趙中江 鄧 哲 孫冀武 劉德紅

（廣東省深圳市第二人民醫(yī)院，廣東 深圳 518035）

·研究報告·

痰熱清注射液對重癥急性胰腺炎大鼠肺損傷保護作用的初步研究*

趙中江 鄧 哲 孫冀武 劉德紅

（廣東省深圳市第二人民醫(yī)院，廣東 深圳 518035）

目的觀察痰熱清注射液對重癥急性胰腺炎大鼠肺損傷的保護作用。方法選擇96只健康SD大鼠隨機分為對照組、假手術(shù)組、模型組及痰熱清組，采用5%?；悄懰徕c逆行胰膽管注射法建立SAP大鼠模型，以建模后6、12 h及24 h，分為3個亞組（每組8只）。觀察肺損傷指數(shù)，分別采用酶聯(lián)免疫法、半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR法及蛋白印跡技術(shù)檢測不同時間點肺組織中RNA及高遷移率族蛋白水平。結(jié)果模型組較對照組和假手術(shù)在肺損傷指數(shù)、細胞間粘附分子-1（ICAM-1）、白介素-18（IL-18）、骨髓系細胞觸發(fā)受體（TREM-1）mRNA及高遷移率族蛋白-1（HMGB1）方面差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而痰熱清組治療后較模型組ICAM-1、IL-18、TREM-1 mRNA和HMGB1等水平有降低（P＜0.01），肺損傷指數(shù)明顯降低（P＜0.01）。結(jié)論痰熱清注射液能降低重癥急性胰腺炎大鼠肺組織中ICAM-1、IL-18、TREM-1 mRNA及高遷移率族蛋白B1水平的表達，有效緩解重癥急性胰腺炎大鼠的肺損傷。

痰熱清 重癥急性胰腺炎 肺損傷 大鼠

重癥急性胰腺炎（SAP）病情兇險，有多種并發(fā)癥，急性肺損傷是最嚴重的。早期預防和治療急性肺損傷（ALI）對降低SAP的病死率及改善疾病預后意義重大。痰熱清注射液能減輕炎性介質(zhì)所致的炎癥反應，減少多器官功能綜合征（MODS）的發(fā)生［1］。本實驗擬研究痰熱清注射液對SAP大鼠肺損傷指數(shù)、及不同時間點肺組織中細胞間粘附分子-1（ICAM-1）、白介素-18（IL-18）、骨髓系細胞觸發(fā)受體（TREM-1）mRNA及高遷移率族蛋白（HMGB1）水平的影響，探討痰熱清注射液對SAP肺損傷的保護作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 96只健康雄性SD大鼠，約2個月齡，體質(zhì)量150～180g，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 儀器和試劑 儀器DYCP-34A型瓊脂糖凝膠電泳儀（購自北京市六一儀器廠）。采用武漢生物制品研究所生產(chǎn)酶聯(lián)免疫吸附 （ELISA）測定肺組織形中ICAM-1、IL-18水平。采用半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測肺組織中TREM-1 mRNA。以β-actin作為內(nèi)參對照。引物由上海生物工程研究所合成。TREM-1的序列為：上游5′TGTGCGTGTTCTTTGTCT 3′，下游5′TGGTAA TAAG2GATGGGAC 3′，產(chǎn)物450 bp；β-actin的序列為：上游5′GGGACCTGACAGACTACCT 3′，下游5′ACAAAGTCCTCAGCCACA 3′，產(chǎn)物854 bp。使用Western blotting法檢測肺組織中HMGB1表達，用羊抗HMGBI多克隆抗體（Santa Cruz，濃度1∶400）4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG（深圳晶美，濃度1∶1000）。

1.3 分組與造模 5%?；悄懰徕c逆行胰膽管注射法建立SAP大鼠模型。隨機分為對照組、假手術(shù)組、模型組及痰熱清組，每組24只。將大鼠禁食12 h，自由飲水，稱體質(zhì)量，術(shù)野備皮，按1 mL/kg的劑量腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉溶液麻醉。麻醉成功后固定于手術(shù)臺，0.5%活力碘消毒，鋪無菌單。沿腹白線切開進腹，顯露十二指腸，辨認胰膽管及肝門部膽總管，用一小動脈夾阻閉胰膽管近肝門端。在十二指腸內(nèi)側(cè)可見胰腺呈片狀分布，顯露清楚胰管，近腸端以小動脈夾夾閉，用24 G頭皮針穿刺入胰管，以0.2 mL/min的速度緩慢注入5%?；悄懰徕c溶液，總量為1.5mL/kg，注畢10min后去除小動脈夾，觀察胰腺出現(xiàn)水腫伴出血灶后，說明動物模型已成功建立，退針，按摩穿刺孔1 min，創(chuàng)面封閉膠封閉穿刺孔。將腸管復位，逐層關(guān)腹。假手術(shù)組大鼠行開腹手術(shù)僅翻動腸管，然后關(guān)腹。術(shù)后禁食，自由飲水。正常對照組麻醉后即取材。各組按模型制備后6，12，24 h分成3個亞組，每組8只。

1.4 標本采集與檢測 1）肺損傷指數(shù)的測定。大鼠處死后解剖胸腔，剪斷兩側(cè)肋骨，充分暴露肺葉，自主支氣管灌入無菌生理鹽水，每次10 mL，共4次，收集灌洗液，以肺泡灌洗液內(nèi)蛋白含量/血清蛋白含量計算。2）肺組織中ICAM-1、IL-18水平測定。采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）測定。3）檢測肺組織中TREM-1 mRNA采用半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR法測定。以β-actin作為內(nèi)參對照。引物由上海生物工程研究所合成。TREM-1的序列為：上游5′TGTGCGTGTTCTTTGTCT 3′，下游5′TGGTAATAAG 2GATGGGAC 3′，產(chǎn)物450 bp。β-actin的序列為：上游5′GGGACCTGACAGACTACCT 3′，下游5′ACAAAGT CCTCAGCCACA 3′，產(chǎn)物854 bp。反應完成后取RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)掃描存盤，通過目的基因與內(nèi)參對照的積分吸光度比值表示mRNA相對表達量（目的基因相對表達量=目的基因條帶密度/β-actin基因條帶密度）。4）檢測肺組織中HMGB1表達。使用Western blotting法檢測。各時相點處死大鼠后，收集完整左肺葉于液氮中保存。取約0.2 g肺組織在冰浴下研碎后取蛋白提取液，12000 r/min離心20min，取中間上清液，再將提取的蛋白等量加樣，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜后的硝酸纖維素膜經(jīng)漂洗后用5%脫脂奶粉阻斷非特異性結(jié)合，然后用羊抗HMGBI多克隆抗體（Santa Cruz，濃度1∶400）4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG（深圳晶美，濃度1∶1000）37℃孵育1 h，ECL顯色，待特異性蛋白帶顏色深度達到要求后，終止顯色反應。X光膠片壓片感光，以圖像處理系統(tǒng)對膠片進行掃描，測定各條帶的光密度值作定量分析。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，比較各組大鼠在3個不同時間點檢測值的差異，組間比較采用單因素方差分析，兩組獨立比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組SAP大鼠肺損傷指數(shù)比較 見表1。分別于6、12 h及24 h檢測肺損傷指數(shù)，結(jié)果顯示對照組和假手術(shù)組分別于6、12 h及24 h無明顯差異 （P＞0.05），而與模型組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），痰熱清組與模型組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表1 各組SAP大鼠肺損傷指數(shù)比較（±s）

表1 各組SAP大鼠肺損傷指數(shù)比較（±s）

與模型組同期比較，*P＜0.01。

組別 n 造模后6 h 造模后1 2 h 造模后2 4 h對照組 2 4假手術(shù)組 2 4模型組 2 4 0 . 0 0 6 9 ± 0 . 0 0 2 4*0 . 0 0 6 5 ± 0 . 0 0 1 8*0 . 0 0 7 3 ± 0 . 0 0 3 1*0 . 0 0 7 1 ± 0 . 0 0 1 9*0 . 0 0 6 6 ± 0 . 0 0 2 3*0 . 0 0 6 9 ± 0 . 0 0 3 5*0 . 0 8 3 5 ± 0 . 0 1 2 4 0 . 0 9 3 5 ± 0 . 0 2 2 7 0 . 0 8 0 4 ± 0 . 0 1 2 9痰熱清組 2 4 0 . 0 2 5 1 ± 0 . 0 5 2*0 . 0 3 7 9 ± 0 . 0 2 8*0 . 0 3 4 5 ± 0 . 0 3 4*

表2 各組SAP大鼠ICAM-1及IL-18比較（±s）

表2 各組SAP大鼠ICAM-1及IL-18比較（±s）

組 別 時間 I C A M -1（p g / m L） I L -1 8（n g / m L）對照組 造模后6 h 0 . 2 8 ± 0 . 0 3*8 8 . 1 ± 2 3 . 4*（n = 2 4） 造模后1 2 h 0 . 2 9 ± 0 . 0 4*8 9 . 8 ± 2 2 . 5*造模后2 4 h 0 . 2 7 ± 0 . 0 6*8 7 . 6 ± 2 6 . 2*假手術(shù)組 造模后6 h 0 . 3 1 ± 0 . 0 5*9 3 . 4 ± 3 2 . 2*（n = 2 4） 造模后1 2 h 0 . 3 3 ± 0 . 0 3*9 9 . 7 ± 3 8 . 4*造模后2 4 h 0 . 3 6 ± 0 . 0 2*1 2 1 . 4 ± 3 9 . 6*模型組 造模后6 h 0 . 7 5 ± 0 . 2 1 3 7 8 . 8 ± 4 1 . 8（n = 2 4） 造模后1 2 h 0 . 8 2 ± 0 . 5 6 5 6 7 . 7 ± 4 6 . 7造模后2 4 h 0 . 9 8 ± 0 . 7 9 7 5 4 . 7 ± 4 2 . 4痰熱清組 造模后6 0 . 5 6 ± 0 . 1 8*3 1 2 . 8 ± 4 0 . 8*（n = 2 4） 造模后1 2 h 0 . 7 3 ± 0 . 3 2*4 6 8 . 7 ± 4 3 . 7*造模后2 4 h 0 . 8 5 ± 0 . 1 1*5 8 4 . 7 ± 4 9 . 5*

2.2 各組SAP大鼠炎癥介質(zhì)ICAM-1及IL-18不同時間點水平的比較 見表2。分別于6、12 h及24 h檢測各組ICAM-1及IL-18的水平，結(jié)果顯示對照組、假手術(shù)組分別于6、12 h及24 h時間點各組水平相當（P＞0.05），而與模型組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），痰熱清組較模型組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.3 各組SAP大鼠REM-1 mRNA表達比較 見表3。SAP大鼠REM-1 mRNA表達對照組和假手術(shù)組各時間點差別無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；模型組6、12、24 h時間點與對照組及假手術(shù)組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；而痰熱清組與模型組比較在6 h無差異（P＞0.05），12、24 h時間點差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3 各組SAP大鼠肺組織中TREM-1 mRNA表達比較（±s）

表3 各組SAP大鼠肺組織中TREM-1 mRNA表達比較（±s）

組別 n 造模后6 h 造模后1 2 h 造模后2 4 h對照組 2 4假手術(shù)組 2 4模型組 2 4 0 . 2 8 ± 0 . 0 4*0 . 2 7 ± 0 . 0 6*0 . 2 9 ± 0 . 0 5*0 . 2 9 ± 0 . 0 4*0 . 2 7 ± 0 . 0 5*0 . 2 9 ± 0 . 0 6*0 . 5 5 ± 0 . 0 9 0 . 6 3 ± 0 . 0 7 0 . 6 9 ± 0 . 0 7痰熱清組 2 4 0 . 4 8 ± 0 . 0 5 0 . 5 0 ± 0 . 0 2*0 . 5 1 ± 0 . 0 3*

2.4 痰熱清降低SAP大鼠HMGB1表達水平的比較見表4。用Western blotting法檢測6、12 h及24 h點各組HMGB1表達水平，結(jié)果顯示各組在6 h時間點差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；對照組、假手術(shù)組分別于12及24 h點與模型組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），痰熱清組在12 h及24 h時間點較模型組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表4 各組SAP大鼠HMGB1表達比較（±s）

表4 各組SAP大鼠HMGB1表達比較（±s）

組別 n 造模后6 h 造模后1 2 h 造模后2 4 h對照組 2 4假手術(shù)組 2 4模型組 2 4 0 . 2 3 ± 0 . 0 3 0 . 2 7 ± 0 . 0 4*0 . 2 3 ± 0 . 0 5*0 . 2 5 ± 0 . 0 4 0 . 2 4 ± 0 . 0 3*0 . 2 6 ± 0 . 0 5*0 . 2 9 ± 0 . 0 3 0 . 5 8 ± 0 . 2 1 0 . 7 3 ± 0 . 1 5痰熱清組 2 4 0 . 2 7 ± 0 . 0 9 0 . 4 0 ± 0 . 1 2*0 . 4 2 ± 0 . 1 4*

3 討 論

SAP病情兇險，病死率高，1周內(nèi)死亡者多由肺損傷所致。發(fā)病早期減少各種肺損傷具有非常突出的意義。SAP時由于眾多炎癥介質(zhì)和細胞因子的瀑布樣級聯(lián)反應，從而導致包括肺損傷在內(nèi)的多器官功能障礙。因此，抗炎療法成為SAP預防并發(fā)癥的主要突破口，然而臨床采取TNF-α和IL-1β等早期的炎癥介質(zhì)拮抗劑治療并未取得滿意效果，可能存在其他致炎因子介導了內(nèi)毒素的致死效應。

IL-18不僅使AP病情加重，還可以導致胰外臟器的損傷。Ueda等［2］的研究也發(fā)現(xiàn)，急性生理與慢性健康Ⅱ（APACHEⅡ）評分大于7的患者血清IL-18水平明顯高于APACHEⅡ評分小于7者。根據(jù)Rau等［3］報道，血清IL-18水平在AP早期開始增加，直到觀察后期，患者出現(xiàn)胰腺壞死和系統(tǒng)并發(fā)癥都一直維持著較高的水平。而且那些出現(xiàn)胰腺壞死和系統(tǒng)并發(fā)癥如肝、肺或腎衰竭等多器官功能衰竭的患者，其血清IL-18水平顯著升高。Zhang等［4］在大鼠SAP模型實驗中，運用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應技術(shù)觀察到SAP組大鼠肺組織內(nèi)的IL-18 mRNA顯著增多，而在用轉(zhuǎn)換酶抑制劑的治療組中大鼠肺內(nèi)IL-18表達明顯減少，推測肺內(nèi)IL-18產(chǎn)生過多在SAP時ALI過程中起著重要作用。

TREM-1是新近發(fā)現(xiàn)的一種有選擇性地表達于炎性細胞表面的跨膜受體，隸屬免疫球蛋白超家族［5］。實驗研究已經(jīng)證實，TREM-1能夠通過跨膜調(diào)節(jié)蛋白DAP12觸發(fā)中性粒細胞和單核細胞的炎癥反應，誘導炎癥因子的分泌和鈣離子的動員［6］。Adly等［7］發(fā)現(xiàn)升高的sTREM-1可作為新生兒膿毒癥早期標志物，反應膿毒癥嚴重程度和預后。Kamei等［8］檢測48例AP患者血清sTREM-1濃度，發(fā)現(xiàn)AP患者的sTREM-1水平較健康對照組明顯增高，且和APACHEⅡ評分呈正相關(guān)。本實驗中發(fā)現(xiàn)，痰熱清組TREM-1在12 h及24 h時間點明顯低于模型組，說明痰熱清注射液可能確實對預后具有明顯的作用。

HMGB1是一類廣泛存在于真核細胞內(nèi)的非組蛋白染色體蛋白。楊智勇等［9］發(fā)現(xiàn)SAP組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平在建模后迅速升高，約在4～6 h達高峰，之后迅速下降，在建模12 h即降至接近正常水平，一直維持至24和48 h。而HMGB1水平在建模后12 h開始有明顯升高，至24和48 h仍維持在較高水平。本實驗證實，HMGB1在模型組中隨時間而不斷增高。但在痰熱清組中，其增高幅度明顯下降，表明它確實與炎癥反應關(guān)系密切，同時也說明痰熱清注射液能通過降低其濃度起到緩解肺損傷的作用。本研究顯示，痰熱清注射液確實地降低了肺組織中 ICAM-1、IL-18、TREM-1mRNA及高遷移率族蛋白B1水平的表達，能有效緩解重癥急性胰腺炎大鼠的肺損傷。

［1］ 劉德紅，鄧哲，魏剛，等.痰熱清注射液對膿毒癥大鼠炎癥介質(zhì)及生存率的影響［J］.中國中醫(yī)急癥，2009，18（7），1127-1129.

［2］ Ueda T，Takeyama Y，Yasuda T，et al.Significant elevation of serum interleukin-18 levels in patients with acute pancreatitis［J］.J Gastroenterol，2006，41（2）：158-165.

［3］ Rau B，Baumgart K，Paszkowski AS，et al.Clinical relevance of caspase-1 activated cytokines in acute pancreatitis：high correlation of serum interleukin-18 with pancreatic necrosis and systemic complications［J］.Crit Care Med，2001，29（8）：1556-1562.

［4］ Zhang XH，Zhu RM，Xu WA，et al.Therapeutic effects of caspase-1 inhibitors on acute lung injury in experimental severe acute pancreatitis［J］.World J Gastroenterol，13（4）：623-627.

［5］ Colonna M.TREMs in the immune system and beyond［J］.Nat Rev Immunol，2003，3（6）：445-453.

［6］ Barati M，Bashar FR，Shahrami R，et al.Soluble triggering receptor expressed on myeloid cells 1 and the diagnosis of sepsis［J］.J Crit Care，2010，25（2）：362-366.

［7］ Adly AA，Ismail EA，Andrawes NG，et al.Circulating soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1（sTREM-1）as diagnostic and prognostic marker in neonatal sepsis［J］. Cytokine，2014，65（2）：184-191.

［8］ Kamei K，Yasuda T，Ueda T，et al.Role of triggering receptor expressed on myeloid cells-1 in experimental severe acute pancreatitis［J］.J Hepatobiliary Pancreat Sci，2010，17（3）：305-312.

［9］ 楊智勇，王春友，熊烱圻.重癥急性胰腺炎大鼠血清高遷移率族蛋白-1水平的時相變化及意義［J］.華中科技大學學報：醫(yī)學版，2004，33（4）：466-468.

The Preliminary Reseach on the Protective Effect of Tanreqing Injection on Pulmonary Injury by Severe Acute Pancreatitis in Rats

ZHAO Zhongjiang，DENG Zhe，SUN Jiwu，et al. The Second People Hosoital of Shenzhen City in Guangdong Province，Guangdong，Shenzhen 518035，China

Objective：To observe the protective effect of Tanreqing Injection on pulmonary injury by severe acute pancreatitis in rats.Methods：96 healthy SD rats were randomly divided into control group，sham operation group，model group and Tanreqing group，5%sodium taurocholate retrograde cholangiopancreatography injection rat model was established by SAP to modeling after 6 h，12 h and 24 h，divided into three sub-groups（n=8）.Indicators of lung injury，and lung tissue ICAM-1，IL-18，TREM-1mRNA were observed and high mobility group protein B1 level was detected by enzyme-linked immunosorbent assay，semi-quantitative RT-PCR and Western blot at different time points respectively.Results：The lung injury index，ICAM-1，IL-18 TREM-1mRNA and HMGB1 of the model group had significant differences from the control group and sham operation group（P＜0.01），but after Tanreqing treatment group compared with the model group，IL-18，TREM-1mRNA and HMGB1 levels were lower（P＜0.01），Pulmonary injury parameters were significantly lower（P＜0.01）.Conclusion：Tanreqing can decrease the expression of the ICAM-1，IL-18，TREM-1mRNA and high mobility group protein B1 in severe acute pancreatitis rats，and effectively alleviate lung injury in rats with the severe acute pancreatitis.

Severe acute pancreatitis；Tanreqing；Pulmonary injury；Rats

R576

A

1004-745X（2015）04-0604-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.04.013

2014-01-10）

廣東省深圳市科技計劃項目（201202036）