劉婷婷，范迪，冉玲玉，姜淵忠，劉瑞，羅克明西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西南大學(xué)資源植物研究所，重慶 400715

應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)在楊樹中高效敲除多個靶基因

劉婷婷，范迪，冉玲玉，姜淵忠，劉瑞，羅克明
西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西南大學(xué)資源植物研究所，重慶 400715

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、酵母、動物和植物中的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)。本課題組在前期工作中利用該系統(tǒng)在毛白楊(Populus tomentosa Carr.)中率先實(shí)現(xiàn)了對內(nèi)源基因—八氫番茄紅素脫氫酶(Phytoene dehydrogenase, PDS)基因的定點(diǎn)敲除。為研究靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)和選擇對該系統(tǒng)介導(dǎo)的楊樹內(nèi)源基因敲除效率的影響，本文分析了不同單向?qū)NA(Single-guide RNA, sgRNA)結(jié)合毛白楊PDS(PtPDS)靶基因DNA序列后對突變效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)sgRNA與靶基因間的堿基錯配會導(dǎo)致突變的效率降低，甚至不能突變，其中3′端的堿基配對更為重要。進(jìn)一步測序分析發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)能同時敲除楊樹基因組上兩個同源的 PDS編碼基因(PtPDS1和PtPDS2)，突變率分別達(dá)86.4%和50%。研究證明該系統(tǒng)可快速高效地敲除兩個以上的內(nèi)源基因，獲得多重突變體楊樹株系。利用該技術(shù)，本課題組已獲得多個楊樹轉(zhuǎn)錄因子及結(jié)構(gòu)基因的敲除突變體株系，為將來開展基因功能研究和楊樹遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。

CRISPR/Cas9；楊樹；定點(diǎn)敲除；多基因；八氫番茄紅素脫氫酶

隨著鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALEN)技術(shù)和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR)技術(shù)為代表的基因組編輯新技術(shù)的出現(xiàn)，使得基因組定位修飾、定向突變和定點(diǎn)整合成為可能[1,2]。其中，CRISPR/Cas9技術(shù)是基于細(xì)菌體內(nèi)的獲得性免疫機(jī)制改造而成，可通過一條單鏈的單向?qū)?RNA(Single-guide RNA, sgRNA)來識別特定的DNA序列，并引導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶剪切DNA雙鏈[3]。相比ZFN 和TALEN技術(shù)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)勢：只需設(shè)計(jì)一段與靶位點(diǎn)配對的含幾十個堿基的核苷酸序列，操作簡單，實(shí)驗(yàn)周期短，花費(fèi)不高。因此，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、酵母和動物的基因組編輯中[4]。

2013年，中國、美國和英國的3個研究團(tuán)隊(duì)同時報(bào)道了利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中實(shí)現(xiàn)了對內(nèi)源基因的定點(diǎn)突變：中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點(diǎn)突變了水稻和小麥兩個作物的OsPDS和TaMLO等5個基因，并通過同源重組DNA修復(fù)途徑，利用單鏈寡核苷酸DNA(Single-strain DNA , ssDNA)作為模板在基因組特定位點(diǎn)精確插入了12 bp序列[5]；哈佛大學(xué)和塞恩斯伯里實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)利用該技術(shù)分別在擬南芥和煙草中敲除了內(nèi)源AtPDS和NbPDS等基因[6,7]。這些研究首次證實(shí)了CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠用于植物的基因組編輯。到目前為止，人們利用該系統(tǒng)先后在模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)、煙草(Nicotiana benthamiana)以及水稻(Oryza sativa)[8,9]、小麥(Triticum aestivum)[5,10]、玉米(Zea mays)[11]、高粱(Sorghum bicolor)[12]、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、番茄(Lycopersicon esculentum)[13]等作物中成功實(shí)現(xiàn)了基因組編輯，這也是目前唯一在植物中實(shí)現(xiàn)了廣泛應(yīng)用的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)[14]。然而，多數(shù)研究都是在草本植物中展開，該技術(shù)在木本植物中的應(yīng)用報(bào)道目前還比較少。

作為全球種植面積最大的速生經(jīng)濟(jì)林樹種，楊樹(Populus)具有重要的商業(yè)價值和生態(tài)價值。2006年，楊樹作為首個完成基因組測序的多年生木本植物[15]，其基因組信息的公布為在該物種中開展功能基因組學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)。因此，近年來?xiàng)顦湟呀?jīng)發(fā)展為全世界公認(rèn)的木本模式植物。然而，由于木本植物自身固有的特點(diǎn)，對楊樹基因功能的研究存在諸多技術(shù)困難。尤其是其非常長的繁殖周期和較低的遺傳轉(zhuǎn)化效率，限制了遺傳研究手段在楊樹中的應(yīng)用，導(dǎo)致人們迄今僅獲得了極少數(shù)的楊樹基因突變體[16,17]。因此，如果能通過新的技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)高效的楊樹基因突變，將十分有利于林木的遺傳改良研究。

在前期工作中，本實(shí)驗(yàn)室利用一套改良的CRISPR/Cas9多靶點(diǎn)載體系統(tǒng)[18]，在楊樹體內(nèi)同時表達(dá) Cas9蛋白和多個針對八氫番茄紅素脫氫酶(Phytoene dehydrogenase, PDS)基因的sgRNA，在楊樹體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對內(nèi)源基因的高效定點(diǎn)敲除，成功運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)在木本植物中獲得了穩(wěn)定的基因定點(diǎn)敲除的突變體株系[19]。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在T0代轉(zhuǎn)基因楊樹中可實(shí)現(xiàn)50%以上突變效率，具有快速、高效的特點(diǎn)，因而在楊樹的功能基因研究和遺傳改良中具有廣泛的應(yīng)用前景。2015年，Zhou 等[20]利用 Cas9技術(shù)在楊樹中定點(diǎn)敲除了楊樹內(nèi)源的4CL基因。

為了進(jìn)一步研究CRISPR/Cas9系統(tǒng)在楊樹中的敲除特性，本研究設(shè)計(jì)和構(gòu)建了含有不同sgRNA個數(shù)的一系列敲除載體，并遺傳轉(zhuǎn)化楊樹，通過測序分析了PtPDS基因不同靶點(diǎn)上發(fā)生核酸序列改變的形式和效率，證明sgRNA內(nèi)3′端的序列對于識別和介導(dǎo)靶基因突變更為重要，為楊樹內(nèi)源靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)和選擇提供了參考依據(jù)。進(jìn)一步利用生物信息分析和基因克隆，發(fā)現(xiàn)楊樹基因組內(nèi)存在兩個同源的PDS編碼基因，而多靶點(diǎn)系統(tǒng)能夠同時識別和敲除這兩個楊樹內(nèi)源PDS基因，導(dǎo)致突變體出現(xiàn)白化的表型，表明多靶點(diǎn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)具備同時快速高效地敲除多個內(nèi)源基因的優(yōu)勢。最后，本文利用該系統(tǒng)成功敲除了多個楊樹內(nèi)源基因，構(gòu)建了楊樹突變體庫，為開展基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

毛白楊(Populus tomentosa Carr. clone 741)在溫室中培養(yǎng)，溫度25℃，14 h/10 h 光照/黑暗，光照強(qiáng)度4500 lx。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101(本實(shí)驗(yàn)室保存)。pYLCRISPR/Cas9-DH植物表達(dá)載體系統(tǒng)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光教授提供。

1.2 方法

1.2.1 楊樹組培和遺傳轉(zhuǎn)化

遺傳轉(zhuǎn)化方法為葉盤法[21]。取楊樹無菌苗幼嫩葉片，切成0.5 cm小塊，菌液浸染8～10 min；取出葉片，背面向下平鋪在WPM1[WPM培養(yǎng)基(NH4N03400 mg/L、Ca(NO3)2·4H2O 556 mg/L、K2SO4990 mg/L、CaCl2·2H2O 96 mg/L、KH2PO4170 mg/L、Na2MoO4· 2H2O 0.25 mg/L、MgSO4·7H2O 370 mg/L、MnSO4·H2O 22.4 mg/L、ZnSO4·H2O 8.6 mg/L、CuSO4·5H2O 0.25 mg/L、FeSO4·7H2O 27.8 mg/L、Na2-EDTA 37.3 mg/L、肌醇 100 mg/L、維生素B1 1.0 mg/L、煙酸 0.5 mg/L、維生素B6 0.5 mg/L、甘氨酸2.0 mg/L、蔗糖20 g/L、瓊脂 6 g/L，pH 5.2)加萘乙酸1.0 mg/L、乙酰丁香酮100 μmol/L]共培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng) 2 d；移到WPM2(WPM培養(yǎng)基加玉米素 2 mg/L、萘乙酸1.0 mg/L、頭孢霉素400 mg/L、潮霉素90 mg/L)選擇培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)3～4周；長出愈傷后移入生芽培養(yǎng)基WPM3(WPM培養(yǎng)基加玉米素2 mg/L、萘乙酸0.1 mg/L、頭孢霉素400 mg/L、潮霉素90 mg/L)，光照培養(yǎng)4～5周；不定芽切下并轉(zhuǎn)入WPM4(WPM培養(yǎng)基加萘乙酸0.1 mg/L、頭孢霉素400 mg/L、潮霉素90 mg/L)中生根。

1.2.2 Cas9靶點(diǎn)設(shè)計(jì)

基于 PtPDS1基因組序列，本文利用在線工具ZiFiT Targeter Version 4.2 (http://zifit.partners.org/Zi-FiT/Introduction.aspx)查找潛在的Cas9靶點(diǎn)[22]。根據(jù)靶點(diǎn)的位置和GC含量選擇其中4個(T1/T2/T3/T4)設(shè)計(jì)sgRNA(圖2A)。靶點(diǎn)的序列分別為T1：5’-TGAGTGCATTGAACTTGAGC-3’；T2：5’-GTGTTATCAAGGTCCGGTCT-3’；T3：5’-TTCACCGTGTTATCAAGGTC-3’；T4：5’-CCATTAAATGTTGTCATTGC-3’。

1.2.3 Cas9植物表達(dá)載體構(gòu)建

載體系統(tǒng)包含了雙元的植物表達(dá)載體pYLCRISPR/Cas9-DH和針對T1到T4的4個sgRNA表達(dá)盒中間載體，前者以35S超表達(dá)Cas9，后者分別以AtU3b、AtU3d、AtU6-1和AtU6-29四個啟動子分別驅(qū)動 sgRNA的表達(dá)[22]。載體構(gòu)建采用 Golden Gate Cloning方法[23]。

1.2.4 基因組DNA提取

取恒定轉(zhuǎn)化的T0代植株材料約0.1 g，采用CTAB法提取楊樹基因組DNA。

1.2.5 突變檢測

以轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增楊樹內(nèi)源PDS基因5′端部分序列。PCR引物如下：

PtPDS-F: 5’-GTTGAATTTGGTTTTGGAGAAATG-3’；

PtPDS-R1: 5’-CCAAGTATTTTGCAGTCGATAAACCCG-3’；

PtPDS-R2: 5’-CCAAATATTTTGCAGTAGATAAACCAG-3’。

用PtPDS-F和PtPDS-R1引物組合擴(kuò)增PtPDS1；用PtPDS-F和PtPDS-R2引物組合擴(kuò)增PtPDS2。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收后連接到pMD19-T Simple (寶生物工程(大連)有限公司)載體上，挑單克隆測序。利用DNAMAN(Version 7.0)對所有測序獲得的序列和PtPDS基因的參考序列進(jìn)行比對分析，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多靶點(diǎn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除效率的分析

本實(shí)驗(yàn)室前期研究已經(jīng)證明，針對楊樹 1個PtPDS基因序列上的不同靶點(diǎn)，用4個對應(yīng)的sgRNA可高效地介導(dǎo)Cas9對楊樹內(nèi)源基因的敲除，在轉(zhuǎn)基因T0代楊樹即出現(xiàn)白化的表型[19]。然而，是不是一定需要多個sgRNA才能達(dá)到如此高的敲除效率？這些sgRNA在導(dǎo)致楊樹白化表型中的作用是否存在差異？這些問題尚不清楚。因此，本文設(shè)計(jì)了一組載體，分別帶有4個(PtPDS×4)、3個(PtPDS×3)、2個(PtPDS×2)和1個(PtPDS×1)針對PtPDS的sgRNA。受該系統(tǒng)載體構(gòu)建方法的限制，這一組載體上攜帶哪些sgRNA是按照不同sgRNA表達(dá)盒連入載體的順序，而不是按照sgRNA在基因上結(jié)合位點(diǎn)的順序來設(shè)計(jì)的。其中，PtPDS×4含有針對楊樹內(nèi)源PDS座位上全部4個靶序列的sgRNA；而PtPDS×3含有結(jié)合T1、T2、T4的sgRNA；PtPDS×2含結(jié)合T1、T4的 sgRNA；PtPDS×1只有一個結(jié)合 T1位點(diǎn)的sgRNA(圖1)。將上述載體和作為對照的空載體分別轉(zhuǎn)化楊樹，發(fā)現(xiàn)T0代的再生植株在表型上有明顯差異：PtPDS×4(圖1A)和PtPDS×3(圖1B)轉(zhuǎn)化的T0代植株中，有部分葉片和幼莖出現(xiàn)白化表型，推測是因內(nèi)源PDS缺陷導(dǎo)致葉綠素合成受阻所引起的。而PtPDS×2(圖1C)和PtPDS×1(圖1D)轉(zhuǎn)化的植株中則未發(fā)現(xiàn)該白化的表型，與轉(zhuǎn)化空載體的對照組(表1)一樣，均為正常的綠色。

圖1 多靶點(diǎn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)轉(zhuǎn)化毛白楊后的T0代表型分析

表1 T0代Cas9轉(zhuǎn)化楊樹的表型分析

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)PtPDS×4和PtPDS×3的T0代轉(zhuǎn)化植株中分別有 51.7%(30/59)和 53.8%(21/39)出現(xiàn)白化表型，兩者間并無顯著差異；而 PtPDS×2 和PtPDS×1的相應(yīng)比例為0%(分別統(tǒng)計(jì)了T0代植株38棵和123棵)，與前兩者存在明顯的差異(表1)。這一結(jié)果暗示，結(jié)合T3的sgRNA對于導(dǎo)致植物白化可能無作用，而結(jié)合T2的sgRNA對植物產(chǎn)生白化表型是必需的。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)PtPDS×4和PtPDS×3的T0代轉(zhuǎn)化植株中分別有 51.7%(30/59)和 53.8%(21/39)出現(xiàn)白化表型，兩者間并無顯著差異；而 PtPDS×2 和PtPDS×1的相應(yīng)比例為0%(分別統(tǒng)計(jì)了T0代植株38棵和123棵)，與前兩者存在明顯的差異(表1)。這一結(jié)果暗示，結(jié)合T3的sgRNA對于導(dǎo)致植物白化可能無作用，而結(jié)合T2的sgRNA對植物產(chǎn)生白化表型是必需的。

2.2 不同sgRNA對楊樹PDS同源基因結(jié)合能力的差異分析

從圖1可見，當(dāng)只有針對T1和T4的sgRNA時(PtPDS×2)，不足以導(dǎo)致 PDS基因功能的完全缺陷從而引起植物白化。而本實(shí)驗(yàn)室之前已經(jīng)通過測序證明，內(nèi)源PDS基因的T1靶點(diǎn)能夠在Cas9的作用下產(chǎn)生突變[19]。上述結(jié)果提示在楊樹基因組內(nèi)，除了本文所檢測的一個PDS基因外，可能存在其他多個編碼PDS的基因拷貝。利用同源序列比對，本文在毛果楊(測序種)基因組(http://phytozome.jgi.doe.gov)中找到了兩個與擬南芥PDS3(AT4G14210)高度同源的基因：Potri.002G235200和Potri.014G148700。通過設(shè)計(jì)引物，從楊樹基因組中克隆到兩個PDS的編碼基因(5′端部分序列)，分別命名為 PtPDS1和PtPDS2，兩者序列相似性達(dá)到 89.1%，但在很多位點(diǎn)上仍存在核苷酸的多態(tài)性，因此可以設(shè)計(jì)特異的引物分別擴(kuò)增和檢測這兩個基因(圖2A)。

對兩個楊樹內(nèi)源基因的5′端序列分析發(fā)現(xiàn)，PtPDS1的序列與4個sgRNA均能完全配對；而PtPDS2的序列則與所有sgRNA均存在1～2 bp的堿基錯配。其中，T1靶序列中1 bp錯配的堿基位于靠近NGG的識別序列3′端位置。T2、T3和T4內(nèi)發(fā)生錯配的堿基均位于離3′端12 bp以上的位置(圖2B)。之前的研究發(fā)現(xiàn)，靠近3′端的錯配對于sgRNA識別和結(jié)合靶點(diǎn)的影響可能較大，反之則可能影響較小[24,25]。因此推測，結(jié)合T1位點(diǎn)的sgRNA僅能結(jié)合到PtPDS1上，而不能結(jié)合PtPDS2，故不能介導(dǎo)對后者的有效敲除。

2.3 CRISPR/Cas9可同時敲除多個內(nèi)源基因

為了證明序列的錯配可能引起 sgRNA對兩個內(nèi)源PDS基因(PtPDS1和PtPDS2)結(jié)合效率的差異，本文對PtRDS×3轉(zhuǎn)基因的T0代植株中內(nèi)源PDS基因的序列進(jìn)行測序分析。在隨機(jī)挑選測序的 44個PtPDS1基因克隆中，有21個在T1靶點(diǎn)的位置發(fā)生了突變，突變率為 47.7%(圖 3A)。在測序的 24個PtPDS2基因克隆中，未檢測到任何突變(圖3B)。該結(jié)果證明sgRNA能夠介導(dǎo)Cas9對PtPDS1的剪切，而對 PtPDS2無作用。暗示可能是由于序列與PtPDS2存在堿基錯配，因而sgRNA不能穩(wěn)定地結(jié)合并引導(dǎo)Cas9結(jié)合到PtPDS2的T1位置上來。在T2位點(diǎn)，PtPDS1和PtPDS2均能檢測到序列突變，發(fā)生突變的概率分別為 86.4%(38/44)和 50%(23/46)(圖3)。說明T2的sgRNA可以識別兩個基因，但可能由于近5’端序列與PtPDS2的1 bp錯配，影響了結(jié)合的效率進(jìn)而影響了突變率。在T4位點(diǎn)，兩個基因均未檢測到突變(圖3)。

由此可見，序列上的差異確實(shí)可以導(dǎo)致sgRNA對基因結(jié)合能力的差異。其中靠近靶點(diǎn)3′端NGG的堿基錯配對結(jié)合能力的影響也比較大，可能導(dǎo)致完全不能結(jié)合，而遠(yuǎn)離3′端的錯配也會對結(jié)合的效率產(chǎn)生影響。這與之前在動物和人體細(xì)胞中的研究結(jié)果相符[24]，為設(shè)計(jì)楊樹的 Cas9靶點(diǎn)提供了參考依據(jù)。另一方面，測序結(jié)果證明針對T1靶點(diǎn)的sgRNA只結(jié)合 PtPDS1，不結(jié)合 PtPDS2；針對 T4靶點(diǎn)的sgRNA對PtPDS1和 PtPDS2均不能結(jié)合。提示在PtPDS×2(含針對T1和T4的sgRNA)轉(zhuǎn)基因植株中只有PtPDS1是缺陷的，而PtPDS2則維持正常功能，這就解釋了植株未出現(xiàn)白化表型的原因(圖 1C)。在PtPDS×3的 T0轉(zhuǎn)基因植株中，多靶點(diǎn)的 CRISPR/ Cas9能高效地將兩個內(nèi)源基因同時敲除掉(圖3)。證明該系統(tǒng)具備在楊樹內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速、高效的對多個基因定點(diǎn)編輯的能力。

圖3 PtPDS×3轉(zhuǎn)基因楊樹內(nèi)源PDS基因突變分析

2.4 利用 CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建楊樹功能基因突變體庫

通過對PtPDS基因的高效敲除，本文初步建立了楊樹CRISPR/Cas9基因定點(diǎn)敲除技術(shù)。而僅僅敲除PDS不足以證明該系統(tǒng)在楊樹中具有廣泛的應(yīng)用性。因此，利用該技術(shù)，本文選擇多個在楊樹生長發(fā)育、新陳代謝和環(huán)境響應(yīng)中具有重要作用的基因和基因家族，構(gòu)建它們的突變體株系。PtPIN1和PtPIN7是楊樹中生長素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)因子的編碼基因，與擬南芥AtPIN1的同源性最高，對生長素的極性分布具有重要作用[26,27]。本文從PtPIN1和PtPIN7的基因序列上選擇3個靶點(diǎn)，通過多靶點(diǎn)的Cas9系統(tǒng)再次實(shí)現(xiàn)同時敲除兩個內(nèi)源基因，敲除效率接達(dá)30%以上(表2)。結(jié)果再次證明該系統(tǒng)具備同時快速高效地敲除多個內(nèi)源基因的優(yōu)勢。PtWRKY18和PtMYB170分別屬于楊樹WRKY 和MYB轉(zhuǎn)錄因子家族，分別在植物對病害的免疫防御機(jī)制和次生代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控機(jī)制中扮演這重要角色[28, 29]。為了進(jìn)一步研究它們的功能，本文通過 CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功獲得了兩者各自的突變體株系(表2)，表明該CRISPR/Cas9系統(tǒng)可廣泛適用于楊樹內(nèi)源基因的定點(diǎn)編輯。

此外，本課題組還構(gòu)建和轉(zhuǎn)化了用于敲除在植物發(fā)育中具有重要作用的 SHOOT MERISTEMLESS (STM)[30]、WUSCHEL(WUS)[31]等10多個轉(zhuǎn)錄因子和蛋白酶基因的CRISPR/Cas9載體(表2)，初步開始構(gòu)建了楊樹重要功能基因的突變體庫。為木本植物發(fā)育、代謝的分子機(jī)制研究和林木基因資源的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

表2 利用Cas9系統(tǒng)構(gòu)建的楊樹功能基因和轉(zhuǎn)錄因子突變體

3 討 論

長期以來，因?yàn)槿狈ν蛔凅w，對楊樹等木本植物基因功能的研究主要采用超量表達(dá)和 RNAi的手段。但是，由于同源或異源的基因超表達(dá)，無法準(zhǔn)確模擬內(nèi)源基因的表達(dá)水平和時空表達(dá)特異性，其結(jié)果的可靠性常受到質(zhì)疑。RNAi的方法同樣有特異性差、效率不高、范圍受限等缺陷。如果能夠獲得突變體株系，與超表達(dá)材料對照分析，將會促進(jìn)林學(xué)研究和遺傳改良應(yīng)用。因此，在初步建立起楊樹的CRISPR/Cas9基因定點(diǎn)敲除后，選擇敲除楊樹中具有重要功能的基因，建立楊樹功能基因的突變體庫，對于深入研究木本植物中基因的生物學(xué)功能和其調(diào)控機(jī)理都具有重要的意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，在同一轉(zhuǎn)基因楊樹的同一內(nèi)源基因上，不同靶點(diǎn)的突變率也存在顯著差異：PtPDS×3轉(zhuǎn)基因T0代中，PtPDS1基因的T1、T2和T4靶點(diǎn)的突變率分別為47%、86%和0%(圖3)。由于Cas9結(jié)合到DNA序列的特定位置依賴于sgRNA的引導(dǎo)，所以sgRNA對靶序列的結(jié)合能力會影響突變的效率[2,32]。其中，靶序列的 GC含量、堿基的分布、以及錯配堿基的位置等均對sgRNA與DNA靶序列之間的親和性有影響，需要在選擇靶點(diǎn)時納入考慮[33]。此外，sgRNA的表達(dá)水平的差異也是一個可能的原因。在多靶點(diǎn)系統(tǒng)中，不同的sgRNA是由多個不同的啟動子來驅(qū)動的。T2位點(diǎn)上較高的突變率，暗示驅(qū)動其對應(yīng)sgRNA的AtU6-29啟動子在楊樹體內(nèi)可能具有較高的活性。

測序結(jié)果表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在楊樹體內(nèi)引起的突變，主要是1～5 bp的小片段確缺失或者插入，偶爾也有發(fā)生較大片段的序列改變。例如，大于20 bp的片段插入或者刪除；T1和T2之間295 bp的片段發(fā)生倒位(圖 3)。這主要是由植物體內(nèi) DNA的修復(fù)機(jī)制所決定的，與Cas9無關(guān)[34]。這也提示，可以借助多靶點(diǎn)系統(tǒng)獲得特定形式的突變體，如缺失某一特定結(jié)構(gòu)域的基因突變體。此外，多靶點(diǎn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)相比單靶點(diǎn)系統(tǒng)的一個主要優(yōu)勢在于大幅提高了突變的效率。在PtPDS×3轉(zhuǎn)基因T0代中，PtPDS1單基因的突變概率達(dá)到近90%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在其他植物物種中所報(bào)道的突變率[14]。而該系統(tǒng)同時敲除PtPDS1和PtPDS2兩個同源基因，導(dǎo)致PDS功能完全缺陷，產(chǎn)生白化表型的概率也高達(dá)50%左右。

在植物基因功能的研究中，常常需要獲得兩個或以上基因同時突變的材料，因?yàn)榭赡苡卸鄠€同源基因功能冗余，或者多個不同源基因參與了平行的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。對于擬南芥等模式植物，比較易于通過雜交、遺傳轉(zhuǎn)化等方法獲得多突，然而，受制于漫長的繁殖周期和困難的二次遺傳轉(zhuǎn)化，以楊樹為代表的木本植物很難獲得多基因缺陷材料。利用多靶點(diǎn)的CRISPR/Cas9，可在轉(zhuǎn)基因T0代就高效地獲得多基因同時敲除的突變體株系。在本研究中，T2-sgRNA 起著關(guān)鍵的作用并足以引起兩個內(nèi)源PDS基因序列的突變。這主要是因?yàn)閮蓚€PDS基因在T2位點(diǎn)上序列基本一致。對于后期的應(yīng)用，并非所有希望同時敲除的兩個或多個基因，都有具有序列高度一致的Cas9靶點(diǎn)，這種情況下，多靶點(diǎn)系統(tǒng)就為人們提供了更多選擇和更大的自由度。這種高效省時的基因突變方法對于楊樹的遺傳研究具有重要意義。

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(責(zé)任編委: 高彩霞)

Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis of multiple genes in Populus

Tingting Liu, Di Fan, Lingyu Ran, Yuanzhong Jiang, Rui Liu, Keming Luo
Institute of Resources Botany, School of Life Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China

The typeⅡCRISPR/Cas9 system (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR-associated 9) has been widely used in bacteria, yeast, animals and plants as a targeted genome editing technique. In previous work, we have successfully knocked out the endogenous phytoene dehydrogenase (PDS) gene in Populus tomentosa Carr. using this system. To study the effect of target design on the efficiency of CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in Populus, we analyzed the efficiency of mutagenesis using different single-guide RNA (sgRNA) that target PDS DNA sequence. We found that mismatches between the sgRNA and the target DNA resulted in decreased efficiency of mutagenesis and even failed mutagenesis. Moreover, complementarity between the 3′ end nucleotide of sgRNA and target DNA is especially crucial for efficient mutagenesis. Further sequencing analysis showed that two PDS homologs in Populus, PtPDS1 and PtPDS2, could be knocked out simul-taneously using this system with 86.4% and 50% efficiency, respectively. These results indicated the possibility of introducing mutations in two or more endogenous genes efficiently and obtaining multi-mutant strains of Populus using this system. We have indeed generated several knockout mutants of transcription factors and structural genes in Populus, which establishes a foundation for future studies of gene function and genetic improvement of Populus.

CRISPR/Cas9; Populus; targeted mutagenesis; multiple genes; phytoene dehydrogenase (PDS)

2015-07-03;

2015-07-26

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：31300990, 31171620)和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)(編號：XDJK2014C062)資助

劉婷婷，碩士研究生，專業(yè)方向：植物遺傳與發(fā)育。E-mail: 1023417738@qq.com范迪，講師，研究方向：植物表觀遺傳。E-mail: fandi_biology@163.com劉婷婷和范迪同為第一作者。

羅克明，博士，教授，研究方向：植物分子生物學(xué)和基因工程。E-mail: kemingl@swu.edu.cn

10.16288/j.yczz.15-303

時間:2015/9/22 16:23:03

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150922.1623.003.html