劉曉潔，沈兆兵，劉 莉*，史吉平3,*

（1.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院，上海201210；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049；3.上?？萍即髮W(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海201210）

滲透汽化原位分離耦合拜氏梭菌丁醇發(fā)酵的研究

劉曉潔1,2，沈兆兵1,2，劉 莉1,*，史吉平1,3,*

（1.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院，上海201210；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049；3.上?？萍即髮W(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海201210）

以篩選得到的聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）-聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）復(fù)合膜為分離用膜，開(kāi)展了拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）ZL01丁醇發(fā)酵與滲透汽化原位分離耦合的研究，結(jié)果表明：分批發(fā)酵-滲透汽化原位分離耦合與分批發(fā)酵相比，初始葡萄糖質(zhì)量濃度從50 g/L提高至90 g/L；在90 g/L的初始葡萄糖質(zhì)量濃度下，發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液和滲透液中的丁醇總產(chǎn)量從13.2 g/L提高到16.9 g/L，總?cè)軇ū╝cetone）、丁醇（butanol）、乙醇（ethanol），簡(jiǎn)稱ABE）產(chǎn)量從17.8 g/L提高到24.3 g/L，葡萄糖利用率從59.4%提高到95.7%。另外，分離過(guò)程中膜的總滲透通量平均為705 g/（m2·h），丁醇分離因子平均為19.0；經(jīng)滲透汽化分離，滲透液可直接進(jìn)入下一步蒸餾階段，其中丁醇和總?cè)軇〢BE質(zhì)量濃度分別為178 g/L和292 g/L，與分批發(fā)酵工藝中發(fā)酵液直接進(jìn)入蒸餾塔相比，丁醇和總?cè)軇〢BE質(zhì)量濃度分別提高了10.9倍和14.1倍，可大大降低蒸餾能耗。

丁醇；滲透汽化；原位分離；拜氏梭菌；發(fā)酵

丁醇作為一種優(yōu)良的有機(jī)溶劑和重要的化工原料，廣泛應(yīng)用于化工、食品、塑料、有機(jī)合成、油漆等工業(yè)[1-2]，同時(shí)丁醇也是一種非常有潛力的車用液體燃料[1]。目前丁醇的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)法和生物法，生物法生產(chǎn)丁醇早在一戰(zhàn)期間是僅次于乙醇的第二大發(fā)酵工業(yè)[3]。后來(lái)因石化工業(yè)迅猛發(fā)展，化學(xué)法替代了丁醇的生物發(fā)酵法生產(chǎn)。20世紀(jì)末，隨著石油資源的日趨減少和全球環(huán)境污染問(wèn)題的日益嚴(yán)重，可持續(xù)發(fā)展受到越來(lái)越多的關(guān)注，由于生物法可以利用可再生的生物質(zhì)資源，而且生物丁醇作為液體燃料不會(huì)產(chǎn)生NOX和硫化物等引發(fā)大氣污染的物質(zhì)，因此生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇技術(shù)又重新受到重視[4]。

生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇，產(chǎn)品除丁醇（butanol）外還含有丙酮（acetone）、乙醇（ethanol）等副產(chǎn)物，因此簡(jiǎn)稱為ABE發(fā)酵。發(fā)酵所用菌種多為丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）等，以玉米、木薯等淀粉質(zhì)原料或者秸稈、玉米芯等木質(zhì)纖維素原料，在厭氧條件下發(fā)酵得到丁醇等產(chǎn)物[5-7]。但是發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)物丁醇對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生抑制，使得發(fā)酵液中總?cè)軇〢BE質(zhì)量濃度一般維持在23 g/L以下，其中丁醇一般不超過(guò)13 g/L[8]。發(fā)酵液中丁醇質(zhì)量濃度低導(dǎo)致工業(yè)分離提取成本高。為了減弱產(chǎn)物抑制，提高產(chǎn)量，降低成本，解決方法主要有：1）采用基因工程等生物技術(shù)手段對(duì)菌種進(jìn)行改造，獲得耐丁醇的高產(chǎn)菌株；2）采用有效的分離技術(shù)與發(fā)酵工藝耦合，及時(shí)移除丁醇，減弱產(chǎn)物抑制。研究較多的分離提取方法有液-液萃取[9]、氣提[10-11]、吸附[12]、精餾[13]和滲透汽化[14-17]等。滲透汽化是一種節(jié)能有效的新型膜分離技術(shù)，操作簡(jiǎn)單、選擇性高、能耗較低[18]，與發(fā)酵耦合時(shí)對(duì)菌體沒(méi)有危害[19]，因此得到廣泛的關(guān)注[15-17]。目前滲透汽化分離丁醇的研究大多集中在新型滲透汽化膜材料的開(kāi)發(fā)上，對(duì)發(fā)酵耦合工藝研究的關(guān)注較少。Qureshi等[20]將滲透汽化應(yīng)用于C. acetobutylicumATCC 824發(fā)酵液中丁醇等溶劑的分離提取，研究滲透汽化與分批補(bǔ)料發(fā)酵相耦合，發(fā)酵液體積0.50 L，滲透汽化膜面積0.022 m2，發(fā)酵結(jié)束后，溶劑產(chǎn)率從0.30 g/（L·h）提高至0.37 g/（L·h）。Li Jing等[21]以木薯為底物，研究滲透汽化與C. acetobutylicumDP217間歇發(fā)酵耦合，發(fā)酵液體積1.0 L，滲透汽化膜面積0.007 2 m2，丁醇和總?cè)軇〢BE產(chǎn)量分別達(dá)到13.0 g/L和21.3 g/L。當(dāng)滲透汽化與連續(xù)發(fā)酵耦合時(shí)，發(fā)酵320 h，總?cè)軇〢BE產(chǎn)量達(dá)到201.8 g/L。本研究利用實(shí)驗(yàn)室誘變得到的高產(chǎn)丁醇菌株Clostridium beijerinckiiZL01，將丁醇發(fā)酵工藝與滲透汽化原位分離耦合，考察丁醇分離及產(chǎn)量提高效果，以期為滲透汽化分離工藝在丁醇提取中的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1菌種與培養(yǎng)基

菌種：拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）ZL01，是上海高等研究院生物煉制實(shí)驗(yàn)室由C. beijerinckiiNCIMB 8052（購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心）誘變選育獲得的丁醇高產(chǎn)菌株。

TYA種子培養(yǎng)基：葡萄糖40 g、酵母粉2.0 g、蛋白胨6.0 g、牛肉粉2.0 g、CH3COONH43.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、K2HPO40.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水定容至1 L，自然pH值，115℃滅菌15 min。

TYA發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g、酵母粉2.0 g、蛋白胨6.0 g、牛肉粉2.0 g、CH3COONH43.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、K2HPO40.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水定容至1 L，自然pH值，115℃滅菌15 min。

1.2儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀、GC-2010 plus高效氣相色譜儀 日本Shimadzu公司；MDF-U53V-80℃超低溫冰箱 日本三洋公司；ZDP-A2160全自動(dòng)新型電熱培養(yǎng)箱上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；D8C-31046歐瑞康萊寶真空泵 歐瑞康萊寶真空設(shè)備（天津）有限公司；A23617分光光度計(jì) 德國(guó)Beckman公司。

1.3方法

1.3.1菌種活化與培養(yǎng)

從-80℃冰箱取出保藏菌種，以200μL轉(zhuǎn)接到含10 mL種子培養(yǎng)基的試管中，在沸水中熱激1.0 min，迅速放入室溫水中冷卻5 min，37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，然后按10%的接種量轉(zhuǎn)入含有40 mL種子培養(yǎng)基的100 mL三角瓶，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h后，按10%的接種量轉(zhuǎn)入含有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2滲透汽化原位分離耦合丁醇發(fā)酵裝置的建立

滲透汽化原位分離耦合丁醇發(fā)酵裝置為自制，如圖1所示。滲透汽化原位分離耦合丁醇發(fā)酵裝置包括發(fā)酵罐、蠕動(dòng)泵、滲透汽化膜組件、冷肼、真空系統(tǒng)、管路等部件，發(fā)酵液從發(fā)酵罐經(jīng)蠕動(dòng)泵進(jìn)入滲透汽化膜組件，在膜組件內(nèi)經(jīng)過(guò)滲透汽化分離，透過(guò)膜一側(cè)的滲透液在真空系統(tǒng)中汽化后由液氮冷肼收集，未滲透的組分循環(huán)回到發(fā)酵罐。發(fā)酵罐體積為2 L，加入1 L發(fā)酵液，發(fā)酵溫度由水浴加熱控制，流量由轉(zhuǎn)子流量計(jì)設(shè)定，結(jié)合蠕動(dòng)泵調(diào)節(jié)流量為15 L/h。滲透汽化膜的有效膜面積為2.4×10-3m2，膜下游側(cè)真空壓強(qiáng)小于800 Pa，膜材料由清華大學(xué)化工系和同濟(jì)大學(xué)提供。在發(fā)酵與滲透汽化分離耦合開(kāi)始前，滲透汽化裝置首先用75%酒精循環(huán)沖洗1 h，然后用1 L無(wú)菌水循環(huán)沖洗1 h。

圖1 滲透汽化原位分離耦合丁醇發(fā)酵裝置Fig.1 Schematic diagram showing the experimental setup for butanol fermentation integrated with in situ pervaporation

滲透汽化原位分離性能的評(píng)價(jià)指標(biāo)主要有滲透通量（J）和分離因子（α）。

式中：m為滲透液質(zhì)量/g；A為膜有效面積/m2；t為滲透汽化過(guò)程操作時(shí)間/h；J為滲透通量/（g/（m2·h））；y為組分在滲透液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%；x為組分在原料液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%。

1.3.3滲透汽化原位分離耦合丁醇發(fā)酵

將活化培養(yǎng)好的菌種按10%的接種量轉(zhuǎn)入含有1 L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，37℃靜置培養(yǎng)至發(fā)酵液中丁醇質(zhì)量濃度為6.0 g/L左右時(shí)，開(kāi)始耦合滲透汽化分離。

1.3.4發(fā)酵液和滲透液中溶劑的測(cè)定

采用氣相色譜法（gas chromatography，GC）測(cè)定發(fā)酵液和滲透液中的各溶劑含量，滲透液中由于有機(jī)溶劑質(zhì)量濃度高故分為兩相，在測(cè)定前用去離子水稀釋。氣相色譜儀Shimadzu 2010 Plus，色譜條件：毛細(xì)管色譜柱Inert Cap Pure Wax（30 m×0.25 mm，0.25μm）；程序升溫：50℃保持3.8 min，以20℃/min升至220℃，保持3 min；進(jìn)樣口溫度200℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度230℃；載氣N2流量1.0 mL/min，H2流量40 mL/min；空氣流量400 mL/min；進(jìn)樣量0.5μL；分流比50∶1。采用內(nèi)標(biāo)法定量，內(nèi)標(biāo)為異丁醇[22]。

1.3.5發(fā)酵液中殘?zhí)堑臏y(cè)定

采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定發(fā)酵液中殘留葡萄糖的含量，液相色譜儀Shimadzu LC-20A，色譜條件：液體色譜柱Bio-Rad Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm），柱溫65℃；流動(dòng)相0.005 mol/L H2SO4，流速0.8 mL/min；檢測(cè)器為RID；進(jìn)樣量20μL。采用外標(biāo)法定量[22]。

1.3.6發(fā)酵液中菌體細(xì)胞濃度的測(cè)定

采用分光光度法[20]測(cè)定發(fā)酵液中的菌體細(xì)胞濃度，將發(fā)酵液搖勻后取樣，樣品稀釋至適當(dāng)濃度，在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定光密度（OD）值。

2 結(jié)果與分析

2.1滲透汽化膜材料的篩選

用于丁醇滲透汽化分離的膜材料主要集中于聚合物膜及其改性膜，有代表性的是含硅聚合物膜和聚醚酰胺嵌段共聚物（poly（ether block amide），PEBA）聚合物膜材料[23]，含硅聚合物膜中聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）最受關(guān)注[24-25]。因此本研究主要選取了PEBA膜和PDMS膜，進(jìn)行了質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%丁醇-水溶液滲透汽化分離實(shí)驗(yàn)，以篩選最佳的丁醇分離用膜，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同滲透汽化膜材料分離丁醇-水溶液的結(jié)果比較Table1 Comparison of pervaporation performance by different membranes in butanol-water solution

滲透通量與分離因子之間一般是相互矛盾的，滲透通量較大的膜，分離因子較小。在考察的12種膜中，PDMS-18#的滲透通量最大，高達(dá)1 889.5 g/（m2·h），但其分離因子最低，只有3.2，不能滿足丁醇的分離要求。PDMS-1#是一種PDMS-PVDF復(fù)合膜，分離1.5%丁醇-水溶液的滲透通量為1 054.6 g/（m2·h），分離因子為20.8，綜合考慮分離效率，選擇膜PDMS-1#做進(jìn)一步的研究。

2.2初始葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)丁醇分批發(fā)酵的影響

在初始葡萄糖質(zhì)量濃度50.3 g/L時(shí)，經(jīng)過(guò)44 h發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液中丁醇、丙酮、乙醇以及總?cè)軇〢BE產(chǎn)量分別為15.0、4.0、0.4 g/L以及19.4 g/L，此時(shí)總?cè)軇〢BE產(chǎn)率為0.44 g/（L·h）。44 h發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中殘?zhí)呛繛?.3 g/L，葡萄糖利用率為99.4%，葡萄糖幾乎全部耗盡。為提高溶劑產(chǎn)量，研究最佳初始糖質(zhì)量濃度，降低成本，分別進(jìn)行了初始葡萄糖質(zhì)量濃度為70.3、90.0 g/L及111.0 g/L的分批發(fā)酵，結(jié)果見(jiàn)表2。隨著葡萄糖質(zhì)量濃度升高至70.3 g/L和90.0 g/L，丁醇產(chǎn)量下降至13.3 g/L和13.2 g/L，并且發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)。在高質(zhì)量濃度葡萄糖條件下，底物對(duì)菌種發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生了負(fù)作用，降低了產(chǎn)量。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為111.0 g/L時(shí)，丁醇產(chǎn)量?jī)H僅為11.3 g/L，與50.3 g/L相比，總?cè)軇〢BE產(chǎn)率降低了50%，說(shuō)明此時(shí)高質(zhì)量濃度的底物已嚴(yán)重抑制了菌體正常的生長(zhǎng)代謝，原因可能為：1）葡萄糖質(zhì)量濃度太高，培養(yǎng)基中滲透壓較大對(duì)菌體細(xì)胞有一定的危害作用；2）葡萄糖作為碳源，過(guò)高質(zhì)量濃度的葡萄糖與其他營(yíng)養(yǎng)成分比例不平衡，存在制約，影響了發(fā)酵[26]。

表2 C. beijerincckkiiii ZL01在不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度下分批發(fā)酵的結(jié)果比較Table2 Comparison of batch fermentation from different concentrations of original glucose byC. beijerinckii ZL01

由表2可知，C. beijerinckiiZL01在4個(gè)葡萄糖質(zhì)量濃度下的分批發(fā)酵過(guò)程中，被利用的葡萄糖大約都在50 g/L左右。這可能是隨著發(fā)酵液中丁醇的累積，產(chǎn)物對(duì)菌體生長(zhǎng)代謝的抑制作用逐漸增強(qiáng)，反過(guò)來(lái)影響了菌種對(duì)葡萄糖的利用，為了減弱產(chǎn)物抑制，提高產(chǎn)量，需要及時(shí)移除丁醇。

2.3丁醇分批發(fā)酵-滲透汽化分離耦合的研究

2.3.1初始葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)分批發(fā)酵-滲透汽化分離耦合的影響

適當(dāng)增加底物質(zhì)量濃度發(fā)酵能夠減小設(shè)備規(guī)模，降低工業(yè)成本，因此，考察了初始葡萄糖質(zhì)量濃度為50、70、90、110 g/L時(shí)，分批發(fā)酵與滲透汽化分離耦合工藝下各項(xiàng)發(fā)酵指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 C. beijerinckii ckii ZL01在不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度下分批發(fā)酵-滲透-汽化原位分離耦合的結(jié)果比較Table3 Comparison of batch fermentation integrated with Table3 Comparison of batch fermentation integrated with in situ itu pervaporation from different concentrations of original glucose by pervaporation from different concentrations of original glucose by C. beijerinckiikii ZL01ZL01

當(dāng)初始葡萄糖質(zhì)量濃度為50 g/L時(shí)，總?cè)軇〢BE產(chǎn)量為20.2 g/L，與分批發(fā)酵的19.4 g/L相差不大，但滲透汽化耦合發(fā)酵時(shí)間為37 h，比分批發(fā)酵的44 h縮短了7 h，因此總?cè)軇〢BE產(chǎn)率從0.44 g/（L·h）提高到0.55 g/（L·h），滲透汽化原位分離耦合丁醇發(fā)酵在低質(zhì)量濃度初始葡萄糖（50 g/L）條件下大大提高了發(fā)酵效率。當(dāng)初始葡萄糖質(zhì)量濃度為70 g/L，與分批發(fā)酵相比，總?cè)軇〢BE產(chǎn)量由17.9 g/L提高到22.1 g/L，提高了23.5%，葡萄糖消耗速率從0.84 g/（L·h）增加到1.59 g/（L·h），增加了89.3%。當(dāng)初始葡萄糖質(zhì)量濃度增加至90 g/L，與分批發(fā)酵相比，總?cè)軇〢BE產(chǎn)量由17.8 g/L提高到24.3 g/L，提高了36.5%，葡萄糖消耗速率從0.76 g/（L·h）增加到1.29 g/（L·h），增大了69.7%。由于滲透汽化移走丁醇等產(chǎn)物，減弱了產(chǎn)物抑制，與分批發(fā)酵相比，溶劑產(chǎn)量均提高，糖消耗速率加快，發(fā)酵時(shí)間縮短，溶劑產(chǎn)率提高。由表3可知，隨著初始葡萄糖質(zhì)量濃度的增加，溶劑產(chǎn)量先升高后降低。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度增加至110 g/L，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)至74 h，總?cè)軇〢BE產(chǎn)量下降為19.7 g/L，這可能是因?yàn)楦哔|(zhì)量濃度的葡萄糖對(duì)菌株有嚴(yán)重的底物抑制，使得發(fā)酵不能正常進(jìn)行，導(dǎo)致丁醇產(chǎn)量降低。

從2.2節(jié)分析得出，分批發(fā)酵最適葡萄糖質(zhì)量濃度為50 g/L時(shí)，多余的糖不能被利用。但是當(dāng)分批發(fā)酵與滲透汽化原位分離耦合，丁醇被及時(shí)移除，菌體細(xì)胞濃度增加，促進(jìn)發(fā)酵，多余的糖能夠被利用。如表3所示，50、70 g/L及90 g/L葡萄糖利用率幾乎約為100%，絕大部分葡萄糖被耗盡，滲透汽化原位分離丁醇對(duì)發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行有明顯的促進(jìn)作用。分批發(fā)酵-滲透汽化原位分離耦合提高了葡萄糖的利用率，并及時(shí)移除丁醇，發(fā)酵液中丁醇質(zhì)量濃度降低，減弱了丁醇對(duì)菌株的毒害，菌株能夠正常生長(zhǎng)代謝，所以糖利用率增加。但是，當(dāng)初始葡萄糖質(zhì)量濃度從50 g/L增加至90 g/L，底物抑制作用較弱，總?cè)軇〢BE產(chǎn)率隨糖質(zhì)量濃度的升高反而降低，這可能是因?yàn)槟っ娣e及料液循環(huán)等其他因素影響。

綜上所述，本研究以總?cè)軇〢BE質(zhì)量濃度為指標(biāo)，認(rèn)為初始葡萄糖質(zhì)量濃度為90 g/L，為分批發(fā)酵-滲透汽化原位分離耦合工藝的最佳初始糖質(zhì)量濃度。

2.3.2分批發(fā)酵-滲透汽化原位分離耦合過(guò)程研究

為了更好地考察滲透汽化對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的分離效果，對(duì)C. beijerinckiiZL01在葡萄糖初始質(zhì)量濃度50 g/L的TYA培養(yǎng)基中的分批發(fā)酵-滲透汽化分離耦合過(guò)程中各發(fā)酵指標(biāo)的變化進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，同時(shí)以分批發(fā)酵過(guò)程中各指標(biāo)作為對(duì)照。分批發(fā)酵時(shí)，50 g/L葡萄糖能被菌種完全利用，經(jīng)濟(jì)性好，但是受到丁醇產(chǎn)物抑制，總?cè)軇〢BE產(chǎn)量只有19.4 g/L。因此在發(fā)酵20 h，此時(shí)發(fā)酵液中丁醇累積至5.5 g/L，將發(fā)酵罐與滲透汽化裝置連接，移除丁醇、丙酮等溶劑，直至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液中的各溶劑產(chǎn)生情況如圖2所示。圖2a是沒(méi)有耦聯(lián)滲透汽化分離的分批發(fā)酵過(guò)程，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵液中丁醇、丙酮和乙醇質(zhì)量濃度持續(xù)增加，產(chǎn)物累積逐漸影響菌體正常新陳代謝，最終發(fā)酵44 h丁醇質(zhì)量濃度只能達(dá)到15.0 g/L。而從圖2b中明顯可以看出，20 h開(kāi)始發(fā)酵與滲透汽化分離耦聯(lián)后，發(fā)酵液中尚存的丁醇、丙酮和乙醇質(zhì)量濃度的增加變慢，28 h時(shí)丁醇質(zhì)量濃度為8.6 g/L，隨著發(fā)酵進(jìn)行，丁醇質(zhì)量濃度基本保持在該較低水平，直至發(fā)酵結(jié)束。結(jié)果表明滲透汽化有效地起到了分離丁醇等發(fā)酵產(chǎn)物的作用。

圖2 C. beijerinckii ZL01分批發(fā)酵（a）和分批發(fā)酵-滲透汽化原位分離耦合（b）過(guò)程的發(fā)酵液中ABE產(chǎn)生情況Fig.2 ABE production in fermentation broth during batch fermentation by C. beijerinckii ZL01 alone and integrated with in situpervaporation (initial glucose concentration of 50 g/L)

圖3 C. beijerinckii ZL01分批發(fā)酵（a）和分批發(fā)酵-滲透汽化原位分離耦合（b）過(guò)程中葡萄糖消耗和菌株OODD60000 nnmm值的變化Fig.3 Glucose consumption and cell concentration during batch fermentation by C. beijerinckii ZL01 alone and integrated with in situ pervaporation

由圖3a與圖3b對(duì)照分析可以得出，從發(fā)酵20 h滲透汽化分離耦合以后，由于丁醇、丙酮產(chǎn)物被及時(shí)移走，對(duì)菌株的產(chǎn)物抑制作用降低，因此發(fā)酵20～40 h期間，菌株OD600nm值均高于分批發(fā)酵，OD600nm值在28 h達(dá)到最高（12.7），與分批發(fā)酵的最高值9.6相比，提高32.3%。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，丁醇和總?cè)軇〢BE產(chǎn)量分別為14.9 g/L和20.2 g/L，與分批發(fā)酵的15.0 g/L和19.4 g/L相比，溶劑產(chǎn)量基本不變，這是由于不論是分批發(fā)酵還是滲透汽化耦合發(fā)酵，50 g/L葡萄糖都被完全利用，收率是不變的。從葡萄糖消耗情況來(lái)看，分批發(fā)酵在44 h殘?zhí)橇繛?.7 g/L，幾乎全部消耗完。而耦合滲透汽化分離之后，32 h時(shí)殘?zhí)橇烤鸵呀抵?.5 g/L，到37 h發(fā)酵結(jié)束時(shí)殘?zhí)橇績(jī)H為0.2 g/L，底物葡萄糖消耗速率提高了37.7%，發(fā)酵時(shí)間大大縮短。

2.3.3滲透汽化分離耦合丁醇發(fā)酵中滲透液各溶劑質(zhì)量濃度及膜的分離性能

滲透汽化分離可以濃縮丁醇等溶劑，如圖4所示，滲透液中丁醇和總?cè)軇〢BE最高質(zhì)量濃度分別能達(dá)到178 g/L和292 g/L，與分批發(fā)酵相比，總?cè)軇〢BE質(zhì)量濃度提高了14.1倍，可大大降低下一步蒸餾提取的能耗。同時(shí)，從圖5中可以看出，分批發(fā)酵-滲透汽化原位分離耦合過(guò)程中，總滲透通量平均為705 g/（m2·h），丁醇、丙酮和乙醇分離因子分別為19.0、20.4和4.9。與滲透汽化分離1.5%丁醇-水溶液相比，滲透通量和分離因子均減小，這是由于發(fā)酵液中丁醇質(zhì)量濃度為7～8 g/L，溶劑質(zhì)量濃度低，通量降低，丙酮和乙醇與丁醇競(jìng)爭(zhēng)性通過(guò)膜，使得丁醇分離因子減小。另外，菌體細(xì)胞、葡萄糖、蛋白胨和牛肉膏的存在，發(fā)酵液黏度大于水溶液，同時(shí)這些成分會(huì)黏附在滲透汽化膜表面，阻礙溶劑組分吸附滲透過(guò)程，導(dǎo)致滲透汽化分離性能下降。

圖5 分批發(fā)酵-滲透汽化原位分離耦合過(guò)程中膜的分離性能Fig.5 Performance of the composite membrane in batch fermentation integrated with in situ pervaporation

3 結(jié) 論

本研究首先篩選出一種PDMS-PVDF復(fù)合膜，用于分離1.5%丁醇-水溶液的滲透通量 為1 054.6 g/（m2·h），丁醇分離因子為20.8。將該復(fù)合膜應(yīng)用于滲透汽化原位分離耦合C. beijer inckiiZL01丁醇發(fā)酵，可及時(shí)移除丁醇等毒性產(chǎn)物，減弱其對(duì)菌株的毒害作用，明顯提高總 溶劑ABE產(chǎn)量以及葡萄糖利用率。當(dāng)葡萄糖初始質(zhì)量濃度為90 g/L時(shí)，滲透汽化耦合分批發(fā)酵的 總?cè)軇〢BE產(chǎn)量為24.3 g/L，與分批發(fā)酵的17.8 g/L相比，提高了36.5%，葡萄糖利用率 為95.7%，與分批發(fā)酵的59.4%相比，提高了61.1%。滲透汽化耦合分批發(fā)酵過(guò)程的滲透通量平均為705 g/（m2·h），丁醇、丙酮和乙醇分離因子分別平均為19.0、20.4和4.9。經(jīng)滲透汽化分離，滲透液中總?cè)軇〢BE可濃縮至292 g/L，與分批發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液中的總?cè)軇〢BE 19.4 g/L相比，是分批發(fā)酵的15.1倍，可大大提高進(jìn)入蒸餾塔時(shí)的總?cè)軇舛?，降低蒸餾能耗。

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Butanol Fermentation by Clostridium beijerinckii Integrated with in situ Pervaporation

LIU Xiaojie1,2, SHEN Zhaobing1,2, LIU Li1,*, SHI Jiping1,3,*
(1. Shanghai Advanced Research Institute, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201210, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. School of Life Science and Technology, Shanghai Tech University, Shanghai 201210, China)

Butanol fermentation byClostridium beijerinckiiintegrated within situpervaporation using a polydimethylsiloxane-polyvinylidene fluoride (PDMS-PVDF) composite membrane was carried out. The results showed that the original glucose concentration was increased to 90 g/L for butanol fermentation integrated with pervaporation, as compared to that (50 g/L) for the batch fermentation, and the glucose utilization was increased to 95.7%as compared to that (59.4%) for batch fermentation. Meanwhile, butanol concentration was increased from 13.2 to 16.9 g/L, and the total amount of solvents (acetone-butanol-ethanol, ABE) was increased from 17.8 g/L to 24.3 g/L based on the original glucose of 90 g/L. In addition, the average total flux was 705 g/(m2·h) and separation factor of butanol was 19.0 during the butanol separation process. The concentrations of butanol and total solvents were 178 and 292 g/L in the permeates, which were increased by 11.9 and 15.1 folds, respectively, as compared to those for batch fermentation.

butanol; pervaporation;in situseparation;Clostridium beijerinckii; fermentation

Q815

1002-6630（2015）17-0118-06

10.7506/spkx1002-6630-201517023

2015-02-11

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（21306219）；上海市科委院市合作項(xiàng)目（10dz1210400）；

中國(guó)科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（2015232）；中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院交叉學(xué)科青年創(chuàng)新基金項(xiàng)目（141002）

劉曉潔（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail：liuxj@sari.ac.cn

*通信作者：劉莉（1982—），女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：liul@sari.ac.cn

史吉平（1964—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)樯锕こ?。E-mail：shijp@sari.ac.cn