秦彥強(qiáng)孫忠人張亞娟魏慶雙姜 凡劉尚策

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱，150040；2.黑龍江省哈爾濱市第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150056）

·研究報(bào)告·

針刺預(yù)處理對(duì)腦梗死大鼠細(xì)胞凋亡及炎性因子的影響*

秦彥強(qiáng)1，2孫忠人1△張亞娟2魏慶雙1姜 凡1劉尚策1

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱，150040；2.黑龍江省哈爾濱市第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150056）

目的探討針刺預(yù)處理對(duì)腦梗死大鼠細(xì)胞凋亡及炎性因子的影響。方法采用改良Zea Longa方法制備大腦中動(dòng)脈閉塞腦梗死（MCAO）模型，將90只大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、腦梗死組、缺血預(yù)處理組、針刺預(yù)處理組5組各18只，每組均分為1、3、7 d 3個(gè)亞組各6只。正常組不予特殊處理；假手術(shù)組只切開(kāi)皮膚，暴露頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)外動(dòng)脈，不插入線栓；腦梗死組采用改良Zea Longa方法制備MCAO模型；缺血預(yù)處理組于造模前24 h于頸外動(dòng)脈插入自制線栓，栓塞大腦中動(dòng)脈后，間斷缺血30 min；針刺預(yù)處理組于造模前針刺大鼠雙側(cè)風(fēng)池穴，連續(xù)7 d。各組分別于處死前4 h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Realtime PCR和ELISA法分析腦組織TNF-α、IL-1β。結(jié)果腦梗死組、缺血預(yù)處理組、針刺預(yù)處理組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、TUNEL法陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)、TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)水平和含量均高于正常組和假手術(shù)組 （均P＜0.05）。缺血預(yù)處理組、針刺預(yù)處理組1 d時(shí)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分與腦梗死組差別不大（P＞0.05），而兩組在3、7 d時(shí)，大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均低于腦梗死組（P＜0.05或P＜0.01）。缺血預(yù)處理組與針刺預(yù)處理組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分差別不大（P＞0.05）。正常組和假手術(shù)組可見(jiàn)少量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，梗死組、缺血預(yù)處理組和針刺預(yù)處理1 d時(shí)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均較多，3 d時(shí)開(kāi)始下降。而缺血預(yù)處理組、針刺預(yù)處理組3 d時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，少于梗死組。腦梗死組、缺血預(yù)處理組、針刺預(yù)處理組1、3、7 d時(shí)，TUNEL法陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)均高于正常組和假手術(shù)組（均P＜0.05）。缺血預(yù)處理組、針刺預(yù)處理組1 d時(shí)TUNEL法陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)與腦梗死組差別不大（P＞0.05），而在兩組3、7 d時(shí)，TUNEL法陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)均低于腦梗死組（P＜0.01或P＜0.01）。缺血預(yù)處理組與針刺預(yù)處理組TUNEL法陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)1、3、7 d時(shí)差別不大（均P＞0.05）。腦梗死組、缺血預(yù)處理組、針刺預(yù)處理組1、3、7 d時(shí)的TNF-α、IL-1β mRNA水平和含量均高于正常組和假手術(shù)組（均P＜0.05）。缺血預(yù)處理組、針刺預(yù)處理組1、3、7 d時(shí)，TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)水平和含量均低于腦梗死組 （P＜0.05或P＜0.01）。缺血預(yù)處理組與針刺預(yù)處理組1、3、7 d時(shí)，TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)水平和含量則差別不大（均P＞0.05）。結(jié)論腦梗死后，梗死灶邊緣神經(jīng)細(xì)胞凋亡，TNF-α mRNA、IL-1β mRNA表達(dá)上升，炎性因子TNF-α、IL-1β增多。針刺風(fēng)池穴預(yù)處理，可以抑制神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡，減少炎性因子TNF-α mRNA、IL-1βmRNA表達(dá)，降低TNF-α、IL-1β含量，減輕腦梗死炎性反應(yīng)，改善腦梗死大鼠模型神經(jīng)功能。

腦梗死 針刺 預(yù)處理 細(xì)胞凋亡 炎性因子

隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)，腦血管疾病逐漸成為目前我國(guó)三大致死性疾病之一［1］，而在腦血管疾病中，腦血栓形成占1/3。由于中樞神經(jīng)元損傷的不可逆性，該病往往形成殘疾，重則危及生命。因此，積極開(kāi)展腦梗死預(yù)防工作，對(duì)降低缺血性腦血管疾病尤其腦梗死的發(fā)病率、致殘率和致死率等顯得尤為重要。而缺血耐受現(xiàn)象的提出，為腦梗死預(yù)防性治療提供了廣闊的思路，也提出了多種預(yù)處理方式。

在臨床中，針刺風(fēng)池穴可以改善腦供血不足所引發(fā)的各種癥狀，包括眩暈、一過(guò)性黑蒙等，尤其對(duì)椎-基底動(dòng)脈系統(tǒng)TIA具有良好改善作用。有研究表明TIA可誘發(fā)腦缺血耐受，且有學(xué)者證實(shí)針刺“風(fēng)池穴”，對(duì)椎-基底動(dòng)脈系統(tǒng)血流速度具有“雙相、良性”調(diào)節(jié)作用［2］。筆者在臨床中總結(jié)發(fā)現(xiàn)，發(fā)生腦血栓形成性腦梗死采用針刺風(fēng)池穴治療者，其病灶面積通常較小，且經(jīng)康復(fù)訓(xùn)練后，后遺癥較少。因此，針刺風(fēng)池穴可能存在激活大腦的缺血耐受現(xiàn)象。筆者通過(guò)針刺風(fēng)池穴預(yù)處理對(duì)腦梗死大鼠模型，觀察其對(duì)腦梗死大鼠模型細(xì)胞凋亡的影響，探討其誘導(dǎo)腦缺血耐受的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康成年SD雄性大鼠90只，體質(zhì)量（330±10）g，合格證號(hào)為黑201402415，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑與儀器 TUNEL測(cè)試試劑盒：美國(guó)Roche公司 （批號(hào)11772465001）。DBA工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。TriZol：美國(guó)Invitrogen公司（批號(hào)15596018）。DEPC：美國(guó)Sigma公司 （批號(hào)20130952）。RNAisoReagent、SybrGreen Taq、cDNA Synthesis Kit購(gòu)自大連 TaKaRa公司。TransScriptTM One-Step RT-PCR SuperMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。TNF-α、IL-1β及βactin mRNA引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。TNF-α、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒：伊萊瑞特生物科技有限公司（批號(hào)E-EL-R0019c）。酶標(biāo)儀（450nm波長(zhǎng)濾光片）：北京博儀恒業(yè)科技發(fā)展有限公司。光學(xué)顯微鏡（MCL-300）：美佳朗。電熱恒溫箱（DHP-9052）：上海一恒公司。華佗牌針灸針（0.25mm×25mm）：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司。高精度移液器（WKYⅢ-5）：上海佳安分析儀器廠。熒光定量PCR儀（ABI-7500）：美國(guó)ABI公司。

1.3 分組與造模 采用隨機(jī)數(shù)字表法，將大鼠隨機(jī)分為正常組18只，假手術(shù)組18只，腦梗死組18只，缺血預(yù)處理組18只，針刺預(yù)處理組18只5組，每組均分1、3、7 d 3個(gè)亞組各6只。正常組同步喂養(yǎng)，無(wú)任何處理；假手術(shù)組只切開(kāi)皮膚，暴露勁總動(dòng)脈、頸內(nèi)外動(dòng)脈，不插入線栓，術(shù)后縫合皮膚。腦梗死組采用改良Zea Longa［3］方法制備大鼠模型；缺血預(yù)處理組于造模前24 h于頸外動(dòng)脈插入自制線栓，栓塞大腦中動(dòng)脈后，間斷缺血30 min；針刺預(yù)處理組于造模前針刺大鼠雙側(cè)風(fēng)池穴，連續(xù)7 d。具體方法1）大鼠腦梗死動(dòng)物模型制備方法：大鼠造模前6 h禁食，10%水合氯醛腹腔麻醉，于頸部距正中線右側(cè)0.5 cm切開(kāi)頸部皮膚，剝離至暴露勁總動(dòng)脈、頸內(nèi)外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈及勁總動(dòng)脈近段，血管夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，于頸總動(dòng)脈剪一小口，插入備好線栓，固定，松開(kāi)動(dòng)脈夾，將線栓送入經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈至大腦前動(dòng)脈，至送入出現(xiàn)阻力，栓塞大腦中動(dòng)脈，制備左側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞腦梗死模型。2）缺血預(yù)處理方法：大鼠麻醉，經(jīng)頸外動(dòng)脈插入自制線栓，栓塞大腦中動(dòng)脈后，間斷缺血30 min（3次10 min，每個(gè)10 min后將線栓退至頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)恢復(fù)血流10 min），術(shù)后拔出線栓，結(jié)扎頸外動(dòng)脈殘端。常規(guī)飼養(yǎng)24 h后，采用改良Zea Longa法制備大鼠腦梗死模型。3）針刺方法：針刺大鼠雙側(cè)風(fēng)池穴，每日針刺l次，每次30 min。連續(xù)針刺7 d。針刺結(jié)束后行MCAO動(dòng)物模型制備。

1.4 觀察指標(biāo) 1）神經(jīng)功能評(píng)分：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清醒后，自由飲食，各組于取材前4 h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。采用Longar 5分制標(biāo)準(zhǔn)。0分：無(wú)神經(jīng)功能缺損，動(dòng)物行為正常。1分：提尾時(shí)左前肢內(nèi)收，不能完全伸展。2分：自發(fā)行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈。3分：行走時(shí)身體向左側(cè)傾倒。4分：不能自發(fā)行走，或昏迷。2）細(xì)胞凋亡：采用TUNEL法檢測(cè)。各組大鼠于取材前6 h禁食水，4%多聚甲醛溶液200 mL，0.9%氯化鈉200 mL灌注取腦；石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；滴加胃蛋白酶K（20 μg/mL溶于10 mM的Tris/HCL中，pH值7.4~8.0）室溫孵育30 min，PBS沖洗2次；標(biāo)記，擦干樣品周圍的水，滴加50 μL的Tunel反應(yīng)混合液，在濕盒中37℃孵育60 min，PBS沖洗3次；信號(hào)轉(zhuǎn)化和分析，擦干樣品周圍的水分，加入50 μL的轉(zhuǎn)化劑-POD，在濕盒中37℃孵育30 min，PBS沖洗3次；顯色，滴加顯色劑DAB，室溫下10 min，蒸餾水充分沖洗；蘇木素復(fù)染1 min；常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。應(yīng)用Motic Med 6.0病理圖像分析系統(tǒng)，每張片隨機(jī)觀察并計(jì)數(shù)腦損傷邊5個(gè)不重復(fù)視野，在400倍鏡視野下計(jì)數(shù)腦損傷區(qū)周圍組織中TUNEL陽(yáng)性的細(xì)胞。取平均值作為每個(gè)標(biāo)本平均每高倍視野內(nèi)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù) （個(gè)/HP）。3）TNF-α、IL-1β mRNA的表達(dá)：采用Real-time PCR檢測(cè)。樣本RNA提取，每組大鼠腦組織，用液氮研磨成粉末，加入1 mL的TRIZOL試劑，混勻，室溫靜置5 min，提取總RNA；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，2 μg RNA按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，42℃30 min，85℃5 min。PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，按SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL；PCR Forward Primer（10 μM）0.5 μL；PCR Reverse Primer（10 μM）0.5 μL；DNA模板1.0 μL；dH2O（滅菌蒸餾水）10.5 μL分別配制Real-time PCR反應(yīng)體系。各樣品目的mRNA和內(nèi)參 （GAPDH）分別進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。PCR儀中制備合格標(biāo)準(zhǔn)品（溶解曲線的吸收峰單一的PCR產(chǎn)物者）。β-actin基因表達(dá)作為內(nèi)參，分別采集TNF-α、IL-1β、β-actin擴(kuò)增各循環(huán)熒光信號(hào)。 Rotor-Gene 6.0版軟件收集循環(huán)閾值（CT值），目的基因相對(duì)mRNA表達(dá)水平計(jì)算按照公式：目的基因相對(duì)mRNA表達(dá)=2-△△CT。4）腦組織中TNF-α、IL-1β含量：采用ELISA檢測(cè)。各組大鼠取梗死邊緣腦組織5 mg，液氮保存待用。按照大鼠酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒提供說(shuō)明書步驟測(cè)定組織TNF-α、IL-1β的含量。

表1 Real-time PCR基因引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示。多個(gè)樣本間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分比較 見(jiàn)表2。腦梗死組、缺血預(yù)處理組、針刺預(yù)處理組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均高于正常組和假手術(shù)組（均P＜0.05）。缺血預(yù)處理組、針刺預(yù)處理組1 d時(shí)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分與腦梗死組差別不大（P＞0.05），而在兩組3、7 d時(shí)，大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均低于腦梗死組（P＜0.05或P＜0.01）。缺血預(yù)處理組與針刺預(yù)處理組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分差別不大 （P＞ 0.05）。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分比較（分，±s）

表2 各組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分比較（分，±s）

與正常組、假手術(shù)比較，*P＜0.05；與腦梗死組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別n 7 d正常組 1 8 0 . 0 0 ± 0 . 0 0假手術(shù)組 1 8 0 . 0 0 ± 0 . 0 0腦梗死組 1 8 1 . 6 3 ± 0 . 5 2*1 d 3 d 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 2 . 6 3 ± 0 . 7 4*2 . 3 8 ± 0 . 5 2*缺血預(yù)處理組 1 8 0 . 7 5 ± 0 . 7 1*△△2 . 7 5 ± 0 . 7 1*1 . 5 0 ± 0 . 5 4*△針刺預(yù)處理組 1 8 2 . 5 0 ± 0 . 9 3*1 . 3 8 ± 0 . 5 2*△0 . 8 8 ± 0 . 9 9*△△

2.2 各組細(xì)胞凋亡情況比較 見(jiàn)圖1～4，表3。正常組和假手術(shù)組可見(jiàn)少量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞 （圖1），梗死組、缺血預(yù)處理組和針刺預(yù)處理1 d時(shí)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均較多，3 d時(shí)開(kāi)始下降。而缺血預(yù)處理組（圖2）、針刺預(yù)處理組（圖3）3 d時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，少于梗死組（圖4）。腦梗死組、缺血預(yù)處理組、針刺預(yù)處理組1、3、7 d時(shí)，TUNEL法陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)均高于正常組和假手術(shù)組（均P＜0.05）。缺血預(yù)處理組、針刺預(yù)處理組1 d時(shí)TUNEL法陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)與腦梗死組差別不大（P＞0.05），而在兩組3、7 d時(shí)，TUNEL法陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)均低于腦梗死組（P＜0.05或P＜0.01）。缺血預(yù)處理組與針刺預(yù)處理組TUNEL法陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)1、3、7 d時(shí)差別不大（均P＞0.05）。

圖1 正常組（×400）

圖2 缺血預(yù)處理3d組（×400）

圖3 針刺預(yù)處理3 d組（×400）

圖4 腦梗死3 d組（×400）

表3 各組TUNEL法染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（±s）

表3 各組TUNEL法染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（±s）

組別n 7 d正常組 1 8 1 0 . 1 8 ± 1 . 9 5假手術(shù)組 1 8 1 2 . 5 4 ± 2 . 0 1腦梗死組 1 8 2 7 . 3 8 ± 3 . 2 5*1 d 3 d 1 0 . 1 3 ± 2 . 1 1 1 1 . 2 1 ± 2 . 5 4 1 3 . 4 1 ± 3 . 1 4 1 2 . 5 4 ± 3 . 6 5 3 5 . 0 0 ± 5 . 1 5*3 0 . 1 3 ± 4 . 5 2*缺血預(yù)處理組 1 8 1 8 . 5 4 ± 5 . 2 1*△△3 4 . 8 5 ± 4 . 9 6*2 4 . 6 2 ± 5 . 6 2*△針刺預(yù)處理組 1 8 3 6 . 2 3 ± 6 . 3 0*2 5 . 2 0 ± 5 . 7 3*△1 9 . 5 0 ± 3 . 7 7*△△

2.3 各組TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表4。腦梗死組、缺血預(yù)處理組、針刺預(yù)處理組1、3、7 d時(shí)，TNF-α、IL-1β mRNA水平均高于正常組和假手術(shù)組（均P＜0.05）。缺血預(yù)處理組、針刺預(yù)處理組1、3、7 d時(shí)，TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)水平均低于腦梗死組（P＜0.05或P＜0.01）。缺血預(yù)處理組與針刺預(yù)處理組1、3、7 d時(shí)，TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)水平則差別不大（均P＞0.05）。

表4 各組TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)比較（ng/mL，±s）

表4 各組TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)比較（ng/mL，±s）

組別 n T N F -α I L -1 β 1 d 3 d 7 d 1 d 3 d 7 d正常組 1 8假手術(shù)組 1 8腦梗死組 1 8缺血預(yù)處理組 1 8針刺預(yù)處理組 1 8 2 . 3 5 ± 0 . 2 5 2 . 6 3 ± 0 . 3 7 1 . 9 5 ± 0 . 6 8 1 . 2 5 ± 0 . 3 5 1 . 7 4 ± 0 . 1 7 2 . 6 2 ± 0 . 5 1 2 . 6 2 ± 0 . 6 5 2 . 3 6 ± 0 . 6 5 1 . 4 7 ± 0 . 4 1 1 . 5 0 ± 0 . 3 5 1 9 . 5 2 ± 4 . 3 2*2 3 . 4 2 ± 5 . 6 2*7 . 8 5 ± 2 . 2 9*1 0 . 5 3 ± 2 . 7 4*1 2 . 3 8 ± 3 . 0 2*1 . 3 8 ± 0 . 8 1 1 . 5 2 ± 0 . 0 5 5 . 4 7 ± 1 . 0 1*1 4 . 2 5 ± 3 . 6 2*△△1 5 . 5 2 ± 4 . 6 2*△△4 . 5 2 ± 2 . 1 0*△6 . 5 2 ± 2 . 0 1*△△7 . 5 2 ± 2 . 2 4*△△1 3 . 8 5 ± 4 . 0 5*△△1 4 . 9 6 ± 4 . 7 5*△△4 . 3 7 ± 1 . 9 5*△5 . 9 8 ± 1 . 8 1*△△6 . 9 4 ± 2 . 1 4*△△2 . 4 5 ± 0 . 5 8*△2 . 0 3 ± 0 . 2 5*△

2.4 各組ELISA法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)TNF-α、IL-1β的含量比較 見(jiàn)表5。腦梗死組、缺血預(yù)處理組、針刺預(yù)處理組1、3、7 d時(shí)，TNF-α、IL-1β含量均高于正常組和假手術(shù)組（均P＜0.05）。缺血預(yù)處理組、針刺預(yù)處理組1、3、7 d時(shí)，TNF-α、IL-1β含量均低于腦梗死組（P＜0.05或P＜0.01）。缺血預(yù)處理組與針刺預(yù)處理組1、3、7 d時(shí)，TNF-α、IL-1β含量則差別不大 （均P＞0.05）。

表5 各組ELISA法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)TNF-α、IL-1β的含量比較（ng/mL，±s）

表5 各組ELISA法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)TNF-α、IL-1β的含量比較（ng/mL，±s）

組別 n T N F -α I L -1 β 1 d 3 d 7 d 1 d 3 d 7 d正常組 1 8假手術(shù)組 1 8腦梗死組 1 8缺血預(yù)處理組 1 8針刺預(yù)處理組 1 8 6 . 8 2 ± 1 . 2 4 7 . 2 7 ± 1 . 5 1 6 . 5 8 ± 1 . 4 1 4 . 2 8 ± 0 . 3 5 4 . 1 4 ± 1 . 6 1 7 . 5 3 ± 1 . 8 4 7 . 5 0 ± 1 . 4 5 6 . 5 1 ± 1 . 0 7 4 . 6 2 ± 0 . 4 1 4 . 5 3 ± 2 . 7 4 2 2 . 5 2 ± 2 . 3 4*1 6 . 3 2 ± 2 . 5 2*1 0 . 6 8 ± 1 . 9 5*1 8 . 4 2 ± 6 . 2 5*1 1 . 0 5 ± 4 . 1 2*3 . 3 8 ± 1 . 2 1 4 . 5 0 ± 1 . 8 5 7 . 3 2 ± 2 . 0 5*1 6 . 3 2 ± 2 . 0 6*△△1 1 . 5 2 ± 1 . 3 4*△9 . 5 4 ± 1 . 0 1*△1 5 . 5 2 ± 4 . 7 1*△△9 . 4 5 ± 3 . 4 1*△1 7 . 0 8 ± 2 . 1 4*△△1 2 . 2 4 ± 2 . 0 4*△1 0 . 3 7 ± 2 . 2 1*△1 4 . 9 2 ± 3 . 4 7*△△9 . 0 8 ± 3 . 5 2*△4 . 8 2 ± 1 . 4 9*△4 . 4 4 ± 1 . 8 1*△

3 討 論

《黃帝內(nèi)經(jīng)》提倡“不治已病治未病”，“未病”并非是沒(méi)有病，一般定義為體內(nèi)已有病因存在但尚未致病的人體狀態(tài)。此與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的預(yù)處理理念相似，故發(fā)掘治未病手段誘導(dǎo)腦缺血耐受存在現(xiàn)實(shí)意義。

缺血性腦血管疾病是一組以動(dòng)脈硬化為基礎(chǔ)，以腦組織發(fā)生缺血缺氧性損傷為主要病理改變的疾病。在損傷早期，往往是多種機(jī)制共同參與疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。局部炎癥反應(yīng)往往在早期就激活［4-5］，小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、免疫細(xì)胞等升高，激活一系列炎癥轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，產(chǎn)生并釋放炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等。缺血性腦損傷后血腦屏障破壞，通透性增加，從而引起腦水腫及一些繼發(fā)損傷［6］；大量的活性氧自由基（ROS）產(chǎn)生［7］，介導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)可以損傷神經(jīng)細(xì)胞膜和細(xì)胞器，使神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生腫脹、變性甚至壞死。同時(shí)尚伴有興奮性氨基酸毒性反應(yīng)［8］、細(xì)胞內(nèi)鈣超載［9］等，最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生壞死和凋亡［10］。

Kitagawa等［11］于1990年報(bào)導(dǎo)在沙土鼠大腦內(nèi)存在缺血耐受現(xiàn)象。缺血耐受現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為腦梗死的防治提供了新的思路和新途徑。但是缺血預(yù)處理方法臨床實(shí)現(xiàn)困難，是否還存在其他預(yù)處理手段可以誘導(dǎo)腦缺血耐受呢，有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)針刺預(yù)處理也可誘導(dǎo)腦缺血耐受，從而對(duì)腦組織起保護(hù)作用［12-13］，但研究報(bào)道針刺預(yù)處理選用腧穴不一。在臨床中我們發(fā)現(xiàn)風(fēng)池穴具有治療病種多樣性，療效顯著性、針刺時(shí)患者痛苦小等特點(diǎn)，并在前期臨床研究中證實(shí)具有腦保護(hù)作用，但其具體作用機(jī)制尚待挖掘。

《銅人腧穴針灸圖經(jīng)》指出風(fēng)池主“目眩，苦頭痛，頸項(xiàng)痛不得回顧，目淚出，欠氣多”。風(fēng)池穴位于斜方肌兩側(cè)與胸鎖乳突肌上端匯合處，上項(xiàng)線直下凹陷處發(fā)際內(nèi)，其與頸交感神經(jīng)聯(lián)系密切。研究發(fā)現(xiàn)，針刺風(fēng)池穴可以調(diào)節(jié)椎基底動(dòng)脈血流［14］，臨床中我們也發(fā)現(xiàn)，針刺風(fēng)池穴可以改善腦供血、腦血流，治療因腦供血不足引起的眩暈，也可以起到降低交感神經(jīng)緊張度，興奮迷走神經(jīng)，誘導(dǎo)膽堿能抗炎通路發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用。細(xì)胞凋亡是腦損傷后神經(jīng)組織細(xì)胞發(fā)生的一系列生物學(xué)特征的改變，在缺血性腦損傷早期，各組炎癥因子作用下，缺血區(qū)腦組織發(fā)生大量細(xì)胞凋亡，是繼發(fā)性腦損傷的病理生理過(guò)程［15］。TUNEL法可以對(duì)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，并能夠準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)及形態(tài)學(xué)改變。腦梗死后各種促炎因子、抗炎因子均參與了其發(fā)生發(fā)展過(guò)程。腫瘤壞死因子是一種由單核細(xì)胞分泌的，在炎癥反應(yīng)中處于最先激活細(xì)胞因子之一，參與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程。IL-1β是一種重要的炎性因子，炎性反應(yīng)發(fā)生時(shí)，可進(jìn)一步激活中性粒細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞，形成級(jí)聯(lián)式瀑布反應(yīng)，并最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和凋亡。

本研究結(jié)果示，針刺預(yù)處理和缺血預(yù)處理均能夠?qū)崿F(xiàn)早期改善恢復(fù)腦梗死后神經(jīng)功能、抗細(xì)胞凋亡作用。腦梗死組、缺血預(yù)處理組和針刺預(yù)處理組于缺血損傷后1 d出現(xiàn)TNF-α mRNA、IL-1β mRNA表達(dá)升高，腦組織中TNF-α、IL-1β含量亦增高，并且達(dá)峰值，3 d時(shí)開(kāi)始逐漸下落，與文獻(xiàn)報(bào)道趨勢(shì)一致［16］，缺血預(yù)處理和針刺預(yù)處理均可抑制炎性因子TNF-α mRNA、IL-1β mRNA表達(dá)，減輕腦梗死炎性反應(yīng)。綜上所述，針刺風(fēng)池穴預(yù)處理，可以改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能，抑制神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡，減少炎性因子TNF-α mRNA、IL-1β mRNA表達(dá)，從而減輕腦梗死炎性反應(yīng)，可能是其誘導(dǎo)腦缺血耐受的作用機(jī)制之一。

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Effect of Acupuncture Preconditioning on Apotosis and Inflammatory Factors of ischemic cerebral

QIN Yanqiang，SUN zhongren，ZHANG Yajuan，et al. Heilongjiang University Of Chinese Medicine，Heilongjiang，Harbin 150040，China

【Asbstract】Objective：To observe the effect of acupuncture preconditioning on the apoptosis and inflammatory factors of ischemic cerebral apoplexy.Methods：90 adult male SD rats were randomly divided into 5 groups：normal group，Sham group，cerebral infarction group，ischemic preconditioning group，acupuncture，preconditioning group，with 18 rats in each group.Each group was divided into one day，three days，seven days group，with 6 rats in each group.Middle cerebral artery occlusion（MCAO）model was prepared using the modified Zea Longa，all of the rats of acupuncture preconditioning group pinprick"Feng Chi Acupoints"before the MCAO model preparedconsecutive 7 days.The neurological score were detected 4 hours ago in each group when rats were sacrificed. Cells apoptosis was detected by TUNEL，and Real-time PCR and ELISA method were used to analyze tissue TNF-α beta，IL-1.Results：The method of the Acupuncture preconditioning could improve the neurological score，there were differences between the two group（P＜0.05）；It also can reduce the cell's apoptosis（P＜0.05），decrease the expression of TNF-αmRNA，IL-1β mRNA of brain（P＜0.05），reduce the content of the TNF-α and IL-1β（P＜0.05）.Conclusions：The method of acupuncture preconditioning can improve neurological in rats of cerebral，its also can inhibit neuronal apoptosis and decrease the expression of TNF-α mRNA，IL-1βmRNA，reduce the inflammatory response.

Acupuncture；Preconditioning；Cerebral；Apoptosis；Inflammatory Factors

R285.5

A

1004-745X（2015）04-0565-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.04.001

2015-02-08）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30873298）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)“優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計(jì)劃”科研項(xiàng)目（領(lǐng)軍人才類）（2012RCL01）

△通信作者（電子郵箱：szr006@163.com）