滴加濃度均為20μg／mL的NT－proBNP和cTnI的混合標記抗體溶液，滴加量為20μL，37℃溫育5min，之后采用沖洗液沖洗1min。最后滴加10倍稀釋的鏈霉親和素標記的磁顆粒溶液，滴加量為20μL，37℃溫育5min，之后采用沖洗液沖洗1min。最終拍攝磁顆粒分布圖像，并利用Image Pro Plus軟件分析圖片定量磁顆粒密度，該步驟耗時約5min。

由于兩標志物之間沒有交叉干擾，硅片可以提供多個固定抗體的包被位置，因此該實驗可以實現(xiàn)在同一硅片表面進行兩種標志物的檢測?？乖瓭舛葹?的濃度水平，平行組為10組，其他濃度水平，平行組為3組。最終根據(jù)檢測磁顆粒密度分布與標志物抗原的濃度關系，分別繪制NT－proBNP和cTnI的標準曲線。

表1 NT－proBNP和cTnI標準曲線中抗原的濃度水平Concentration level of NT－proBNP and cTnI for standard curves

1．5 硅片表面可視化免疫檢測方法的準確度評估

從北大深圳醫(yī)院和深圳人民醫(yī)院收集85例實際人血清樣本，其中51例用Roche公司的Cobas e411免疫分析儀對NT－proBNP濃度進行了定標，全部85例用Beckman Coulter公司的Access2免疫分析儀對cTnI濃度進行了定標。

采用可視化免疫檢測方法對這85例樣本進行檢測，檢測得到的磁顆粒數(shù)目依據(jù)標準曲線轉化為抗原標志物的濃度。根據(jù)Pearson相關性分析［9］，對比可視化免疫檢測方法的檢測結果與商品化免疫分析儀的定標結果的相關性，評價該方法檢測的準確度。

2 結果與討論

2．1 磁顆粒定量研究

磁顆粒定量研究過程中發(fā)現(xiàn)兩個問題需要解決：一是單個磁顆粒所占像素面積不相同；二是高密度磁顆粒分布時，磁顆粒不是單個分布的，而是多個磁顆粒相互聚集分布。

單個磁顆粒所占像素面積不相同的原因：一方面，雖然商品化磁顆粒的標示粒徑為500nm±10nm，但是實際上其中還是存在少量更大粒徑磁顆粒和更小粒徑的磁顆粒。最終拍攝圖像當中非500nm磁顆粒所占的像素面積與500nm磁顆粒的相差較大。另一方面，由于顯微鏡自身對焦的誤差，也會導致單個磁顆粒所占像素面積不相同。為了研究單個磁顆粒所占像素面積差異程度，本實驗隨機選擇并分析了1181個磁顆粒單點像素面積的分布情況，發(fā)現(xiàn)這些單點像素面積是呈現(xiàn)正態(tài)分布的。其中像素面積36～45pixel2所占數(shù)量最多，所占總數(shù)比例為34．8%。像素面積26～65pixel2所占數(shù)目可以達到總數(shù)的76．1%。正態(tài)分布的峰值為41．38pixel2。1181個磁顆粒的平均像素面積為46．8pixel2。因此為了方便數(shù)據(jù)處理，可以規(guī)定單個磁顆粒所占的像素面積為41．38pixel2。

圖3 1181個磁顆粒點像素面積的正態(tài)分布情況

當磁顆粒密度較低時，磁顆粒分散度較高，幾乎沒有聚集的情況，軟件計算的白點數(shù)目與磁顆粒分布數(shù)目相一致，如圖4A所示。當磁顆粒密度較高時，部分磁顆粒之間會聚集在一起，該軟件獲得的白色的點數(shù)目與磁顆粒結合的真實數(shù)目有所偏差，如圖4B所示。當磁顆粒密度更高時，磁顆粒幾乎都是呈現(xiàn)聚集狀態(tài)，此時軟件獲得的白色的點數(shù)目與磁顆粒結合的真實數(shù)目的偏差進一步加大，如圖4C所示。由于磁顆粒是單層聚集，因此聚集在一起所占的像素面積與相互分開所占面積是一致的，并且磁顆粒的聚集程度與磁顆粒的密度之間存在相關性。因此可以采用計算圖像中白點像素面積的方式來分析磁顆粒在硅片上的分布情況。由于規(guī)定單個磁顆粒的像素面積為41．38pixel2。因此圖4A計算得到的磁顆粒數(shù)目為53（2183pixel2），圖4B計算得到的磁顆粒數(shù)目為990（40967pixel2），圖4C計算得到的磁顆粒數(shù)目為1577（65266pixel2）。

圖4 磁顆粒不同分布密度的圖像

2．2 標準曲線

圖5 NT－proBNP不同濃度免疫反應的磁顆粒分布圖像

在最佳反應條件下，利用可視化免疫分析方法對NT－proBNP標準品濃度分別為0pg／mL、20 pg／mL、50pg／mL、100pg／mL、200pg／mL、500 pg／mL、1000pg／mL、4000pg／mL、10000pg／mL、20000pg／mL和40000pg／mL的檢測結果如圖5所示?？梢钥吹?，隨著NT－proBNP抗原濃度的提升，單位面積內的磁顆粒數(shù)目在逐漸增多。當NT－proBNP抗原溶液濃度低于500pg／mL時，磁顆粒分散度比較高，無明顯磁顆粒聚集情況。當NT－proBNP抗原溶液濃度高于1000pg／mL時，磁顆粒出現(xiàn)明顯聚集情況。當NT－proBNP抗原溶液濃度為20000pg／mL和40000pg／mL時，磁顆粒聚集非常嚴重。由表2的數(shù)據(jù)可知，采用Image Pro Plus軟件對圖5的圖像進行磁顆粒計數(shù)，抗原濃度10000pg／mL組的數(shù)據(jù)點已經達到飽和，更高濃度難以區(qū)分。但是采用對磁顆粒像素面積進行分析的方式，抗原濃度20000pg／mL組與40000pg／mL還存在一定的區(qū)分。因此采用計算像素面積的方法，并且根據(jù)規(guī)定的單個磁顆粒的像素面積，可以獲得折算出了單位面積內的磁顆粒數(shù)目。cTnI的計算方法與NT－proBNP計算方法相同。因此，依據(jù)上述方法得到的數(shù)據(jù)分別繪制出NT－proBNP以單位面積磁顆粒折算數(shù)目為Y軸與濃度為X軸的標準曲線（圖6A），以及cTnI的標準曲線（圖6B）。

表2 NT－proBNP不同濃度免疫反應的磁顆粒分布圖像中磁顆粒的數(shù)量和像素面積信息Number and Pixel Area of magnetic particles in the image of NT－proBNP immunoassay in different concentration

圖6 心衰標志物的標準曲線

2．3 表面吸附模型

為了驗證磁顆粒定量方法的可靠性，以及上述標準曲線的準確性，本文研究了磁顆粒在固相表面的吸附模型。

根據(jù)Wang等［10］的研究，單位面積內固相表面的免疫反應過程可以根據(jù)Langmuir吸附等溫方程簡化為如下方程：

如果針對固定抗體－抗原反應，可以采用如下方程：

其中，nmax為針對不同的靶標檢測體系磁顆粒在硅片表面的理論結合最大量，nag為單位面積內抗原在固相抗體上的吸附量，nmax－ag為單位面積內抗原在固相抗體上的最大吸附量，kag為抗原結合在抗體上的結合速率常數(shù)，cag為液相中抗原的濃度，tag為抗原與抗體反應時間。

抗原與標記抗體結合情況，以及標記抗體上生物素和磁顆粒的鏈霉親和素結合情況理論上也符合上述公式。

上述公式中，下標ab代表抗原與標記抗體的結合過程的參數(shù)，下標mp代表標記抗體上生物素和磁顆粒的鏈霉親和素結合過程參數(shù)。

對于夾心免疫過程，雖然在設定的時間內反應沒有達到飽和結合狀態(tài)，但是標記抗體濃度與磁顆粒的濃度都是固定的，抗原反應時間、標記抗體反應時間和磁顆粒反應時間也都是固定的。并且對于同一反應體系，結合速率常數(shù)也是固定的，可以采用常數(shù)K 代替。因此，公式（2）、（3）和（4）可以轉換為如下公式：

由于nmax－ab與nag具有相關性，nmax－mp與nab具有相關性，對于固定反應體系也存在一個固定的相關系數(shù)，通過進一步的簡化，就可以得出磁顆粒在硅片上的吸附量nmp與抗原濃度cag的相關性公式（8）。

由于硅片表面免疫系統(tǒng)有背景吸附的存在，需要在上述公式中添加背景吸附參數(shù)。nmax－agK也可以簡化固定的參數(shù)nmax。因此上述公式可以轉變?yōu)槿缦滦问剑?/p>

其中cag為抗原的濃度，M和N為常數(shù)，其中nmax為針對不同的靶標檢測系統(tǒng)磁顆粒的表面最大吸附量，N－nmax為磁顆粒的背景吸附數(shù)值。公式（9）可以作為單位面積內硅片表面磁顆粒的吸附模型。

從NT－proBNP和cTnI的實驗數(shù)據(jù)、標準曲線、硅片表面磁顆粒的吸附模型以及臨床相關研究，可以獲得如表3的數(shù)據(jù)。其中檢測限（Limit of detection，LOD）為背景（抗原濃度為0）檢測均值加兩倍標準差所得到的結果。

標志物NT－proBNP和cTnI的標準曲線的公式與硅片表面磁顆粒的吸附模型相吻合。理論上的兩個標志物反應體系的磁顆粒最大吸附量（nmax＊）和背景吸附（N＊－nmax＊）都與真實檢測結果（nmax和N－nmax）相接近。因此，定量計算得到的單位面積內磁顆粒數(shù)目與理論推算是一致的，磁顆粒定量方法是可靠的，NT－proBNP和cTnI標準曲線是準確的。

表3 心衰標志物NT－proBNP和cTnI檢測的相關參數(shù)Parameters of heart failure biomarkers（NT－proBNP and cTnI）detection

2．4 準確度評估

對于NT－proBNP標志物的檢測，測試樣本數(shù)為83例，其中無標示樣本數(shù)為32例，有效樣本數(shù)為51例。硅片表面可視化免疫檢測方法與對比儀器Cobas e411的Pearson相關分析結果如圖7A所示。Pearson相關系數(shù)為rp＝0．9874（P＜0．001），兩種方法測定結果一致性良好。兩測量值擬合的線性回歸方程為y＝－4．6808＋1．0559 x（R2＝0．9749），回歸方程成立（P＜0．001），截距及斜率的95%置信區(qū)間（Confidence Interval，CI）分別為［－87．9，78．6］、［1．0320，1．0799］。

對于cTnI標志物的檢測，測試樣本數(shù)為85例，其中遺失樣本數(shù)為2例，有效樣本數(shù)為83例。硅片表面可視化免疫檢測方法及對比儀器Access2的Pearson相關分析結果見圖7B所示。Pearson相關系數(shù)為rp＝0．9897（P＜0．001），兩種方法測定結果相關性好。兩測量值擬合的線性回歸方程為y＝0．0005＋0．9758x（R2＝0．9793），回歸方程成立（P＜0．001），截距及斜率的95%CI分別為［－0．0776，0．0785］、［0．9601，0．9915］。

圖7 硅片表面免疫分析法及Cobas e411對NT－proBNP檢測的Pearson相關性分析（A）；硅片表面免疫分析法及Access2對cTnI檢測的Pearson相關性分析圖（B）

3 結論

利用Image Pro Plus軟件分析176μm×132 μm面積內的磁顆粒數(shù)目來定量分析免疫反應抗原濃度的方法是可行的。建立的磁顆粒數(shù)目與標志物抗原濃度關系的標準曲線方程與理論推導的表面吸附模型相吻合。硅片表面可視化心衰標志物檢測方法，從抗體包被到檢測結束不超過1h，并且操作簡單，可以在同一硅片上對兩種標志物NT－proBNP和cTnI同時檢測，大大縮短了心衰疾病的診斷周期。NT－proBNP和cTnI最低檢測濃度都低于臨床cut－off值，檢測范圍也達到了商品化免疫分析儀的檢測水平。85例不同程度心血管疾病患者的血清樣本的檢測結果與商品化免疫分析儀（Roche Cobas e411 和 Beckman Coulter Access2）的檢測結果相一致，相關系數(shù)r＞0．98（R2＞0．97）。因此，硅片表面可視化心衰標志物聯(lián)合檢測方法可以滿足心衰標志物NT－proBNP和cTnI臨床快速檢測的需要。并且該方法未來也會在醫(yī)學檢測的其他領域發(fā)揮巨大的應用價值。

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