曹洪玉，王 珍，唐 乾，鄭學(xué)仿

（1．大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連116622；2．大連大學(xué) 遼寧省生物有機化學(xué)重點實驗室，遼寧 大連116622；3．大連大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連116622）

蛋白質(zhì)、核酸、多糖等大分子物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的濃度很高，使得細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境是高度擁擠的，大分子在細(xì)胞內(nèi)的濃度可高達(dá)80～400g／L［1］，能占細(xì)胞總?cè)莘e的20%～30%［2］，由于排斥容積效應(yīng)，任何可增加可用容積的反應(yīng)都能被大分子擁擠試劑刺激發(fā)生［3－6］。在生物體內(nèi)，大多數(shù)的生化反應(yīng)都是在這種高度擁擠的環(huán)境中完成的，當(dāng)?shù)鞍状嬖谟诖蠓肿訐頂D環(huán)境中時，其微環(huán)境會發(fā)生改變，使得蛋白的結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性發(fā)生變化［2，7］，從而使得蛋白的功能表達(dá)在擁擠試劑和稀溶液中不同。

生命體的重要組成部分——血紅素類蛋白，在生命體中承擔(dān)著極其重要的功能，例如作為生物催化劑、電子傳遞蛋白、氧載體和生物傳感器等［8］。由于血紅素類蛋白含有原卟啉Ⅸ輔基，故其能夠吸收特定波長的光，光照通過影響血紅素功能的表達(dá)而影響蛋白功能。關(guān)于光照射血紅素類蛋白的研究已有報道，如血紅蛋白、肌紅蛋白、細(xì)胞色素P450、細(xì)胞色素C、細(xì)胞色素C氧化酶和辣根過氧化物酶等［9－14］，但是這些研究是在稀溶液中進(jìn)行的，忽略了生物體細(xì)胞內(nèi)的擁擠環(huán)境。目前關(guān)于血紅素類蛋白在高度擁擠環(huán)境下光照的研究還很少。

辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）是以鐵卟啉為輔基的血紅蛋白，辣根過氧化物酶能利用過氧化氫氧化一些有機和無機化合物，它與植物的呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都緊密相關(guān)，而且對氧自由基具有消除作用，減少過氧化物對植物體的毒害作用。辣根過氧化物酶在生物傳感器［15］、環(huán)境監(jiān)測、工業(yè)應(yīng)用［16］等方面也發(fā)揮了很大的作用，廣泛地運用于基因?qū)W、生理學(xué)及病理學(xué)研究中［17，18］。

我們最近研究了紫外－可見光誘導(dǎo)細(xì)胞色素C、高鐵肌紅蛋白［19，20］和 HRP的還原及其機制，發(fā)現(xiàn)它們的光還原反應(yīng)機制都是光誘導(dǎo)分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移。為了進(jìn)一步了解光誘導(dǎo)血紅素蛋白在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中的還原過程，本文通過在光照體系中加入大分子擁擠試劑來模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，研究了該條件下光誘導(dǎo)HRP的還原，利用紫外－可見吸收光譜、同步熒光光譜及圓二色譜等方法對擁擠環(huán)境中光照射HRP后其血紅素中鐵原子價態(tài)、蛋白構(gòu)象及二級結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行了研究，確定了擁擠環(huán)境中HRP的最適光還原條件，分析了光照波長、溫度、擁擠試劑濃度等對HRP光還原的影響。

1 實驗部分

1．1 試劑與儀器

辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）樣品購自美國Sigma公司，使用時未經(jīng)進(jìn)一步提純，溶解在0．05mol／L的 Na2HPO4－NaH2PO4緩沖溶液（pH＝7．4）中，配置成濃度為5×10－4mol／L的蛋白溶液，蛋白溶液冷凍避光保存并盡快應(yīng)用于實驗。

Dextran70和Ficoll70購自上海生工公司，分別將大分子擁擠試劑Dextran70和Ficoll70溶解到pH 7．4的PB緩沖溶液中，使其終濃度達(dá)到50g／L、100 g／L、200g／L和400g／L，實驗用水為去離子水。

實驗儀器主要有 UV－Vis分光光度計（V－560，日本Jasco公司），熒光光譜儀（FP－6500，日本Jasco公司）和圓二色光譜儀（J－810，日本Jasco公司），制冷和加熱循環(huán)器（F－12，德國Julabo公司），實驗室pH計（PHSJ－4A，上海雷磁分析儀器廠），實驗所用光源為熒光光譜儀的氙燈。

1．2 實驗過程

1．2．1 樣品處理

取20μL濃度為5×10－4mol／L的 HRP蛋白分別加入到1．98mL PB緩沖液和已配好的Dextran70、Ficoll70溶液中，得到濃度為5×10－6mol／L的HRP蛋白溶液，將蛋白樣品置于10mm石英比色池中，密封并持續(xù)通入N2，用熒光光譜儀中的氙燈進(jìn)行光照，然后進(jìn)行光譜測定。

1．2．2 光譜測定

UV－Vis光譜測定：狹縫寬度2nm，掃描波長范圍220～700nm，掃描速度200nm／min，響應(yīng)時間為中等，累計掃描3次。

熒光光譜測定：將擁擠試劑Dextran70和Ficoll70放入10mm石英比色池中進(jìn)行熒光光譜測定，測定條件為：激發(fā)波長280nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5nm，掃描速度為500nm／min，響應(yīng)時間為0．5s，檢測器靈敏度為中等，累計掃描3次。

同步熒光光譜測定：以Δλ＝20nm和Δλ＝60 nm測定處理后樣品的同步熒光光譜。激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5nm，掃描速度為500nm／min，響應(yīng)時間為0．5s，檢測器靈敏度為中等，累計掃描3次。

圓二色光譜測定：狹縫寬度1nm，掃描波長范圍190～250nm，掃描速度50nm／min，響應(yīng)時間1s，累計掃描3次。

2 結(jié)果與討論

2．1 稀溶液／擁擠環(huán)境中HRP的紫外－可見與同步熒光光譜

在稀溶液中，辣根過氧化物酶在403nm處的吸光度為0．43，在擁擠試劑Dextran70與Ficoll70中，HRP在403nm處的吸光度分別為0．48和0．49，與稀溶液中的HRP蛋白在403nm處的紫外吸收強度相比，擁擠試劑中的HRP蛋白在403 nm處的紫外吸收強度要強。這是由于擁擠試劑對血紅素周圍的環(huán)境有一定的影響，血紅素在擁擠試劑中暴露較多，使得吸光度較強。HRP的紫外－可見吸收光譜見圖1。

圖1 HRP的紫外－可見吸收光譜

色氨酸殘基和酪氨酸殘基是蛋白質(zhì)熒光的主要貢獻(xiàn)因素［21］。利用同步熒光光譜可得到酪氨酸和色氨酸殘基的特征峰。當(dāng)選擇Δλ＝20nm時顯示的是酪氨酸殘基的熒光峰，當(dāng)選擇Δλ＝60nm時表現(xiàn)的則是色氨酸殘基的熒光峰，并且色氨酸殘基的熒光強度和位置對其周圍的環(huán)境是敏感的［22］。色氨酸殘基的最大發(fā)射波長紅移，表明其所處環(huán)境極性增加，疏水性降低，蛋白疏水結(jié)構(gòu)瓦解，肽鏈伸展程度有所增加；藍(lán)移則表明疏水性增加，分子趨于折疊狀態(tài)［23］。我們可以根據(jù)這些現(xiàn)象來判斷蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化［21］。

在稀溶液中，Δλ＝20nm時（圖2A），HRP的酪氨酸殘基的熒光峰在305nm處，Δλ＝60nm（圖2B）時，HRP的色氨酸殘基的熒光峰在344nm處。由于擁擠試劑自身能夠吸收一定波長的光而發(fā)射出熒光（圖3），所以在稀溶液中加入擁擠試劑時，使得HRP蛋白溶液的熒光強度急劇增強，酪氨酸和色氨酸殘基的熒光峰被掩蓋。與相同濃度的Dextran70相比，F(xiàn)icoll70的熒光強度更強（圖3C）。

2．2 不同溶液中HRP的光還原

圖2 不同溶液中HRP的同步熒光光譜

圖3 大分子擁擠試劑Dextran70和Ficoll70的同步熒光光譜（A）Δλ＝20nm；（B）Δλ＝60nm；（C）熒光光譜

圖4 24℃，403nm光照射不同溶液中HRP其Soret帶吸收峰面積的變化

辣根過氧化物酶在稀溶液與大分子擁擠試劑中采用403nm單色光照射前后Soret帶吸收峰面積變化情況如圖4。從圖可以看出，403nm光照射 時，HRP在PB溶液及Dextran 7 0溶液中可以發(fā)生光還原反應(yīng)，而在Ficoll70溶液中沒有發(fā)生光還原反應(yīng)。在PB溶液中HRP蛋白隨著光照時間的增長被光還原的量增多，而在Dextran70溶液中，光照0．5h之內(nèi)HRP蛋白被還原的量較多，隨著光照時間的增長HRP蛋白被還原的量有所減少。辣根過氧化物酶在稀溶液與大分子擁擠試劑中，分別采用280nm單色光照射前后其Soret帶吸收峰面積變化情況如圖5。從圖中可以看出，HRP蛋白在擁擠試劑Dextran70和Ficoll70溶液中有利于光還原反應(yīng)的發(fā)生，并且相同光照時間內(nèi)，在Ficoll70溶液中HRP蛋白被光還原的量更多。HRP的光還原機理為光誘導(dǎo)的蛋白分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移，在擁擠條件下HRP蛋白光還原反應(yīng)易于發(fā)生的主要原因是：擁擠試劑Dextran70和Ficoll70自身均能發(fā)射熒光，在Dextran70和Ficoll70溶液中HRP蛋白的光還原程度不同，也體現(xiàn)了這兩種擁擠試劑光吸收和熒光發(fā)射的差異。這種差異是由擁擠試劑結(jié)構(gòu)的不同造成的，Dextran70的持續(xù)長度約為0．4nm，是一種無交聯(lián)線性的、相對靈活的大分子聚合物，而Ficoll70具有高度交聯(lián)的結(jié)構(gòu)，是一種剛性共聚體。因此，當(dāng)Dextran70與Ficoll70濃度相同時，Dextran70可以在溶液中形成準(zhǔn)隨機螺旋，從而容納更多的間隙空間，排阻體積效應(yīng)變小，吸收光能力變?nèi)?，使得其熒光發(fā)射強度較小，不利于HRP蛋白分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的發(fā)生。

2．3 光照波長對HRP光還原的影響

圖5 24℃，280nm光照射不同溶液中HRP其Soret帶吸收峰面積的變化

不同波長的光能量是不同的，對HRP的光還原情況不同，因此我們考察了擁擠條件下不同定波長光照射HRP溶液的光還原情況，圖6A為在擁擠試劑Dextran70溶液中，分別用272、280、403和498nm波長的光照射HRP蛋白樣品后，其Soret帶吸收峰面積隨光照時間的變化。發(fā)現(xiàn)272和498nm兩種波長的光不能使HRP蛋白發(fā)生光還原反應(yīng)。而280和403nm兩種波長的光照射HRP蛋白溶液可以使其發(fā)生光還原反應(yīng)。圖6B為在擁擠試劑Ficoll70溶液中，分別用280、403和498nm波長的光照射HRP蛋白樣品后，其Soret帶吸收峰面積隨光照時間的變化。發(fā)現(xiàn)只有280 nm波長的光照射蛋白溶液時能使HRP發(fā)生光還原反應(yīng)。造成這種現(xiàn)象的原因是擁擠試劑Ficoll70在280nm處有紫外吸收，采用280nm波長的光照射HRP蛋白溶液，可以激發(fā)擁擠試劑Ficoll70發(fā)射熒光，從而誘導(dǎo)HRP發(fā)生還原。

圖6 擁擠條件下不同定波長光照射HRP溶液后其Soret帶吸收峰面積的變化

2．4 溫度對HRP光還原的影響

溫度的改變可引起HRP蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，而HRP蛋白構(gòu)象的變化會影響其酶活性。為此我們考察了不同溫度（4℃、24℃、44℃）對大分子擁擠環(huán)境中HRP光還原的影響。

圖7 不同溫度下光照HRP其Soret帶吸收峰面積隨時間的變化

在擁擠試劑Dextran70中（圖7A），HRP蛋白溶液在4℃、24℃、44℃三種溫度下采用403nm單色光照射0．5h后，其Soret帶吸收峰面積減小都比較明顯。在溫度為24℃時，隨著光照時間的增長，Soret帶峰吸收峰面積趨于平緩，在溫度為4℃和44℃時，隨著光照時間的增長，Soret帶吸收峰面積越來越小，且4℃時Soret帶峰面積減少更明顯，說明在Dextran70大分子擁擠環(huán)境中，403nm單色光照、4℃時最有利于HRP光還原反應(yīng)的發(fā)生。在擁擠試劑Ficoll70中（圖7B），HRP蛋白溶液在4℃、24℃、44℃三種溫度下采用280nm單色光照射，隨著光照時間的增加，其Soret帶吸收峰面積逐漸減少，在24℃，Soret帶吸收峰面積減少程度最明顯，說明在擁擠試劑Ficoll70中，280nm單色光照、24℃時，最有利于HRP光還原反應(yīng)的進(jìn)行。

2．5 擁擠試劑濃度對HRP光還原的影響

圖8為不同濃度大分子擁擠試劑中HRP光還原的情況。大分子擁擠試劑Dextran70濃度為100g／L時，光照后HRP蛋白在Soret帶吸收峰面積減少的最多，濃度為400g／L時Soret帶吸收峰面積反而增加。說明Dextran70濃度為100g／L時光照還原HRP的能力最強?？赡苁荄extran70在較高濃度時使得HRP蛋白的血紅素暴露增多，Soret帶的吸收峰面積增大，且當(dāng)Dextran70濃度達(dá)到200g／L時會發(fā)生濃度熒光猝滅，其熒光發(fā)射強度降低，引起HRP光還原程度降低。在大分子擁擠試劑Ficoll70中，光照后HRP蛋白在Soret帶吸收峰面積隨著Ficoll70濃度的增大而逐漸減小，F(xiàn)icoll70濃度為400g／L時吸收峰面積減少的最多，即濃度為400g／L時HRP的光還原能力最強。Ficoll70濃度增加其熒光發(fā)射強度則會逐漸增強，從而使HRP的光還原程度增大。

圖8 光照后不同濃度大分子擁擠試劑中HRP Soret帶吸收峰面積的變化

2．6 擁擠環(huán)境中光照射HRP二級結(jié)構(gòu)的變化

某些反應(yīng)引起的蛋白分子二級結(jié)構(gòu)變化可以通過CD光譜進(jìn)行檢測，因此，我們選用遠(yuǎn)紫外區(qū)CD光譜對擁擠環(huán)境中光誘導(dǎo)HRP還原所引起的蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行檢測，進(jìn)一步了解擁擠環(huán)境中光誘導(dǎo)HRP蛋白的還原過程。不同光照時間HRP的遠(yuǎn)紫外CD光譜如圖9。由圖可知，稀溶液和擁擠試劑中的辣根過氧化物酶在208nm和222nm均表現(xiàn)出兩個負(fù)峰，反映的是α－螺旋結(jié)構(gòu)蛋白的特征譜帶，隨著光照時間的增加（0．5h、1h、2h、3h）HRP在稀溶液與擁擠試劑中208nm和222nm的兩個負(fù)峰未發(fā)生變化，說明光照時間內(nèi)蛋白未變性，光照后蛋白的二級結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變。

圖9 不同溶液中HRP光照后的CD光譜CD spectra of HRP under different solutions

3 結(jié)論

本文通過光譜法，對光誘導(dǎo)大分子擁擠環(huán)境中辣根過氧化物酶的還原過程進(jìn)行了研究，結(jié)果表明大分子擁擠試劑對光還原HRP的電子傳遞過程及效率有影響。當(dāng)采用403nm單色光照射HRP蛋白溶液時，HRP在擁擠試劑葡聚糖70（Dextran70）中還原程度較好，而在聚蔗糖70（Ficoll70）擁擠環(huán)境下HRP不發(fā)生光還原反應(yīng)；采用280nm單色光照射時，在大分子擁擠試劑葡聚糖70（Dextran70）和聚蔗糖70（Ficoll70）環(huán)境中，HRP光還原反應(yīng)得到促進(jìn)，且大分子Ficoll70溶液對HRP光還原反應(yīng)的促進(jìn)作用更加明顯；光誘導(dǎo)HRP還原的最適溫度在Dextran70和Ficoll70溶液中分別為4℃和24℃，定波長280nm光照射利于HRP還原；HRP在Dextran70溶液中的最適光還原濃度是100g／L，在Ficoll70環(huán)境中HRP還原程度隨著Ficoll70濃度的增加增大；通過CD光譜可知光照射擁擠環(huán)境中HRP被還原后，其二級結(jié)構(gòu)基本沒有變化。

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