李晨，樓慧強(qiáng)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，北京 100193

酵母基因編輯技術(shù)：從單基因操作到基因組重建

李晨，樓慧強(qiáng)
中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，北京 100193

DNA雙鏈發(fā)生斷裂(Double strand break, DSB)時，細(xì)胞通常會采用同源重組(Homologous recombination, HR)這一主要修復(fù)方式?；谶@一原理，人們開發(fā)出多種技術(shù)引入雙鏈斷裂從而實現(xiàn)對基因組 DNA序列的靶向編輯。真核生物基因敲除或編輯最早通過在外源片段中引入雙鏈斷裂和同源臂在酵母中獲得成功。30多年來，酵母遺傳操作走過了一條從單基因單位點到多基因多位點，乃至最新的基因組合成與重建之路。本文沿著引入DNA雙鏈斷裂技術(shù)的發(fā)展與演變這一主線，對一系列基因編輯及基因組編輯技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行了簡要回顧和綜述，旨在理清基因編輯技術(shù)的發(fā)展脈絡(luò)，也為高等哺乳動物的基因編輯技術(shù)體系的建立和完善提供參考。

DNA雙鏈斷裂；基因編輯；基因組編輯；基因組合成與重建；酵母

同源重組(Homologous recombination)是指發(fā)生在具有相同或相近序列的DNA片段之間的交換，是廣泛存在于各種生命形式中的遺傳重組方式之一。除了減數(shù)分裂等過程中程序性發(fā)生的同源重組，這一機(jī)制通常被細(xì)胞用于修復(fù) DNA雙鏈斷裂(Double strand break，DSB)等極為嚴(yán)重的DNA損傷[1]。因此，通過在細(xì)胞中人為導(dǎo)入DSB即可激發(fā)該位點附近包含相同或相近DNA序列區(qū)段的同源重組。利用同源重組的序列特異性和序列交換的特性，科學(xué)家很早就建立了細(xì)胞內(nèi)基因靶向敲除、置換等各種遺傳操作技術(shù)[2]。

在所有真核生物中，最早實現(xiàn)基因敲除的是單細(xì)胞模式生物——釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)[3]。釀酒酵母具有極為高效的同源重組的特點[4]，表現(xiàn)為極高的同源重組頻率和較短的同源片段長度需求(最少只需20～40 bp)。正是這些先天優(yōu)勢促使釀酒酵母成為遺傳操作最為便利的模式系統(tǒng)。基因靶向敲除技術(shù)開創(chuàng)了反向遺傳學(xué)(Reverse genetics)。隨著越來越多物種全基因組序列的測定，反向遺傳學(xué)逐漸替代經(jīng)典的正向遺傳學(xué)(Forward genetics)而成為現(xiàn)代遺傳學(xué)的主要研究手段。這一技術(shù)很快就被拓展應(yīng)用于基因組上任意位點的各種變化，包括替換、插入、添加標(biāo)簽等。利用這些技術(shù)，在釀酒酵母中首次構(gòu)建完成了全基因組范圍內(nèi)非必需基因的單敲除文庫(單倍體細(xì)胞)、覆蓋全部基因的單敲除文庫(雙倍體細(xì)胞)以及每個開放閱讀框(Open reading frame, ORF)3′端添加GFP標(biāo)簽的菌株文庫[5, 6]。這些寶貴的資源給全世界酵母遺傳學(xué)研究者帶來了極大的便利，推動了功能基因組學(xué)、化學(xué)基因組學(xué)、相互作用組學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)等多門新學(xué)科的誕生和迅猛發(fā)展[6]。

正是源于功能基因組學(xué)時代對多基因功能研究和多基因操作的需求，基因編輯技術(shù)朝著以下趨勢快速發(fā)展改進(jìn)：從單基因向多基因；從純手工向機(jī)器自動化；從低通量向高通量；從小規(guī)模向大規(guī)模等。本文以長期在遺傳操作技術(shù)上領(lǐng)銜的模式系統(tǒng)酵母為例對基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程和趨勢進(jìn)行了簡要綜述。

1 外源片段中引入DSB

1.1 單一位點編輯

第一代基因編輯技術(shù)的原理如圖 1所示。首先選擇擬敲除基因的上下游約 500～1000 bp片段為同源臂，將同源臂克隆到攜帶篩選標(biāo)記基因的質(zhì)粒載體中。敲除載體構(gòu)建完成后，選擇合適的限制性內(nèi)切酶切割引入雙鏈斷裂。將線性化的DNA片段通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞。轉(zhuǎn)入細(xì)胞的外源DNA片段被細(xì)胞內(nèi)DSB識別因子識別，啟動修復(fù)機(jī)制，將攜帶有篩選標(biāo)記的外源片段通過同源序列之間的交換整合到酵母基因組DNA。陽性轉(zhuǎn)化子可以通過篩選標(biāo)記(如營養(yǎng)缺陷和抗性等)獲得并進(jìn)一步通過菌落 PCR等技術(shù)驗證基因編輯的準(zhǔn)確性。當(dāng)受體細(xì)胞(如釀酒酵母)同源重組頻率較高，對同源臂長度要求較低，如40 bp左右的同源臂，則不必進(jìn)行載體克隆，利用一步PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化即可實現(xiàn)基因敲除。

圖1 單一位點編輯

因此根據(jù)某單一靶標(biāo)位點 DNA序列來設(shè)計外源片段兩端同源臂，并通過向外源片段中引入DSB，即實現(xiàn)單一位點的重組交換。

1.2 多位點編輯

遺傳學(xué)家們很早就認(rèn)識到細(xì)胞內(nèi)基因并不是單獨起作用，而是存在著復(fù)雜的相互作用，并且基因與基因間的相互作用在細(xì)胞的各項生物學(xué)過程中都起著極為關(guān)鍵的作用。因此，人們已經(jīng)越來越不滿足于對單個基因的遺傳分析。

在對單一位點編輯的基礎(chǔ)上，人們也開始將同源重組技術(shù)應(yīng)用于基因組上多位點的編輯。DNA測序技術(shù)的快速發(fā)展一方面為人們破譯了越來越多物種的基因組全序列，同時也推動了基因組修飾技術(shù)的發(fā)展。根據(jù)基因組上的多個不同位點，設(shè)計多對同源臂，并將含有 DSB的多個外源片段導(dǎo)入細(xì)胞，促進(jìn)多個外源片段與基因組之間發(fā)生多位點同源重組。下面以多重自動化基因組工程(Multiplex automated genome engineering，MAGE)為例介紹一下自動化大規(guī)模遺傳操作技術(shù)的發(fā)展。在多重自動化基因工程技術(shù)中，多個外源片段在λ同源重組系統(tǒng)Beta蛋白介導(dǎo)下，隨DNA復(fù)制整合到細(xì)菌或酵母基因組上。2009年，哈佛醫(yī)學(xué)院著名遺傳學(xué)家George Church領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊在Nature雜志上發(fā)表了這個在基因組編輯上取得重大突破的方法[7]。這種寡核苷酸片段介導(dǎo)的等位基因替換(Oligo-mediated allelic replacement)能夠以很高的效率在基因組上引入一系列遺傳修飾。在眾多含有變異序列的寡核苷酸片段的混合物中，與靶序列具有較高同源性的寡核苷酸片段能夠以更高的效率與染色體 DNA發(fā)生同源重組而整合進(jìn)入染色體DNA。這一過程可以伴隨新一輪的細(xì)胞分裂循環(huán)進(jìn)行，即只要存在含有變異的外源片段，置換重組就可以持續(xù)進(jìn)行(圖2)。MAGE方法的這一特點使得人們能夠快速實現(xiàn)基因組的多樣化改造?？傮w看來，MAGE方法具有高效率、低成本的優(yōu)勢，而且還能夠同時對基因組上多個位點進(jìn)行自動的多種不同的修飾，實現(xiàn)全基因組水平的序列多樣性[7]。對于寡核苷酸片段，可以通過對序列原本存在的DNA片段進(jìn)行酶切或PCR操作來獲得，也可以引入人為設(shè)計合成的DNA片段，進(jìn)一步加大遺傳多樣性。

MAGE方法除了能夠?qū)蚪M進(jìn)行編輯以獲得更多的新基因型外，也能夠進(jìn)行基因組的從頭合成(de novo genome synthesis)。片段兩兩之間存在同源臂，可通過同源重組的方式完成超大片段甚至完整染色體的組裝(圖3)。因為序列變異可伴隨著每一次細(xì)胞分裂被循環(huán)引入和積累，MAGE方法也被看做一個加速進(jìn)化的平臺。在MAGE方法的基礎(chǔ)上，研究人員利用細(xì)菌自身帶有的接合能力促進(jìn)細(xì)胞更高效地接受外源基因。這種改進(jìn)后的方法稱為接合組裝基因組工程(Conjugative assembly genome engineering, CAGE)[8]。CAGE通常被應(yīng)用于工程菌株的遺傳育種和優(yōu)化。譬如將含有不同變異的菌株混合，利用細(xì)菌天然的結(jié)合生殖能力，將這些目標(biāo)變異整合到同一基因組中。該方法的優(yōu)勢是無需人工體外作用，并且可實現(xiàn)菌株之間大規(guī)模的基因組區(qū)域的轉(zhuǎn)移重組[9]。與MAGE方法聯(lián)合使用，可以顯著縮短全基因組改造所需時間。

圖2 多位點基因組編輯

圖3 多位點基因組編輯技術(shù)用于從頭合成基因組

2 在染色體DNA中引入DSB

在基因組DNA較小、同源重組效率相對較高的低等真核生物中，上文所述通過外源線性片段的形式引入DSB啟動同源重組的基因敲除技術(shù)相對容易獲得。但在多細(xì)胞生物中，隨著基因組的逐漸增大和同源重組頻率下降，獲得陽性轉(zhuǎn)化子的效率顯著降低。例如，在小鼠胚胎干細(xì)胞中的基因敲除效率大約為百萬分之一。此時，通?？梢圆捎米钄嗥渌鸇NA修復(fù)途徑如非同源末端連接(Non-homologous end joining, NHEJ)等方法人為提高同源重組效率。敲除Ku70/80等NHEJ修復(fù)方式中關(guān)鍵基因可極大提高同源重組頻率[10]，從而被廣泛用于細(xì)菌、絲狀真菌在內(nèi)的多種模式生物中。這一方法由于人為引入Ku70/80敲除背景，增加了對目標(biāo)基因遺傳分析的干擾；此外該方法也不適用于更為復(fù)雜的哺乳動物。因此，在基因組靶標(biāo)位點特異地引入DSB，大幅提高該區(qū)段的同源重組頻率成為新一代基因編輯技術(shù)的最佳策略。這一技術(shù)對于基因組極為龐大的高等哺乳動物細(xì)胞的研究尤為重要。

2.1 PCR片段介導(dǎo)的染色體斷裂(PCR-mediated chromosome splitting, PCS)

Baudin等[11]于 1993年提出了利用同源區(qū)域來實現(xiàn)PCR介導(dǎo)的基因斷裂方法。與傳統(tǒng)的染色體斷裂方法相比，PCR介導(dǎo)的斷裂方法的最大特點是無需克隆目的基因，只要具有目的基因的序列信息，即可以實現(xiàn)目標(biāo)位置的精確斷裂。PCS方法切割染色體包含了兩步PCR和一步轉(zhuǎn)化過程(圖4)。首先根據(jù)靶位點設(shè)計引物進(jìn)行第一步PCR擴(kuò)增得到左右同源臂；根據(jù)第一步PCR產(chǎn)物的部分序列設(shè)計第二步PCR的引物，通過融合PCR[12]，將待引入染色體中的中心粒序列、端粒序列(約800 bp，含有5′-(CCCCAA)6-3′)及篩選標(biāo)記序列(約400 bp)分別引入。得到含有篩選標(biāo)記融合后的兩個重組片段，分別帶有與染色體DNA靶位點部分序列匹配的同源臂；將兩個片段轉(zhuǎn)化細(xì)胞，即可利用同源重組完成對染色體DNA的剪切過程，得到具有端粒及中心粒的新染色體[13]。

在PCS方法中，維持?jǐn)嗔押螽a(chǎn)生的新染色體的穩(wěn)定性極為重要。中心粒、端粒及自主復(fù)制起始序列(Autonomously replicating sequence, ARS)是染色體的 3個必要元件，對細(xì)胞中染色體的穩(wěn)定維持具有重要的作用。每條染色體正常只含有一個中心粒序列和兩個端粒序列。經(jīng)染色體切割產(chǎn)生的新染色體，必然會缺少中心粒和端粒序列。最初的PCS方法的目的即是：為剪切后獲得的染色體添加中心粒序列和端粒序列，保證斷裂染色體的基本功能的完整性和穩(wěn)定性。

圖4 PCS方法實現(xiàn)染色體DNA的定點斷裂

2.1.1 ARS-PCS方法

最初的PCS方法主要是保證了被剪切后所得的染色體具有中心粒和端粒。盡管每條染色體通常具有多個 ARS序列，仍有可能切割得到不含有 ARS的新染色體。在沒有ARS的情況下，染色體不能正常地進(jìn)行自主復(fù)制。如將動物或植物來源的染色體片段克隆到酵母人工染色體(Yeast artificial chromosome，YAC)上時，這種情況經(jīng)常會發(fā)生。為解決這個問題，人們在 PCS方法的基礎(chǔ)上改進(jìn)出ARS-PCS方法，即在上述的PCS方法中，將H4 ARS的序列設(shè)計入第二步PCR的引物中[14]。這樣，在隨后的片段與染色體DNA發(fā)生同源重組后，可以使得原先不具有ARS的那部分染色體被加上外源的ARS元件，保證了染色體的正常復(fù)制和傳遞。

2.1.2 Cre/loxP-PCS方法

篩選標(biāo)記對于所有基因組編輯技術(shù)都是必需的為了實現(xiàn)篩選標(biāo)記的重復(fù)利用，人們將Cre/loxP位點特異性重組系統(tǒng)引入到PCS方法中。Cre/loxP位點特異性重組系統(tǒng)是條件性及時空特異性基因打靶的核心技術(shù)，通過loxP序列的定位及Cre酶的重組作用，實現(xiàn)對目標(biāo)靶位的切割。在應(yīng)用PCS方法或ARS-PCS方法時，在篩選標(biāo)記的上游和下游分別添加一個loxP序列。同時在細(xì)胞中轉(zhuǎn)入可誘導(dǎo)的GAL1啟動子控制的 Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒。這樣在完成陽性克隆的篩選后，啟動 Cre酶表達(dá)，即可去除該篩選標(biāo)記，進(jìn)而實現(xiàn)篩選標(biāo)記的重復(fù)利用[14]?；谕瑯拥脑?，Cre/loxP也可實現(xiàn)基因組上任何片段的刪除，可以通過融合 PCR在欲敲除片段兩端加入loxP序列，在Cre酶的作用下完成靶序列的刪除。

2.2 PI-Sce I方法

歸巢核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)也可以幫助人們實現(xiàn)條件性的染色體斷裂。PI-Sce I酶為一種較常用的歸巢核酸內(nèi)切酶，其識別序列較長，且在天然的酵母基因組中并不存在，因此，這種識別位點獨特性及專一性使得其易于控制。另外，編碼該酶的基因表達(dá)是受MET3啟動子的調(diào)控的，這就使得此技術(shù)更加適用于條件性、時空特異性的染色體剪切。通過特定的啟動子在合適的時間調(diào)節(jié)酶切作用，防止斷裂染色體產(chǎn)生的時間不同而造成錯開和丟失[15]。而在利用PI-Sce I酶進(jìn)行切割后，被切割后殘留的酶識別序列可能會干擾細(xì)胞中的端粒反應(yīng)，或是被細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)機(jī)制認(rèn)定為DNA損傷，這是需要考慮的方面[16]。總體看來，基因組重排方法在菌種改良等獲取新的適應(yīng)性基因組組成中具有極大的意義，也是一種技術(shù)上的巨大進(jìn)步。

2.3 CRISPR/Cas9法產(chǎn)生染色體斷裂

在細(xì)菌或古菌中發(fā)現(xiàn)的一種 RNA指導(dǎo)的自我防御的機(jī)制為遺傳學(xué)家提供了新的有力武器，這就是CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences)及Cas蛋白系統(tǒng)(CRISPR-associated systems)[17]。該系統(tǒng)的一大優(yōu)勢是利用單向?qū)NA (Single- guide RNA, sgRNA)引導(dǎo)新型核酸內(nèi)切酶[18]，大幅提高了切割位點的特異性。這一優(yōu)勢對于龐大的高等哺乳動物基因組編輯尤為重要。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是目前應(yīng)用較多的條件性基因打靶系統(tǒng)，其優(yōu)點在于簡單高效，且無需使用篩選標(biāo)記。在釀酒酵母體系中，DiCarlo等[19]首先證明了利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的單基因敲除或敲入的高效性，其中用雙鏈寡核苷酸片段實現(xiàn)了依賴同源重組的DSB的修復(fù)(圖5)。Jako?iūnas等[20]成功地利用多CRISPR/Cas9系統(tǒng)在一步轉(zhuǎn)化中同時完成了酵母基因組 5個位點的編輯。在后來的研究中，人們也逐漸地將這個系統(tǒng)應(yīng)用到高通量的功能基因組學(xué)研究中[21]。對于復(fù)雜的高等哺乳動物來說，基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)更是革命性的突破，開啟了包括人類在內(nèi)動物遺傳學(xué)研究和應(yīng)用的新紀(jì)元。

如上介紹的這些染色體 DNA剪切技術(shù)獲得斷裂的染色體后，可用于進(jìn)行構(gòu)建新的染色體、基因刪除或大規(guī)模重排(圖6)，也可以與其他的技術(shù)結(jié)合應(yīng)用達(dá)到不同基因編輯目的。

2.4 染色體重排技術(shù)

圖5 借助CRISPR/Cas9系統(tǒng)向基因組中引入DSB

圖6 斷裂染色體的多種用途

釀酒酵母的許多表型均是由多基因控制的，尤其是那些在工業(yè)應(yīng)用上有用途的性狀，如乙醇耐受性、高溫耐受性等。傳統(tǒng)思路是對這些性狀相關(guān)的基因進(jìn)行逐個分析，現(xiàn)在可以采用基因組層面的方法來分析這些數(shù)量性狀遺傳，進(jìn)而篩選出對不同環(huán)境具有較好適應(yīng)性的經(jīng)過“重排”的新的基因型。由此，在染色體切割技術(shù)的基礎(chǔ)上，人們開創(chuàng)了染色體重排技術(shù)(Chromosome shuffling)。

染色體重排技術(shù)是為了實現(xiàn)將某一菌株的特定染色體片段用另一個菌株上的對應(yīng)的區(qū)域來替換，探索亞染色體水平上的基因型-表型之間的關(guān)系。這個方法應(yīng)用在酵母體系中時，主要是通過酵母的 a交配型及 α交配型之間的雜交來完成的。首先來自a型酵母的染色體和來自 α型酵母的染色體在相同的位置被剪切開，產(chǎn)生攜帶有不同篩選標(biāo)記的斷裂染色體；將兩種交配型酵母進(jìn)行雜交，得到的二倍體在完全培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)后，剪切產(chǎn)生的部分微型染色體可能會丟失。這些細(xì)胞變成了半合子狀態(tài)(Hemizygote)，其丟失的那段染色體可能會被來自另一種類型的細(xì)胞的等位片段填補(bǔ)上，從而實現(xiàn)了等位序列的替換。該技術(shù)側(cè)重于研究由一個選定的染色體片段區(qū)的替換或半合子的形成而引起的表型的改變，在實驗室中或工業(yè)生產(chǎn)中均具有一定的應(yīng)用價值。

2.5 基因組重建技術(shù)

在上述染色體重排技術(shù)中，為了研究某一片段或某幾個片段的作用，對染色體DNA進(jìn)行一處或幾處的替換等編輯。如果對全基因組范圍內(nèi)的所有染色體在多個位點引入DSB，誘導(dǎo)其進(jìn)行全基因組范圍內(nèi)的較多片段的替換或重排，即可實現(xiàn)基因組的重新排列，用于大規(guī)模地研究全基因組范圍內(nèi)的基因功能[23]。這種排列是隨機(jī)的，可以創(chuàng)造多種不同的酵母基因組。1994年，Stemmer等[24]首先提出DNA重排技術(shù)(DNA shuffling)[24]。該技術(shù)起初在一定程度上借助了生物體自然進(jìn)化過程中減數(shù)分裂期等位基因之間的DNA片段交換的模型。而后，1998年，為了研究生物體中控制性狀的多基因之間的關(guān)系及作用情況，Stemmer等[25]又進(jìn)一步提出了基因組重建技術(shù)(Genome reconstitution)。目前，這種技術(shù)主要應(yīng)用在細(xì)菌和酵母體系中。通過上述染色體斷裂技術(shù)，將基因組DNA斷裂成多條微型染色體。這些斷裂的染色體大片段可能以新的順序排列組合，也可能以微型染色體的形式單獨存在。在選擇性培養(yǎng)基上生長時，微型染色體會有不同程度的丟失和重新組合比例，在一定的程度范圍內(nèi)可以增加隨機(jī)得到不同結(jié)構(gòu)的新基因組組成的多樣性。這種方法可以快速地獲得新型基因組。獲得種類眾多的基因型組成后，用不同的選擇壓力去篩選適應(yīng)不同的環(huán)境條件的基因組組成。經(jīng)過不同培養(yǎng)條件的篩選，可以得到若干種正向突變菌株，而這些正向突變的菌株再次雜交或減數(shù)分裂，可以進(jìn)一步地篩選出某特定性狀被增強(qiáng)的菌株[26]。這種方法有效地提高了菌株間基因組的重組幾率，可以有效地縮短育種周期，較為迅速地獲得優(yōu)良突變菌株，在很大程度上彌補(bǔ)了經(jīng)典誘變方法的缺陷。

表1 不同基因及基因組編輯技術(shù)的特點

3 基因及基因組編輯技術(shù)的意義

基因及基因組編輯技術(shù)實際上是以人工方式來促進(jìn)釀酒酵母等物種基因組的進(jìn)化[6]，加速了適應(yīng)環(huán)境的基因型的產(chǎn)生。這種人工進(jìn)化的方式在實驗室中及工業(yè)上均有極大的促進(jìn)作用[27]。譬如在工程菌株的育種和優(yōu)化，獲得在較酸性環(huán)境下仍能快速生長的乳酸高產(chǎn)菌株；培育多重抗性乙醇酵母，提高發(fā)酵性能等。

表1匯總了本文介紹的這幾種不同的基因及基因組編輯技術(shù)。這些技術(shù)的發(fā)展及改進(jìn)對基因功能研究及工業(yè)上的菌種培育具有極大的意義。目前在基因組層面進(jìn)行多位點大規(guī)模操作的技術(shù)，如基因組重排技術(shù)，只能在釀酒酵母等少數(shù)遺傳操作體系非常成熟的單細(xì)胞微生物中得以實現(xiàn)。而在高等生物中，受到基因組的高度復(fù)雜性及靶標(biāo)特異性的限制，靶向基因敲除技術(shù)直到近幾年受益于CRSPR/Cas技術(shù)才得以快速發(fā)展[28]。全基因組范圍的功能基因組學(xué)發(fā)軔于釀酒酵母[23]。但在大約15年之后的今天，基于 CRSPR/Cas9技術(shù)的功能基因組學(xué)研究就擴(kuò)展到了包括人類細(xì)胞在內(nèi)的高等哺乳動物[21]。我們完全有理由相信，基因及基因組編輯技術(shù)還將不斷創(chuàng)造新的技術(shù)革命，引領(lǐng)21世紀(jì)生命科學(xué)的發(fā)展。

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(責(zé)任編委: 劉鋼)

From gene editing to genome reconstitution: evolving techniques in yeast

Chen Li, Huiqiang Lou
State Key Laboratory of Agro-Biotechnology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, Beijing 100193, China

Homologous recombination is one of the main repair pathways in response to DNA double strand break (DSB) in eukaryotes. Based on this, a series of techniques to introduce DSB have been developed in order to edit the DNA sequence of genome. In eukaryotes, the gene editing technique was first established in S. cerevisiae by transformation of a foreign DNA fragment containing the sequence homologous to the targeted site more than thirty years ago. The core of all currently available editing methods lies in the introduction of DSB. Here, we try to convey a historic view of various editing techniques from its original version to the up-to-dated genome synthesis and reconstitution. We believe that this review will help to illustrate the trend of the development of genome editing techniques, which will provide a valuable reference for developing similar techniques in mammals.

DNA double strand break; gene editing; genome editing; genome synthesis/reconstitution; yeast

2015-06-09;

2015-07-24

國家自然科學(xué)基金項目(編號：31271331)和國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目(編號：201410019015)資助

李晨，本科生，iGEM(International Genetically Engineered Machine Competition)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)團(tuán)隊隊長。E-mail: li2006chen@126.com

樓慧強(qiáng)，博士，教授，研究方向：酵母分子遺傳學(xué)。E-mail: lou@cau.edu.cn

10.16288/j.yczz.15-274

時間:2015-8-7 15:18:39

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150807.1518.006.html