李海利，徐引弟，焦文強(qiáng)，朱文豪，王克領(lǐng)，徐照學(xué)

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002）

豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測(cè)方法的建立

李海利，徐引弟，焦文強(qiáng)，朱文豪，王克領(lǐng)，徐照學(xué)

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002）

為研究一種豬流行性腹瀉早期快速分子生物學(xué)診斷方法，本研究根據(jù)GenBank中豬流行性腹瀉（por?cine epidem ic diarrhea，PED）病毒基因組S基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增特異的核苷酸序列（GenBank∶AB548624.1），預(yù)期擴(kuò)增基因片段大小為200 bp。結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的引物能擴(kuò)增出目的基因，擴(kuò)增的基因片段大小與預(yù)期的一致，且具有敏感性高、特異性和重復(fù)性好的特點(diǎn)。應(yīng)用建立的條件和方法，采集臨床疑似病例樣本16份，9份均擴(kuò)增出目的條帶，具有較好的特異性。本研究為PED臨床診斷提供一種快速、簡(jiǎn)便方法，可用于PED的凈化診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

豬流行性腹瀉病毒；RT-PCR；分子診斷

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diar rhea, PED）是由豬流行性腹瀉病毒引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，以嘔吐、腹瀉和食欲下降為基本特征，各種年齡的豬均可易感。主要引起哺乳仔豬、架子豬和育肥豬群急性腹瀉[1-5]。該病在許多國(guó)家和地區(qū)流行[6]。PED病毒可在豬群中持續(xù)存在，各種年齡的豬都易感，哺乳仔豬、架子豬和育肥豬的發(fā)病率可達(dá)100%，尤其以哺乳仔豬嚴(yán)重[7]。母豬的發(fā)病率在15%～90%。本病主要在冬季多發(fā)，夏季也可發(fā)生。PED的診斷方法主要有免疫電鏡、免疫熒光、間接血凝試驗(yàn)、ELISA、RT-PCR、中和試驗(yàn)等[8-11]。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，ELISA和RT-PCR的方法已成為檢測(cè)PEDV的特異性診斷方法，在目前應(yīng)用最為廣泛。ELISA法的最大優(yōu)點(diǎn)是可從糞便中直接檢查PEDV抗原，也可用于PED抗體的檢測(cè)。本研究對(duì)PEDV的RT-PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件進(jìn)了優(yōu)化，縮短了檢測(cè)時(shí)間，使檢測(cè)方法具有更加準(zhǔn)確、特異、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，為PED臨床診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查提供一種有效的早期快速分子診斷方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 病毒和細(xì)菌 豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、輪狀病毒（RTV）、沙門氏菌（S）、大腸桿菌（Coli）均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離并保存。

1.1.2 試劑 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，限制性內(nèi)切酶，Taq DNA聚合酶，RNA酶抑制劑，100 bp DNA Marker，dNTP， MgCl2， RT-PCR Buf fer， DEPC-t reated ddH2O，RNase-f ree離心管，病毒和細(xì)菌RNA和DNA提取試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒與膠回收試劑盒均購(gòu)自大連寶生物生物工程有限公司。

1.1.3 樣品采集與處理 無(wú)菌采集患病動(dòng)物的新鮮糞便，用生理鹽水稀釋5倍，漩渦攪拌均勻，8 000 r/ min離心10 min，取上清液置于-20℃保存?zhèn)溆没蛄⒓刺崛NA。

1.2 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中PED病毒基因組S基因序列及相應(yīng)參考文獻(xiàn)[12-14]，設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增特異的核苷酸序列，上游引物為：5′-TTTATTCTGTCACGCCAT-3′，下游引物∶ 3′-AGATTTACAAACACCTATGTTA-5′。預(yù)期擴(kuò)增片段為200 bp,引物由上海生工生物工程有限公司合成，用超純凈水稀釋為25 pmol/μL，備用。

1.3 RNA的提取 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）采用柱式動(dòng)物組織總RNA抽提純化試劑盒（SK86952，上海生工），按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。反應(yīng)體系為25μL，取提取的RNA 5μL，加入下游引物2μL，5×RT Buf fer 5μL，2.5 mmol/L dNTP 5μL，RNA酶抑制劑1μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶1μL，水1μL，充分混合均勻后短暫離心，在42℃作用1 h。

以上述cDNA為模板，按以下體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：反應(yīng)總體積為25μL，無(wú)菌超純水7μL，2×Buffer(Mg+)4.5μL，dNTPS4.0μL(2.5 mmol/μL)，上游引物2μL(25 pmol/μL)，下游引物2μL (25 pmol/μL)，Taq enzyme 0.5μL(5 U/μL)，cDNA 5μL。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)，最后72℃ 延伸10 min。

1.4 RT-PCR產(chǎn)物的檢測(cè) 取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物和5μL Loading Buf fer混勻，加到含EB的1.5%的瓊脂糖凝膠中，同時(shí)加入對(duì)照和DNA Marker（100 bp）,電壓為120 V， 電泳1 h左右，然后在凝膠成像儀中觀察。

1.5 RT-PCR產(chǎn)物序列分析 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，送寶生物生物工程有限公司測(cè)序，所得序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)。

1.6 RT-PCR特異性試驗(yàn) 分別按照已建立的方法（1.3）提取感染豬傳染性胃腸炎（TGEV）、輪狀病毒（RTV）、沙門氏菌（S）、大腸桿菌（Coli）的基因組RNA或DNA，然后進(jìn)行RT-PCR和PCR進(jìn)行擴(kuò)增。

1.7 RT-PCR敏感性試驗(yàn) 將提取的PDEV RNA定量，依次10倍稀釋，取1μL樣品加到9μL DEPC水中，再取1μL加到9μL DEPC水中，依次類推，使其為10μg、1μg、0.1μg、10 pg、1 pg、0.1 pg、0.01 pg、0.001 pg、0.000 1 pg、0.000 01 pg的RNA含量，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后分別作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，確定其敏感性。

1.8 RT-PCR重復(fù)性試驗(yàn) 用已建立的RT-PCR檢測(cè)方法，對(duì)感染PED病料，TGEV、RTV、S、Col i、健康組織及3份檢測(cè)為PED陽(yáng)性的病料和3份陰性病料，重復(fù)檢驗(yàn)3次，驗(yàn)證本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。1.9 臨床應(yīng)用 利用建立的RT-PCR檢測(cè)方法檢測(cè)臨床送檢的疑似病料16份，對(duì)RT-PCR陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳，PED病毒擴(kuò)增產(chǎn)物在200 bp處可見(jiàn)特異性擴(kuò)增條帶，見(jiàn)圖1，與預(yù)期大小相符。

2.2 RT-PCR產(chǎn)物序列分析 按常規(guī)方法，將PCR產(chǎn)物克隆于pMD18-T載體，重組質(zhì)粒由寶生物生物工程有限公司測(cè)序。所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)比對(duì)與PED的同源性達(dá)99%以上。

2.3 RT-PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果 利用設(shè)計(jì)的引物和方法對(duì)PED病毒擴(kuò)增出了200 bp的目的基因片段，而對(duì)TGE、RT、S和Col i均未擴(kuò)增出目的片段，見(jiàn)圖2。

M：100 bp DNA Marker； 1：PED圖1 目的基因的RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 Am plification of the target gene by RT-PCR

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，PCR檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.1 pg RNA，見(jiàn)圖3。

M：100 bp DNA Marker,1：PED；2：TGE；3：RT；4：Col i；5：H2O圖2 RT-PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Am p lification o f the target gene by specific RT-PCR

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 3次重復(fù)檢測(cè)的結(jié)果完全一致，說(shuō)明該方法顯示出了良好的穩(wěn)定性。

2.6 臨床應(yīng)用 應(yīng)用本研究建立的PEDV RT-PCR檢測(cè)方法共檢測(cè)了16份在不同地區(qū)采集的糞便病料。結(jié)果顯示檢出陽(yáng)性樣品9份，見(jiàn)圖4，將陽(yáng)性樣品的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆后序列分析顯示均為PEDV。

3 討論

PED是豬消化道系統(tǒng)疾病的一種常發(fā)疾病，豬場(chǎng)一旦發(fā)生了本病，很難徹底根除和凈化[12-17]。病豬和帶毒豬是主要傳染源，病毒多經(jīng)發(fā)病豬的糞便排出[18]。傳播途徑是消化道。PED臨床常單發(fā)或與豬傳染性胃腸炎混合感染，有時(shí)與圓環(huán)病毒混合感染或與細(xì)菌病混合感染[19-22]。本研究所建立的方法具有靈敏度高、特異性好的特點(diǎn)，能快速早期的查出隱性感染帶毒豬。

該病一旦發(fā)生，沒(méi)有很好的治療措施，豬用干擾素可以降低體重?fù)p失，與單克隆抗體配合使用可以降低仔豬的死亡率，治療小豬要及時(shí)補(bǔ)充葡萄糖、甘氨酸和電解質(zhì)溶液及口服補(bǔ)液鹽。疫苗免疫接種是目前預(yù)防PED的主要手段。該病由于發(fā)病日齡小、發(fā)病急、死亡率高等特點(diǎn)，依靠自身的免疫往往來(lái)不及，因此大多是通過(guò)給母豬注射疫苗，依靠母乳中的特異性抗體給仔豬提供良好的保護(hù)[23]。母豬分娩前20～30 d肌肉或后海穴注射疫苗，仔豬通過(guò)采食初乳而獲得被動(dòng)免疫。預(yù)防本病要做好平時(shí)的飼養(yǎng)管理工作，發(fā)現(xiàn)有本病發(fā)生時(shí)及時(shí)采取隔離、消毒、減少人員流動(dòng)、采用全進(jìn)全出制等措施進(jìn)行預(yù)防和控制。

RT-PCR的檢測(cè)技術(shù)受到很多因素的影響，如引物的特異性及用量、RNA的用量、退火溫度等均可以影響RT-PCR的擴(kuò)增效率以及特異性，進(jìn)而影響RT-PCR檢測(cè)的靈敏度。其中最關(guān)鍵的是引物的敏感性和特異性，只有較強(qiáng)的敏感性和特異性的引物才能進(jìn)行快速有效的檢測(cè)。本研究針對(duì)RT-PCR反應(yīng)的條件進(jìn)行優(yōu)化，以確保整個(gè)反應(yīng)的準(zhǔn)確高效擴(kuò)增，降低非特異性反應(yīng)。

本研究通過(guò)對(duì)引物濃度、MgCl2濃度、退火溫度、循環(huán)條件等的優(yōu)化，確立了最佳濃度和PCR反應(yīng)程序，其最佳RT-PCR體系的最佳條件為：引物濃度：1.0～1.2μmol/L，MgCl2濃度：2 mmol/L，退火溫度：56℃。最佳循環(huán)條件為：95℃ 3 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 10 min。并對(duì)其特異性、敏感性、重復(fù)性和臨床應(yīng)用做了研究，特異性較好，敏感型可檢測(cè)0.1 pg RNA，具有較好的敏感性，重復(fù)性做了三次，重復(fù)性較好，最后對(duì)臨床樣本進(jìn)行了臨床應(yīng)用，共采集16份臨床樣品，檢出9份陽(yáng)性。

M：DL2000 bp DNA Marker；1：10μg RNA；2：1μg RNA；3：0.1μg RNA；4：10 pg RNA；5：1 pg RNA；6：0.1 pg RNA；7：0.01 pg RNA；8：0.001 pg RNA；9：0.0001 pg RNA；10：0.00001 pg RNA圖3 RT-PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Am plification of the target gene by sensitivity RT-PCR

M：DL2 000 bp DNA Marker,1、2、3、6、7、8、9、10、11 positive sample；4、5、12、13、14、15、16 negative sample圖4 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Results o f clinical sam ples

綜上，本研究建立的PDE RT-PCR分子診斷方法，具有較好的特異性、敏感性和重復(fù)性，為PED臨床快速檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)便方法，同時(shí)為PED流行病學(xué)調(diào)查和分子診斷奠定了基礎(chǔ)。

[1]Oh,J.S.,Song,D.S.,Yang,et al.Comparison of an enzyme-l inked immunosorbent assay with serum neutralization test for serodiagnosis of porcine epidemic diar rhea virus infection [J].J Vet Sci,2005,6(4)∶349-352.

[2]Lee,J.H.,Park,J.S.,Lee,S.W.,et al.Porcine epidemic diar rhea virus infection∶Inhibition by polysaccharide f rom Ginkgo biloba exocarp and mode of its action[J].Virus Res, 2015,195∶148-152.

[3]Dee,S.,Neil l,C.,Clement,T.,et al.An evaluation of a l iquid antimicrobial (Sal CURB(R))for reducing the risk of porcine epidemic diar rhea virus infection of naive pigs during consumption of contaminated feed[J]. BMC Vet Res,2014,10(1)∶220.

[4]Dee,S.,Clement,T.,Schelkopf,A.,et al. An evaluation of contaminated complete feed as a vehicle for porcine epidemic diar rhea virus infection of naive pigs fol lowing consumption via natural feeding behavior∶proof of concept[J].BMC Vet Res,2014,10(1)∶176.

[5]Lowe,J.,Gauger,P.,Harmon,K.,et al.Role of t ranspor tation in spread of porcine epidemic diar rhea virus infection[J].Emerg Infect Dis,2014,20(5)∶872-874.

[6]Schoborg,R.V.,Borel,N.Porcine epidemic diar rhea virus(PEDV)co-infection induced chlamydial persistence/st ress does not require viral repl ication[J].Front Cel l Infect Microbiol,2014,4∶20.Front Cel l Infect Microbiol 4,20.

[7]Kotani,O.,Shirato,K.,Nagata,N.,et al. Neuropathogenesis of a mouse-adapted porcine epidemic diarrhea virus infection in suckling mice[J].J Gen Virol,2013,94(Pt 4)∶831-836.

[8]Madson,D.M.,Magstadt,D.R.,Ar ruda,P.H., et al.Pathogenesis of porcine epidemic diarrhea virus isolate (US/Iowa/18984/2013) in 3-week-old weaned pigs[J]. Vet Microbiol, 2014,174(1-2)∶60-68.

[9]Pujols,J.,Segales,J.Survivabil ity of porcine epidemic diar rhea virus(PEDV)in bovine plasma submit ted to spray drying processing and held at dif ferent time by temperature storage conditions[J].Vet Microbiol,2014, 174(3-4)∶427-432.

[10]Gerber,P.F.,Gong,Q.,Huang,Y.W.,et al. Detection of antibodies against porcine epidemic diarrhea virus in serum and colostrum by indirect ELISA[J].Vet J,2014,202(1)∶33-36.

[11]Gerber,P.F.,Xiao,C.T.,Chen,Q.,et al. The spray-drying process is suf f icient to inactivate infectious porcine epidemic diarrhea virus in plasma [J]. Vet Microbiol, 2014,174(1-2)∶86-92.

[12]Song,D.S.,Kang,B.K.,Oh,J.S.,et al.Multiplex reverse t ranscription-PCR for rapid di f ferential detection of porcine epidemic diar rhea virus, t ransmissible gast roenteritis virus,and porcine group A rotavirus[J]. Vet Diagn Invest,18,278-281.

[13]Jung,K.,Chae,C.Ef fect of temperature on the detection of porcine epidemic diar rhea virus and t ransmissible gastroenteritis virus in fecal samples by reverse t ranscription-polymerase chain reaction[J].Vet Diagn Invest,16,237-239.

[14]Kim,S.Y.,Song,D.S.,Park,B.K.Di f ferential detection of t ransmissible gast roenteritis virus and porcine epidemic diar rhea virus by duplex RT-PCR[J].Vet Diagn Invest, 13,516-520.

[15]Wang,L.,Zhang,Y.,Byrum,B.Developmentand evaluation of a duplex real-time RT-PCR for detection and di f ferentiation of virulent and variant st rains of porcine epidemic diar rhea viruses f rom the United States[J]. J Virol Methods,2014,207∶154-157.

[16]Oka,T.,Sai f,L.J.,Marthaler,D.,et al. Cel l cul ture isolation and sequence analysis of genetical ly diverse US porcine epidemic diar rhea virus st rains including a novel strain with a large deletion in the spike gene[J]. Vet Microbiol, 2014, 173(3-4)∶258-269.

[17]Zhao,P.D.,Bai,J.,Jiang,P.,et al.Development of a mul tiplex TaqMan probe-based real-time PCR for discrimination of variant and classical porcine epidemic diar rhea virus[J].J Virol Methods,2014,206∶150-155.

[18]Park,J.E.,Shin,H.J.Porcine epidemic diarrhea virus infects and replicates in porcine alveolar macrophages[J]. Virus Res, 2014, 191∶143-152.

[19]Temeeyasen, G., Srijangwad, A., Tripipat, T., et al. Genetic diversity of ORF3 and spike genes of porcine epidemic diar rhea virus in Thailand[J].Infect Genet Evol,2014, 21∶205-213.

[20]Choi,J.C.,Lee,K.K.,Pi,J.H.,et al.Comparative genome analysis and molecular epidemiology of the reemerging porcine epidemic diar rhea virus st rains isolated in Korea [J].Infect Genet Evol,2014,26∶348-351.

[21]Zhao,S.,Gao,J.,Zhu,L.,et al.Transmissible gast roenteritis virus and porcine epidemic diar rhoea virus infection induces dramatic changes in the tight junctions and microf i laments of polarized IPEC-J2 cel ls[J]. Virus Res,2014,192∶34-45.

[22]Wang,Y.,Li,J.R.,Sun,M.X.,et al.Triggering unfolded protein response by 2-Deoxy-D-glucose inhibits porcine epidemic diarrhea virus propagation[J].Antiviral Res, 2014,106∶33-41.

[23]Olanratmanee,E.O.,Kunavongkrit,A.,Tummaruk,P.Impact of porcine epidemic diar rhea virus infection at dif ferent periods of pregnancy on subsequent reproductive per formance in gi l ts and sows[J].Anim Reprod Sci,2010, 122(1-2)∶42-51.

Establishmentand app lication of themethod ofmolecular diagnostic of porcine epidem ic diarrhea

Li Hai l i,Xu Yindi,Jiao Wenqiang,Zhu Wenhao,Wang Kel ing,Xu Zhaoxue
（Animal Husbandry and Veterinary Research Institute,Henan Academy of Agricul tural Sciences,Henan Zhengzhou 450002）

In order to study a method for the ear ly and rapid molecular diagnosis of porcine epidemic diarrhea,a pair of primers were designed according to the PED virus genome database sequences of S gene nucleotide sequence specif ic ampl i f ication,the expected expansion gene f ragment size was 200 bp.The resul ts show that the designed primers could ampl i fy the purpose gene, the ampl i f ication of gene f ragment size coincides with the expected,and high sensitivity,specificity and good repeatabil ity.Appl ied to the establ ished conditions and the method,total 9 bands were ampl if ied the purpose f rom16 col lected cl inical samples.This study provides a simple method for the cl inical diagnosis of PED,and used for the diagnosis and epidemiological survey of PED.

Porcine epidemic diar rhea virus;RT-PCR;Molecular diagnosis

S852.651

1672-9692(2015)08-0046-06

2015-06-05

李海利（1982-），男，博士，助理研究員，主要從事動(dòng)物傳染病臨床分子診斷及防控研究工作。

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院優(yōu)秀青年科技基金（2013YQ22）；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新科技基金。