白敏，李崎，邵艷姣，黃元華，李大力，馬燕琳1. 貴陽中醫(yī)學(xué)院研究生院，貴陽 55000；. 海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，海南省人類生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?57010；. 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 0041

利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建定點(diǎn)突變小鼠品系

白敏1,2，李崎2，邵艷姣3，黃元華2，李大力3，馬燕琳2
1. 貴陽中醫(yī)學(xué)院研究生院，貴陽 550002；2. 海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，海南省人類生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570102；3. 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200241

CRISPR/Cas9技術(shù)是新近發(fā)展起來的對(duì)細(xì)胞和動(dòng)物模型進(jìn)行基因編輯的重要方法。本文利用DNA雙鏈斷裂(Double-strand breaks, DSBs)引起的同源重組(Homologous recombination, HR)依賴與非依賴的修復(fù)機(jī)制，建立基于 CRISPR/Cas9核酸酶技術(shù)構(gòu)建定點(diǎn)突變小鼠品系的技術(shù)體系。針對(duì)賴氨酸特異脫甲基化酶 2b(Lysine (K)-specific demethylase 2b, Kdm2b)酶活關(guān)鍵位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因組DNA序列設(shè)計(jì)單一導(dǎo)向RNA(Single-guide RNA, sgRNA)，通過與Cas9 mRNA共顯微注射，分別得到Kdm2b基因發(fā)生移碼突變的基因失活品系及關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸缺失的酶活突變型小鼠品系。此外，利用HR介導(dǎo)的修復(fù)機(jī)理，將黃素單加氧酶 3(Flavin containing monooxygenases3, Fmo3)基因的sgRNA序列及對(duì)應(yīng)的點(diǎn)突變單鏈寡脫氧核苷(Single strand oligonucleotides, ssODN)修復(fù)模板共注射到小鼠受精卵雄原核。對(duì)F0小鼠基因測(cè)序分析顯示，成功構(gòu)建了Fmo3基因移碼突變的基因敲除和單堿基定點(diǎn)突變的基因敲入小鼠，這些突變能夠穩(wěn)定遺傳給子代。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)，通過同源重組依賴與非依賴兩種DNA損傷修復(fù)方式，成功構(gòu)建了特定位點(diǎn)突變的小鼠品系。

基因敲除；基因敲入；酶活突變；同源重組

基因修飾動(dòng)物模型是在活體動(dòng)物上開展基因功能研究、尋找合適藥物作用靶標(biāo)的重要工具[1]。小鼠因遺傳操作手段豐富，特別是成熟的胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell, ESC)打靶技術(shù)的廣泛應(yīng)用[2,3],使其成為研究基因功能和人類疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)理最理想的模式動(dòng)物。然而基于小鼠ESC同源重組的基因打靶技術(shù)操作復(fù)雜、耗時(shí)長、人力和經(jīng)濟(jì)成本高，在一定程度上影響了該技術(shù)更廣泛的應(yīng)用。近年來基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)，使基因修飾模型的構(gòu)建擺脫了ESC的限制，為基因改造提供了方便、快捷、有效的技術(shù)體系[4,5]。在現(xiàn)有的基因編輯技術(shù)中，一種來源于細(xì)菌的成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR)及臨近相關(guān)基因(CRISPR-associated, Cas)系統(tǒng)經(jīng)過改造后，因其操作簡便、效率高而成為最熱門的基因編輯技術(shù)，即CRISPR/Cas9技術(shù)[6～14]。與鋅指核酶(Zinc finger nucleases, ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)技術(shù)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有操作更為簡便、靶點(diǎn)選擇靈活性強(qiáng)、活性更高等優(yōu)勢(shì)。目前，使用最為廣泛的是來自細(xì)菌 S. pyogenes中的 Cas9基因及經(jīng)過改造的單向?qū)?RNA (Single-guide RNA, sgRNA)體系。Cas9是一種特殊的核酸內(nèi)切酶，能與sgRNA結(jié)合，sgRNA 3'端20個(gè)堿基通過堿基配對(duì)原則與目標(biāo)DNA配對(duì)結(jié)合，促使Cas9核酸酶對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行切割產(chǎn)生雙鏈斷裂，從而對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯[8]。對(duì)于靶點(diǎn)選擇的唯一要求是 sgRNA所識(shí)別配對(duì)序列緊緊相鄰的目標(biāo)DNA序列必需是NGG(N代表任一堿基)，該序列一般被稱為前導(dǎo)間隔相鄰基序(Protospacer adjacent motif, PAM)[15～17]。Cas9切割后產(chǎn)生的DNA雙鏈斷裂(Double-strand breaks, DSBs)在沒有同源重組模板存在的情況下會(huì)利用非同源末端連接(Non-homologous end joining, NHEJ)的方式進(jìn)行修復(fù)。由于NHEJ沒有修復(fù)模板，非常容易出錯(cuò)，造成堿基的確失、插入或者替換，從而使目標(biāo)DNA發(fā)生突變。如果缺失或者插入的堿基數(shù)目為 3的非整倍數(shù)，則會(huì)改變基因的編碼框而導(dǎo)致基因的失活；如果缺失為 3的倍數(shù)則造成部分氨基酸的缺失。在有同源重組模板的情況下，DSBs則可能通過高保真的同源重組(Homologous recombination, HR)修復(fù)方式，將模板DNA序列精確插入到目標(biāo)DNA序列中。NHEJ的發(fā)生率非常高，而HR的修復(fù)方式發(fā)生概率較低。Cas9在小鼠和大鼠胚胎中具有很高的活性，已有文獻(xiàn)證明利用這兩種方法都能對(duì)特定基因進(jìn)行編輯[18～20]。但如何快速構(gòu)建特定位點(diǎn)突變的酶活缺失型小鼠品系卻鮮有報(bào)道。

Kdm2b是包含JmjC結(jié)構(gòu)域的組蛋白脫甲基化酶，其酶活性需要二價(jià)鐵離子(Fe2+)和α-酮戊二酸為輔助因子，通過羥基化作用使組蛋白賴氨酸脫甲基[21,22]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明該類脫甲基化酶JmjC結(jié)構(gòu)域中3個(gè)氨基酸為鐵離子結(jié)合所必需，這些氨基酸的突變或者缺失導(dǎo)致其失去酶活性。魚腥味綜合征(Fish odor syndrome)是一種人類遺傳疾病，主要由FMO3基因突變使代謝三甲胺的酶功能喪失或者降低導(dǎo)致三甲胺不能排泄出體外，從而體液與氣息含有魚腥味[23]。人類 FMO3基因第 8外顯子編碼 470位氨基酸的CAG密碼子出現(xiàn)無義突變成為TAG而導(dǎo)致Fmo3功能喪失是魚腥味綜合征的常見突變[23]。本研究使用CRISPR/Cas9技術(shù)，利用NHEJ和HR兩種DNA損傷修復(fù)方式，成功地構(gòu)建了Kdm2b基因敲除、酶活突變的小鼠品系以及模擬人類FMO3基因突變的小鼠品系，為動(dòng)物模型構(gòu)建提供了新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的小鼠均為C57BL/6J品系，來源于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。小鼠飼養(yǎng)于華東師范大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，恒溫恒濕，12 h光照，12 h黑暗，自由采食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合華東師范大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定并被授權(quán)。

1.2 方法

1.2.1 RNA體外轉(zhuǎn)錄

含有SP6啟動(dòng)子的Cas9表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)NotⅠ限制性內(nèi)切酶酶切線性化，經(jīng)酚/氯仿抽提純化后，溶于無RNase A 的水中，經(jīng)mMESSAGE mMACHINE?SP6(Life Technologies公司)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，通過氯化鋰沉淀，純化得到Cas9 mRNA。利用本課題組已發(fā)表的方法[24]構(gòu)建 sgRNA(靶點(diǎn)序列：Kdm2b，5'-GAACTTCCACATTGACTTTGG-3'；Fmo3，5'-GGGCCTACCAGCCGGAAC-3')模板，通過酚/氯仿抽提和乙醇沉淀進(jìn)行純化，使用 T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，并通過酚/氯仿抽提和異丙醇沉淀得到sgRNA。Cas9 mRNA及sgRNA沉淀均用20 μL TE緩沖液重懸。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量后測(cè)濃度，分裝儲(chǔ)存于-80℃。具體實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[24]。

1.2.2 小鼠受精卵顯微注射

將體外轉(zhuǎn)錄所得的靶向Kdm2b基因的sgRNA與Cas9 mRNA混合，用TE緩沖液稀釋，使sgRNA與Cas9 mRNA終濃度分別為12.5 ng/μL和25 ng/μL。使用顯微注射儀將其注射到C57 BL/6J小鼠單細(xì)胞受精卵的胞漿中。Fmo3點(diǎn)突變小鼠構(gòu)建與之類似，在注射液中加入10 ng/μL ssODN(5'-AGCCCCTACTAGTTCCGGCTGGTAGGCCCAGGAAAGTGGTCAGGAGCCCGGAACGCCATCCTA-3')作為修復(fù)模板，與Cas9/sgRNA共注射于C57 BL/6J小鼠受精卵的原核中。胚胎體外培養(yǎng) 1～2 h后移植入假孕母鼠的輸卵管。代孕鼠傷口縫合后飼養(yǎng)待產(chǎn)。

1.2.3 小鼠基因型鑒定

小鼠出生1周后，剪取腳趾或尾尖，置于1.5 mL EP管內(nèi)。加入500 μL裂解液和1 μL的蛋白酶K貯存液。將上述EP管置于55℃恒溫水浴鍋水浴過夜，或待腳趾消化完全，用酚/氯仿法抽提基因組DNA。以小鼠基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增sgRNA靶向位點(diǎn)兩側(cè)各約200 bp的序列。引物序列如下：

Kdm2b：KF，5'-GTGCTGTCTGTGAGCGTCTG- 3'，KR, 5'-ACAACCACCCATAATGAGAT-3'；Fmo3：FF, 5'-AGGGCAATGTAGTAAAGCAG-3'，F(xiàn)R, 5'-GAGCAAACGGGAATAGAAGT-3'。

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、變性、緩慢退火，加入 T7核酸內(nèi)切酶I (T7 endonuclease I, T7EⅠ)(New England Biolabs)，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。將T7EⅠ酶切檢測(cè)陽性小鼠的PCR產(chǎn)物分別連入pMD18-T載體，挑取若干克隆提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 Kdm2b基因敲除及酶活突變小鼠的構(gòu)建

根據(jù)NHEJ修復(fù)原理，本文針對(duì)組蛋白脫甲基化酶Kdm2b基因的鐵離子結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域設(shè)計(jì)sgRNA靶點(diǎn)(圖1A)。將經(jīng)顯微注射的106個(gè)胚胎分別移植到5只假孕小鼠中，共有24只F0代小鼠出生。利用引物KF和KR，以小鼠基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增 (圖1B)，同時(shí)通過T7EⅠ酶切檢測(cè)產(chǎn)生基因突變的小鼠(圖1C)。從圖1中可以看出，24只小鼠中有12只除了野生型條帶外還出現(xiàn)了一條新的條帶(箭頭所示)，表明突變效率為 50%。根據(jù) T7EⅠ檢測(cè)結(jié)果，選取陽性小鼠(1#、11#、21#、22#)的PCR產(chǎn)物連接T載體并測(cè)序，其中1#小鼠在鐵離子結(jié)合位點(diǎn)出現(xiàn)缺失12 bp和17 bp兩種等位基因突變(圖1D)。缺失17 bp將導(dǎo)致Kdm2b基因后續(xù)蛋白質(zhì)產(chǎn)生移碼突變導(dǎo)致基因失活。缺失12 bp的突變使鐵離子結(jié)合位點(diǎn)缺失4個(gè)氨基酸(分別是H、I、D、F)，雖然沒有造成移碼但突變的Kdm2b蛋白失去脫甲基化酶活性。21#和22# F0代小鼠雖然也包含12 bp的堿基缺失，但考慮到在鐵離子結(jié)合位點(diǎn)只缺失了 1個(gè)氨基酸，推測(cè)可能對(duì)酶活造成的影響不大，因此在實(shí)驗(yàn)中選取1#小鼠進(jìn)行傳代。將1#小鼠與野生型小鼠進(jìn)行交配，得到 F1代小鼠后對(duì)其進(jìn)行 PCR擴(kuò)增和測(cè)序(圖1E)。其中7#和8#小鼠為酶活突變小鼠，其余7只小鼠為缺失17 bp的基因敲除小鼠(圖1E)。以上研究表明，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過一次注射成功地構(gòu)建了Kdm2b基因酶活突變和基因敲除的兩種基因修飾小鼠品系。

圖1 Kdm2B基因突變小鼠構(gòu)建

2.2 Fmo3基因定點(diǎn)敲入小鼠品系的構(gòu)建

為構(gòu)建魚腥味綜合征小鼠模型，本文將靶向小鼠Fmo3基因第8外顯子的sgRNA及99 bp的ssODN作為同源修復(fù)的模板序列在對(duì)應(yīng)位點(diǎn)引入C>T的突變，使密碼子CAG突變?yōu)榻K止密碼子TAG(圖2A)。顯微注射后存活的 65個(gè)胚胎移植到 3只假孕小鼠中，共有9只F0代小鼠出生。對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的基因組片段經(jīng)FF、FR引物PCR擴(kuò)增后測(cè)序，結(jié)果顯示9只小鼠中有 6只發(fā)生了突變，突變效率為 66.7%(圖 2B)。其中 2#小鼠雖然整合了特定突變，但是在靶點(diǎn)附近出現(xiàn)了6 bp的缺失(圖2B)，因此不是所需定點(diǎn)敲入小鼠。3#小鼠特定位點(diǎn)的C被置換為T而出現(xiàn)了預(yù)期的新的TAG終止密碼子(圖2：B、C)，該突變將造成 Fmo3基因的轉(zhuǎn)錄提前終止，能較好地模擬人類魚腥味綜合征的一個(gè)突變類型。其余 4只小鼠產(chǎn)生了 NHEJ介導(dǎo)的基因敲除但沒有發(fā)生特定位點(diǎn)的同源重組。將3#小鼠與野生型小鼠交配，得到F1代小鼠，通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)C>T的點(diǎn)突變能夠高效地傳遞到子代，意味著 Fmo3點(diǎn)突變小鼠建系成功(圖 2D)。本研究利用單鏈寡核苷酸可介導(dǎo)基因發(fā)生精確的同源重組，成功構(gòu)建 Fmo3基因定點(diǎn)敲入小鼠品系。

圖2 Fmo3基因點(diǎn)突變(CAG>TAG, Q470X)小鼠構(gòu)建

3 討 論

基因敲除技術(shù)作為一種重要基因工程手段在研究基因功能方面發(fā)揮著重要作用。19世紀(jì)80年代，Thompson等[23]首次建立了基于ES細(xì)胞自發(fā)同源重組的基因打靶技術(shù)，成功地構(gòu)建了基因敲除小鼠模型?；贓S細(xì)胞基因打靶技術(shù)成為一種強(qiáng)有力的哺乳動(dòng)物精確遺傳修飾技術(shù)，極大地推動(dòng)了基礎(chǔ)研究的發(fā)展[25]。然而,目前,還有許多哺乳動(dòng)物的 ESC培養(yǎng)體系沒有建立，極大地限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

近年興起的以ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas[26～31]技術(shù)為代表的基因編輯技術(shù)在動(dòng)植物基因改造方面展現(xiàn)出了巨大的潛力，得到了廣泛的應(yīng)用。由于基因編輯技術(shù)幾乎在任何細(xì)胞中都有活性，擺脫了細(xì)胞類型的限制，使其應(yīng)用更廣、更靈活。與ES細(xì)胞打靶技術(shù)不同的是，基因編輯技術(shù)可利用 NHEJ和HDR兩種修復(fù)方式對(duì)目的基因組DNA進(jìn)行操作。NHEJ方式具有隨機(jī)性，所以可以看到F0代陽性小鼠的基因型多種多樣，具有一定的不可控性(圖1D、圖 2B)。本研究利用這種不可控性實(shí)現(xiàn)了一次注射同時(shí)得到Kdm2b移碼突變的基因敲除小鼠和甲基轉(zhuǎn)移酶酶活突變的小鼠，對(duì)于在動(dòng)物體內(nèi)研究該基因功能,特別是酶活性功能具有重要意義。雖然 NHEJ修復(fù)方式有一定的概率得到 3的整倍數(shù)堿基缺失的個(gè)體，但畢竟不是精確突變，具有很大的局限性。因此本研究利用ssODN作為修復(fù)模板進(jìn)行了精確突變的嘗試，并成功獲得了模擬人類突變的 Fmo3基因突變小鼠。雖然 ssODN作為修復(fù)模板相對(duì)雙鏈DNA模板具有更高的修復(fù)效率[31]，但是本文也發(fā)現(xiàn)ssODN作為模板修復(fù)的精確度不能達(dá)到 100%。例如，F(xiàn)mo3點(diǎn)突變F0代2#小鼠，雖然引入了所需的C>T突變，但同時(shí)也出現(xiàn)了意料之外的6個(gè)堿基的缺失(圖2B)?？傊瑂sODN介導(dǎo)的正確修復(fù)效率還不到 10%。如何發(fā)展 CRISPR/Cas技術(shù)實(shí)現(xiàn)高效、精確的基因組編輯是今后相關(guān)研究的重要方向。

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(責(zé)任編委: 張博)

Generation of site-specific mutant mice using the CRISPR/Cas9 system

Min Bai1,2, Qi Li2, Yanjiao Shao3, Yuanhua Huang2, Dali Li3, Yanlin Ma2
1. Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China; 2. Hainan Provincial Key Laboratory for Human Reproductive Medicine and Genetic Research, Hainan Reproductive Medical Center, the Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570102, China;3. Shanghai Key Laboratory of Regulatory Biology, Institute of Biomedical Sciences and School of Life Sciences, East China Normal University, Shanghai 200241, China

The CRISPR/Cas9 system is a recently developed important technology for genome editing in cellular and animal models. Here we established a CRISPR/Cas9-based system of generating site-specific mutant mice using DNA double-strand breaks (DSBs) induced homologous recombination (HR)-dependent or independent repair me-chanism. Through co-microinjection of Cas9 mRNA and single-guide RNA (sgRNA) targeting genomic DNA sequence corresponding to enzyme activity of lysine (K)-specific demethylase 2b (Kdm2b), both a frame-shifted Kdm2b null mutant and a Kdm2b enzyme activity disrupted mouse strain were obtained simultaneously. Moreover, sgRNA targeting flavin containing monooxygenases3 (Fmo3) gene and the corresponding single strand oligonucleotides (ssODN) donor template with point mutation were co-injected into the male pronucleus of one-cell mouse embryos stimulated HR-mediated repair mechanism. Genomic sequence analysis of F0mice showed that frame-shifted Fmo3 knockout mouse and site-specific Fmo3 knock-in mouse with single base substitution were successfully generated, and these mutations could be stably transmitted to the next generation. Therefore, we successfully generated mouse strains containing site-specific mutations through HR-dependent and -independent DSB repair using the CRISPR/Cas9 system.

knockout; knock-in; enzyme activity mutant; homologous recombination

2015-03-26;

2015-07-21

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(973項(xiàng)目)(編號(hào)：2012CB966502)，國家國際科技合作專項(xiàng)(編號(hào)：2014DFA30180)，國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81060175，30860103，81460034，81260032，81060016，31140021)，海南省重大科技項(xiàng)目(編號(hào)：ZDZX2013003)，海南省國際科技合作專項(xiàng)(編號(hào)：GJXM20100004，GJXM201106，KJHZ2014-11)，人力資源和社會(huì)保障部2011年度留學(xué)人員科技活動(dòng)擇優(yōu)資助項(xiàng)目和教育部歸國留學(xué)人員啟動(dòng)基金項(xiàng)目資助

白敏，碩士研究生，專業(yè)方向：生殖醫(yī)學(xué)。Tel: 0898-66776091；E-mail: whizzard@163.com

馬燕琳，博士，副教授，研究方向：生殖醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)。E-mail: mayanlinma@hotmail.com

李大力，博士，研究員，研究方向：發(fā)育生物學(xué)。E-mail: dalidalili@yahoo.com

10.16288/j.yczz.15-127

時(shí)間:2015-8-12 9:06:31

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150812.0906.002.html